实时荧光定量PCR法检测人骨肉瘤耐MTX细胞系中RFC、DHFR、GST-π的mRNA表达

[目的]研究RFC(还原叶酸载体)、GST-π(谷胱甘肽S转移酶π)、DHFR(二氢叶酸还原酶) mRNA在人骨肉瘤U2-OS细胞系及人骨肉瘤耐药细胞系U2-OS/R1-R3中的表达差异,并探讨其在人骨肉瘤MTX化疗耐药中的意义.[方法]采用冲击并逐步增加诱导药物浓度诱导的方法,诱导人骨肉瘤细胞系U2-OS,并建立耐MTX细胞系(U2-OS/R1-R3),利用荧光定量PCR技术在mRNA 水平检测RFC、GST-π、DHFR在U2-OS及(U2-OS/R1-R3)中的表达.[结果]本试验成功建立三株人骨肉瘤耐药细胞系U2-OS/R1-R3中,荧光定量PCR结果显示MTX耐药与DHFRmRNA表达增加有关,与RFCmRNA的表达降低有关,与 GST-πmRNA的表达增加有关.[结论]本试验在基因水平探讨人骨肉瘤细胞MTX化疗耐药机制, DHFR、GST-π基因表达的增加及RFC基因表达的降低参与了人骨肉瘤细胞的MTX耐药,为临床探索骨肉瘤患者的MTX耐药机制提供了重要的依据,为临床筛选MTX化疗不敏感患者提供重要的依据.     

p14ARF增强顺铂诱导的骨肉瘤U20S细胞凋亡的研究

目的探讨p14ARF对顺铂诱导骨肉瘤U2OS细胞凋亡的影响及其机制,为提高骨肉瘤化疗敏感性提供依据。方法在不表达p14ARF的U2OS细胞中稳定转染pcDNA3.1-p14ARF质粒,构建稳定表达株;采用RT-PCR和Western blot法鉴定其表达;台盼蓝拒染法测定生长抑制作用;Hoechst33258荧光染色检测凋亡;Western blot法检测Caspase-3,9和PARP的表达和活化。结果 mRNA和蛋白水平,U2OS和U2OS-vec细胞未见p14ARF表达,U2OS-ARF细胞可见p14ARF的高表达;p14ARF单独对U2OS细胞的生长无影响,但顺铂（5μM）处理72小时后,U2OS-ARF细胞的生长抑制率明显高于U2OS和U2OS-vec细胞,相对于U2OS和U2OS-vec细胞,U2OS-ARF细胞不仅表现更为明显的凋亡形态学变化,还明显出现了Caspase-3,9和PARP的活化裂解。结论 p14ARF能够增强顺铂诱导的骨肉瘤U2OS细胞毒作用和凋亡,通过激活Caspase-PARP级联活化,提高骨肉瘤U2OS细胞对顺铂的敏感性。     

p14ARF增强顺铂诱导的骨肉瘤U2OS细胞凋亡的研究

目的探讨p14ARF对顺铂诱导骨肉瘤U2OS细胞凋亡的影响及其机制,为提高骨肉瘤化疗敏感性提供依据。方法在不表达p14ARF的U2OS细胞中稳定转染pcDNA3.1-p14ARF质粒,构建稳定表达株;采用RT-PCR和Western blot法鉴定其表达;台盼蓝拒染法测定生长抑制作用;Hoechst33258荧光染色检测凋亡;Western blot法检测Caspase-3,9和PARP的表达和活化。结果 mRNA和蛋白水平,U2OS和U2OS-vec细胞未见p14ARF表达,U2OS-ARF细胞可见p14ARF的高表达;p14ARF单独对U2OS细胞的生长无影响,但顺铂(5μM)处理72小时后,U2OS-ARF细胞的生长抑制率明显高于U2OS和U2OS-vec细胞,相对于U2OS和U2OS-vec细胞,U2OS-ARF细胞不仅表现更为明显的凋亡形态学变化,还明显出现了Caspase-3,9和PARP的活化裂解。结论 p14ARF能够增强顺铂诱导的骨肉瘤U2OS细胞毒作用和凋亡,通过激活Caspase-PARP级联活化,提高骨肉瘤U2OS细胞对顺铂的敏感性。     

CDK抑制剂NSC649890联合顺铂对人骨肉瘤细胞U2-OS的抑制作用

[目的]探讨CDK抑制剂NSC 649890联合顺铂对人骨肉瘤U2-OS细胞抑制作用及可能的机制。[方法]MTT法检测分别采用50、100、200、400、800 nmol/L的NSC 649890 2、4、6、8、10μg/ml顺铂、50 nmol的NSC649890联合2μg/ml顺铂、300nmol的NSC 649890联合6μg/ml顺铂培养48 h后细胞增殖情况,金氏q值评价联合用药效应;流式细胞仪、Western blotting检测分别采用300 nmol/L的NSC 649890、6μg/ml顺铂及二者联合培养48 h后细胞凋亡及凋亡通路相关蛋白表达情况,以上实验均以单纯U2-OS细胞作为对照组。[结果]U2-OS细胞经不同浓度顺铂、NSC 649890单独处理48 h后,细胞抑制率随两种药物浓度增加而显著升高,比较差异均有统计学意义(P<0.05)。在联合用药组中,顺铂与NSC 649890联合浓度(2μg/ml+50 nmol/L)组两药为协同作用,(6μg/ml+300nmol/L)组两药为相加作用。流式细胞仪检测显示,顺铂组、NSC 649890组及联合组细胞凋亡率显著高于对照组(P<0.05)。Western blotting检测结果显示,与对照组相比,顺铂和NSC 649890单独作用后均可下调Bcl-2蛋白、procaspase-3蛋白的表达水平及上调Bax蛋白的表达水平,差异均有统计学意义(P<0.05),而两者联合作用时效果更加显著(P<0.05)。[结论]NSC 649890能增强顺铂对人骨肉瘤U2-OS细胞的抑制作用。     

骨肉瘤化疗药物作用机制中的基因表达

DNA损伤是很多抗肿瘤药物杀伤骨肉瘤细胞作用机制的一部分,目前研究发现诱导DNA损伤的化疗药物可诱导多种基因表达.化疗药物作用后,与骨肉瘤化疗协同作用相关基因p53、Fas、p38MAPK、CKI等激活各自信号通路而促进骨肉瘤细胞凋亡;与骨肉瘤化疗药物耐药相关基因Bcl-2、c-myc、NF-κB、BRCA1等通过调节相关基因Bax、caspase-3、p53等的表达来促进骨肉瘤细胞周期阻滞、抑制凋亡,且通过调控多种基因通路来增强DNA修复因子的相互作用,促进DNA修复.骨肉瘤化疗药物作用机制中的相关基因表达与化疗疗效及耐药密切相关,是评价化疗疗效和预测耐药的指标.     

导入野生型p53基因对人胶质瘤细胞生长及化疗敏感性的影响

目的 研究野生型p53基因对人胶质瘤细胞生长及化疗敏感性的影响。方法 将载有野生型p53基因的表达质粒PC53-SN3导入U251细胞。通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测p53基因在转染细胞中的表达,用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)和流式细胞仪检测p53基因对U251细胞生长抑制及凋亡的影响以及它与顺铂联合作用后的效果。结果 通过RT-PCR证实了野生型p53基因在U251细胞中的表达。MTT检测发现p53基因对U251细胞的生长有明显的抑制作用,抑制率为(79.60±5.69)％。顺铂对 U251细胞的抑制作用随着顺铂浓度的增加(1、2、4、8 mg/L)而增强,抑制率分别为(19.40±6.69)％、(24.41±2.68)％、(51.84±13.38)％、(66.22±5.02)％,但不如 p53基因的抑制作用强。当野生型 p53基因与顺铂联合作用于 U251细胞时,抑制率明显增加,分别为(91.64±1.00)％、(94.98±1.67)％、(95.32±2.01)％、(95.65±1.00)％。p53基因转染所产生的 U251细胞凋亡率为 17.38％。顺铂引起的细胞凋亡率随着顺铂浓度的增加(1、2、4、8mg/L)而增加,分别为5.71％、5.93％、6.27％、6.81％。当p53基因与不同浓度的顺铂(1、2、4、8mg/L)联合作用于U251细胞时,凋亡率也明显增加,分别为23.50％、23.54％、23.89％、28.88％。结论 野生型p53基因与     

H2O2诱导肝细胞凋亡时p53、bcl—2 mRNA的表达及其意义

目的 探讨H2O2诱导人类正常肝细胞系（L02细胞）凋亡时p53、bcl-2 mRNA表达的意义及丹参有效成分Rxa对其表达的影响。方法 以正常L02细胞为对照（L组）,以10μmol/L H2O2诱导L02细胞凋亡为细胞模型（LH组）,观察Rxa处理（LaH组,Rxa 2mmol/L）对p53、bcl-2 mRNA表达（原位杂交结合图像分析处理）的影响。结果 LH组2－6h p53 mRNA表达随凋亡细胞指数增高而增强,6－8h表达下降;bcl-2 mRNA表达弱。相比较LaH组各时限检测点p53 mRNA表达均低于LH组,bcl-2 mRNA表达较强（P＜0．01）。结论 Rxa可通过p53的细胞周期调控、DNA损伤修复作用和bcl-2的抗凋亡作用减轻L02细胞过氧化损伤。     

三氧化二砷对U2-OS人骨肉瘤细胞形态及细胞凋亡的影响

目的研究三氧化二砷在体外对人骨肉瘤细胞(U2-OS)形态及细胞凋亡的影响。方法以不同浓度三氧化二砷(0.5、1.0、1.5μmol/L)作用骨肉瘤细胞,15 mg/L 5-FU作为阳性对照,采用荧光显微镜观察细胞核形态及流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果各浓度的三氧化二砷对骨肉瘤细胞(U2-OS)的形态均有影响,随着三氧化二砷浓度的升高,细胞核发生固缩越明显,细胞凋亡率越高,与正常对照组相比,差异具统计学意义。结论三氧化二砷可导致骨肉瘤细胞(U2-OS)细胞核发生固缩坏死和凋亡,凋亡率与三氧化二砷浓度有依赖关系,在一定浓度范围内随浓度增高而增高。     

顺铂诱导人成骨肉瘤耐药细胞系的建立及生物学特性研究

目的：建立顺铂诱导的人成骨肉瘤多药耐药细胞系MG63／R并观察其生物学特性。方法：以顺铂为诱导剂,采用大剂量冲击与逐步增加剂量相结合的方法诱导人成骨肉瘤MG63细胞,建立多药耐药系MG63／R。MTF法检测药物敏感性：光镜、透射电镜观察MG63、MG63／R细胞形态及超微结构变化;生长曲线、克隆形成试验检测细胞增殖能力;流式细胞术检测细胞周期、凋亡指数、P—pg、bcl-2、p53蛋白表达。结果：经顺铂186d的诱导建立了MG63／R,MG63／R对顺铂的耐药指数为83．557,对阿霉素、长春新碱、氨甲蝶呤、环磷酰氨亦产生不同程度的交叉耐药;光镜观察可见MG63／R细胞排列不规则,形态呈三角形、多角形及多核现象;透射电镜显示MG63／R细胞表面突起增加,粗面内质网丰富;细胞周期分析显示细胞增殖能力明显增加而细胞凋亡明显降低;MG63／R细胞P—pg、bcl-2阳性表达较MG63细胞明显增加,p53表达则明显降低。结论：本研究建立了稳定的人成骨肉瘤多药耐药细胞系（MG63／R）,为进一步研究顺铂的多药耐药机制和耐药治疗提供了一种新的实验模犁。     

人骨髓核分化抗原对人骨肉瘤Saos-2细胞凋亡和增殖的影响

[目的]探讨人骨髓核分化抗原(MNDA)对人骨肉瘤Saos-2细胞增殖及凋亡的影响.[方法]逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法定量测定Saos-2细胞中MNDA的mRNA表达差异.将MNDA基因转染Saos-2细胞,应用MTT法测定转染后的肿瘤细胞增殖,流式细胞仪定量检测细胞凋亡程度,没有转染质粒的和转染空质粒的做为对照组.[结果] MNDA的mRNA在骨肉瘤Saos-2细胞中表达明显降低.转染MNDA后人骨肉瘤Saos-2细胞的凋亡程度高于对照组,增殖率低于对照组.[结论]转染MNDA可诱导人骨肉瘤Saos-2细胞发生凋亡,抑制骨肉瘤细胞的增殖率.