百里醌抑制人胰腺癌BxPC-3细胞体外运动和侵袭的研究

背景:胰腺癌是恶性程度最高的消化道肿瘤,目前吉西他滨依赖的化疗对抑制胰腺癌转移的治疗效果欠佳。研究发现百里醌对多种肿瘤细胞具有抑制增殖、促进凋亡的作用。目的:探讨百里醌对人胰腺癌BxP C-3细胞体外运动和侵袭的影响及其作用机制。方法:常规培养人胰腺癌细胞株BxP C-3,加入不同浓度百里醌进行处理。采用Boyden小室法检测细胞体外运动、侵袭情况;蛋白质印迹法检测细胞FAK、Akt蛋白表达和Akt磷酸化水平的改变;免疫荧光技术检测细胞内FAK表达、细胞黏着斑和F-actin的变化。结果:10、25μmol/L百里醌对BxP C-3细胞体外运动的抑制率分别为43.4%、73.8%,对体外侵袭的抑制率分别为60.5%、75.6%,百里醌呈浓度依赖性地抑制胰腺癌BxP C-3细胞的体外运动、侵袭(P0.05)。百里醌能明显下调BxP C-3细胞FAK表达,并抑制细胞磷酸化Akt的激活。百里醌可诱导FAK弥散分布于胞质,明显抑制黏着斑形成和F-actin的聚合集化。结论:百里醌通过抑制FAK/PI3K/Akt通路的信号转导和激酶活性,浓度依赖性地抑制人胰腺癌BxP C-3细胞的体外运动和侵袭。     

黏着斑激酶对血小板源性生长因子刺激的血管平滑肌细胞迁移和黏附的调控

目的探讨黏着斑激酶(FAK)信号分子在雷帕霉素抑制血小板源性生长因子(PDGF)诱导血管平滑肌细胞(VSMC)迁移、黏附中的调控作用。方法将培养的大鼠VSMC分为对照组、PDGF组、雷帕霉素+PDGF组(雷帕霉素组)和FAK反义寡核苷酸+PDGF组(FAK组)。用PDGF诱导VSMC的迁移和黏附,计数贴壁细胞;采用Boyden检测细胞迁移;采用RT-PCR、Western blot、免疫沉淀方法分别检测FAK基因、蛋白及蛋白磷酸化表达量。将FAK反义寡核苷酸经脂质体转染VSMC,观察FAK mRNA及蛋白磷酸化、细胞迁移和黏附的变化。结果与对照组比较,PDGF组明显诱导细胞迁移和黏附,上调FAK mRNA的表达,提高FAK蛋白和磷酸化FAK表达,差异有统计学意义(P0.05),与PDGF组比较,FAK组和雷帕霉素组细胞迁移、黏附能力减弱,FAK mRNA、FAK蛋白和磷酸化FAK表达水平明显降低,差异有统计学意义(P0.05)。结论 PDGF诱导细胞迁移和黏附可能是FAK介导的,雷帕霉素可能是通过抑制FAK蛋白和磷酸化FAK来抑制VSMC的迁移和黏附。     

PTEN在HepG2细胞中诱导凋亡发生及上调p53表达

目的 研究肿瘤抑制基因PTEN对HepG2细胞凋亡及p53蛋白表达的影响,并探讨相关机制。方法 将携带有野生型PTEN基因及突变型G129E-PTEN,C124A-PTEN基因的真核表达载体转染HepG2细胞,利用western印迹杂交检测PTEN表达、蛋白激酶B(PKB/Akt)和焦点粘附激酶(FAK)的磷酸化状态,以及野生型p53蛋白表达水平的变化,并应用流式细胞仪,激光共聚焦技术检测细胞周期及细胞凋亡情况。结果 与对照细胞相比,转染野生型PTEN和G129E-PTEN的HepG2细胞中磷酸化FAK(-65％,-65％)与磷酸化Akt(-93％,-35％)表达均存在不同程度的下调,而细胞凋亡率分别增加至19.8％±1.2％和9.2％±0.6％,并且p53蛋白表达上调( 120%,, 50％);然而转染C124A-PTEN的细胞中各项检测指标均无明显变化。 结论 PTEN依赖其蛋白磷酸酶活性抑制FAK的磷酸化;并主要通过脂质磷酸酶活性抑制Akt的磷酸化,并诱导HepG2细胞凋亡和p53蛋白表达上调。     

体外RNA干扰下调黏着斑激酶表达对HSC-T6细胞黏附与迁移的影响

目的 探讨特异性阻断黏着斑激酶(FAK)表达对纤维连接蛋白刺激的肝星状细胞(HSC-T6)黏附与迁移的影响.方法 构建靶向FAK的RNA干扰重组体,在阳离子聚合物介导下转染大鼠肝星状细胞系HSC-T6,筛选出可高效抑制FAK表达的重组质粒;荧光实时定量PCR和Western blot检测FAK基因敲除效果;甲苯胺蓝染色法检测细胞黏附,划痕修复实验和改良的Boyden双腔系统检测细胞迁移.多组间均数差异性比较采用单因素方差分析.结果 成功构建并筛选出可高效抑制FAK的质粒表达载体.质粒转染后,FAK mRNA和蛋白表达分别下降了76.82%和72.53%,同时,p-FAK(Tyr397)蛋白表达下降了62.71% FAK表达下调可明显抑制HSC-T6细胞黏附,抑制率约58.69%;FAK基因沉默可显著抑制纤维连接蛋白诱导的HSC迁移,使细胞迁移距离降低了58.27%,跨膜迁移细胞数减少了83.70%. 结论 RNA干扰技术可选择性下调HSC中FAK的表达,并可显著抑制HSC-T6的黏附和迁移.     

18β-GA对人高转移卵巢癌HO-8910PM细胞增殖、黏附和侵袭能力的影响

目的观察18β-甘草次酸（18β-GA）对人高转移卵巢癌HO-8910PM细胞增殖、黏附和侵袭能力及黏附斑激酶（FAK）、基质金属蛋白酶（MMP）-9表达的影响。方法将18β-GA作用于HO-8910PM细胞,采用MTT法检测HO-8910PM细胞增殖抑制率;细胞黏附试验检测细胞黏附能力;Transwell chamber法检测细胞侵袭能力;Westernblot法检测细胞FAK、MMP-9蛋白表达水平。结果 18β-GA明显抑制高转移卵巢癌细胞HO-8910PM的生长增殖、黏附和侵袭能力;Western blot法检测表明药物能下调FAK、MMP-9蛋白的表达。结论 18β-GA可抑制HO-8910PM细胞黏附、侵袭,其机制可能是通过下调FAK、MMP-9蛋白表达而进行的。     

川芎嗪对人肝癌细胞钙激活中性蛋白酶-2、黏着斑激酶及迁移侵袭能力的影响

目的探讨川芎嗪(TMP)对人肝癌细胞钙激活中性蛋白酶(Calpain)-2、黏着斑激酶(FAK)及迁移侵袭能力的影响,以了解其抑制肝癌的机制。方法将人肝癌细胞(MHCC97-H)分为对照组和TMP组,TMP组予以TMP 1.0 mg/ml干预24 h,采用Western印迹检测两组Calpain-2、FAK蛋白表达情况,划痕实验、Transwell实验检测MHCC97-H迁移、侵袭能力。结果与对照组比较,TMP组Calpain-2、FAK蛋白表达均明显下调(P0.05);其迁移率、穿膜细胞数及吸光度值均明显下降(P0.05)。结论下调肝癌细胞系(MHCC97-H)的Calpain-2、FAK水平可能是TMP抗肝癌作用机制之一。     

反义局部粘着斑激酶脱氧寡核苷酸对肝癌细胞侵袭性生长的抑制作用

目的 观察反义局部粘着斑激酶脱氧寡核苷酸(FAK ODN)转染对肝癌细胞侵袭性生长的影响,并探讨其作用机制。 方法 以LipofecTAMINE介导的反义FAK ODN转染Bel 7402肝癌细胞株,测定Bel 7402肝癌细胞株体外生长曲线、细胞活力,测定不同时间点该细胞体外黏附能力变化,以Transwell小室测定细胞的体外侵袭能力,同时行FAK表达与细胞DNA含量的双参数流式细胞仪检测及细胞凋亡的流式细胞仪检测。 结果 p125FAK表达在反义转染组(6.49％±0.10％)显著低于正义转染组(14.33％±1.88％)与对照组(16.68％±1.62％),F=7.66,P<0.01;反义FAK ODN转染显著抑制Bel 7402肝癌细胞株的生长,其细胞活力显著下降,肿瘤细胞抑制率在30％-60％之间;细胞体外黏附能力受到显著抑制,黏附抑制率在25％-55％间;细胞的体外侵袭能力显著下降,侵袭抑制率在15％-25％之间;细胞凋亡显著增加;细胞周期分析显示S期细胞比率显著降低,细胞生长主要阻滞在G2/M期。 结论 FAK在Bel 7402肝癌细胞的黏附与迁移运动中发挥重要作用,其表达阻断显著抑制肝癌细胞的体外黏附与侵袭活性。FAK表达阻断显著抑制肝癌细胞的体外增殖,促进细胞凋亡。     

纤粘连蛋白介导的平滑肌细胞粘附迁移与粘着斑激酶的磷酸化

目的　探讨纤粘连蛋白介导的血管平滑肌细胞粘附和迁移与粘着斑激酶 (focaladhesionkinase ,FAK)的磷酸化的关系。方法　不同浓度的纤粘连蛋白 (fibronectin ,FN)刺激培养的血管平滑肌细胞 (smoothmusclecells,SMCs) ,观察细胞粘附反应 ,统计铺展比率。免疫沉淀和Wsternblot分别检测FAK及FAK磷酸化的表达量。利用改良的BoydenChamber测SMCs迁移。结果　FN有效地促进了SMC粘附 ,其铺展比率、迁移细胞数均显著高于对照 (P <0 0 5 ) ,且随FN浓度递增而增加。其中 2 0、40、6 0 μg ml组分别为 (75 6± 6 5 ) %、(80 9± 5 4) %和 (82 4± 7 9) % ,无组间差异 ,但均高于 5 μg ml的 (2 0 8± 3 2 ) %和 10 μg ml组的 (32 8± 4 7) % ,各组迁移细胞数也从 16 8± 3 6 HFP 2 0 0×增加到48 9± 6 1 HFP 2 0 0×。不同浓度FN作用后均有FAK的表达 ,FN10 μg ml即可致FAK磷酸化。表明FN介导SMCs粘附和迁移时伴有显著的FAK活化。结论　FN诱导平滑肌细胞粘附和迁移可能是通过FAK介导的 ,对其活性进行调控将有助于抑制血管损伤后内膜平滑肌细胞的迁移。     

重组人结缔组织生长因子对人成骨细胞骨保护素/RANKL表达的影响

目的 研究重组人结缔组织生长因子(CTGF)对体外培养的人成骨细胞骨保护素/RANKL(receptor activator of NF-κB ligand)表达的影响,并探讨重组人CTGF调节骨保护素/RANKL表达的信号转导机制.方法 用重组人CTGF干预体外培养的人成骨细胞,采用Western印迹法检测骨保护素/RANKL蛋白表达水平的变化,同时观察重组人CTGF对人成骨细胞FAK、MAPK磷酸化的影响.结果 重组人CTGF可呈时间-剂量依赖性抑制人成骨细胞RANKL的表达,200 ng/ml重组人CTGF作用24～48 h达最大抑制效果,而对人成骨细胞骨保护素的表达无明显影响.重组人CTGF可明显增强p38MAPK磷酸化,并减少FAK磷酸化,重组人CTGF干预对ERK、JNK磷酸化无明显影响;p38MAPK阻断剂SB23058可阻断重组人CTGF对RANKL表达的抑制效应.结论 重组人CTGF通过增强p38MAPK磷酸化,减少FAK磷酸化下调人成骨细胞RANKL的表达.     

黏着斑激酶相关非激酶对肝星状细胞凋亡及细胞外信号调节激酶的影响

目的 应用黏着斑激酶相关非激酶(FRNK)表达质粒瞬时转染纤维连接蛋白(FN)预刺激的肝星状细胞(HSC),探讨FRNK对HSC凋亡及细胞外信号调节激酶(ERK)的影响.方法 在体外,以FN诱导HSC增殖,采用脂质体介导的方法用FRNK表达质粒瞬时转染HSC,应用膜联蛋白/碘化丙啶双标记流式细胞术、DNA凝胶电泳技术和透射电镜技术检测细胞的凋亡,Western blot及RT-PCR方法检测FRNK、黏着斑激酶(FAK),p FAK(Tyr397)、半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-3(caspase-3)、ERK1、p-ERK蛋白及其mRNA表达. 结果FRNK表达质粒成功转染HSC,在翻译后水平抑制FAK磷酸化.与空质粒组比较,FRNK表达质粒转染HSC48 h后,HSC凋亡率由9.28%±1.05%增至25.37%±1.92%(P<0.01),caspase-3蛋白由185.82±9.69增至264.17±12.60(P<0.01),caspase-3 mRNA由1.07±0.27增至4.19±0.48(P<0.01).FRNK抑制FAK磷酸化和在翻译和转录水平抑制ERK1、p-ERK的表达,而FN则促进FAK和ERK1,p-ERK在翻译和转录水平的表达. 结论在脂质体介导下瞬时转染FRNK表达质粒,可使外源性的FRNK在HSC内大量表达,在翻译后水平抑制FAK磷酸化;并可能通过FAK-ERK信号转导通路诱导FN刺激的HSC发生凋亡.     

A cell penetrating peptide derived from azurin inhibits angiogenesis and tumor growth by inhibiting phosphorylation of VEGFR-2, FAK and Akt

Amino acids 50-77 (p28) of azurin, a 128 aa cupredoxin isolated from Pseudomonas aeruginosa, is essentially responsible for azurin's preferential penetration of cancer cells. We now report that p28 also preferentially penetrates human umbilical vein endothelial cells (HUVEC), co-localized with caveolin-1 and VEGFR-2, and inhibits VEGF- and bFGF-induced migration, capillary tube formation and neoangiogenesis in multiple xenograft models. The antiangiogenic effect of p28 in HUVEC is associated with a dose-related non-competitive inhibition of VEGFR-2 kinase activity. However, unlike other antiangiogenic agents that inhibit the VEGFR-2 kinase, p28 decreased the downstream phosphorylation of FAK and Akt that normally precedes cellular repositioning of the cytoskeletal (F-actin), focal adhesion (FAK and paxillin), and cell to cell junction protein PECAM-1, inhibiting HUVEC motility and migration. The decrease in pFAK and pAkt levels suggests that p28 induces a pFAK-mediated loss of HUVEC motility and migration and a parallel Akt-associated reduction in cell matrix attachment and survival. This novel, direct antiangiogenic effect of p28 on endothelial cells may enhance the cell cycle inhibitory and apoptotic properties of this prototype peptide on tumor cell proliferation as it enters a Phase II clinical trial.     

Phagocyte cell migration is mediated by phospholipases PLD1 and PLD2

We have investigated whether the signaling protein phospholipase D is implicated in leukocyte cell motility. Treating differentiated HL-60 cells with small interfering RNAs (siRNAs), to deplete endogenous expression of the PLD1 isoform, led to an abolishment of basal chemokinesis that could not be rescued with chemoattractants ENA-78, FMLP, and IL-8. Transient overexpression of PLD1 increased both chemokinesis and chemotaxis toward IL-8 and FMLP but not toward ENA-78. Chemokinesis was not mediated by the enzymatic activity of PLD1, but the chemotactic response was, because a lipase-inactive mutant (PLD1-K830R) negated all chemokine-induced potentiating actions and because IL-8 and FMLP increased activity in vitro. Gene expression silencing of the other mammalian isoform, PLD2, also led to cell migration arrest, whereas ENA-78 selectively increased endogenous PLD2 activity and chemotaxis of HL-60 cells overexpressing a myc-pcDNA-PLD2 construct. Thus, PLD1 is differentially activated by CXCR-1, whereas CXCR-2 (and possibly CXCR-1) mediates PLD2 activation. Finally, immunofluorescence microscopy showed that both isoforms were associated with cell polarity and directionality concomitantly with adhesion and F-actin polymerization in response to IL-8. These data represent the first demonstration of the involvement of PLD and its enzymatic activity toward chemokines in the key physiologic process of leukocyte migration.     

体外培养前列腺癌DU145细胞侵袭和迁移能力与EF-1 alpha基因表达的关系

目的 应用RNA干扰技术研究EF-1 alpha基因在体外培养前列腺癌细胞株DU145的侵袭和迁移中的作用. 方法将DU145细胞系分为3组:对照组(未转染siRNA),转染对照组(转染siRNA)和实验组(转染EF-1 alpha-siRNA).通过免疫荧光技术验证RNA干扰结果,并研究EF-1 alpha在DU145细胞中的定位以及与F-actin的定位关系.应用Transwell实验,比较EF-1alpha蛋白质水平调节前后各组肿瘤细胞侵袭和迁移能力的变化. 结果应用RNA干扰技术可以特异高效调低DU145细胞中EF-1 alpha蛋白质水平.EF-1 alpha蛋白质定位于细胞胞浆内,且该蛋白与F-actin存在共定位关系.但EF-1 alpha表达的改变不影响F-actin的分布.细胞迁移和侵袭能力研究结果显示,20×104个DU145细胞种入Transwall小室12 h后,对照组,转染对照组和实验组穿膜细胞数日分别为(10.6±1.0)×104个、(11.2±0.8)×104个和(3.9×0.6)×104个.与对照组相比,调低EF-1 alpha表达显著降低了前列腺癌细胞株DU145迁移和侵袭能力到37.1%(t=13.9,P<0.05). 结论调低EF-1 alpha表达水平对前列腺癌细胞的迁移和侵袭能力有负面影响.EF-1 alpha基因在前列腺痛细胞局部侵袭中有重要作用.     

SphK1对结肠癌lovo细胞的增殖、迁移和凋亡的影响

目的:探讨鞘胺醇激酶1(SphK1)对结肠癌lovo细胞增殖、迁移和凋亡的影响及其作用机制.方法:培养人结肠癌lovo细胞株,实验分3组:对照组、PMA组和DMS组.PMA组加入佛波醇-12-豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA,100nmol/L),DMS组加入N,N-二甲基鞘胺醇(DMS,50μmol/L),对照组加入等量的培养基.采用MTT法和克隆形成实验检测细胞生长增殖的变化,流式细胞术检测细胞凋亡,Tranwell小室模型观察细胞迁移能力的变化,RT-PCR检测mRNA的表达,Westernblot检测蛋白的表达.结果:PMA显著促进细胞的增殖、迁移并抑制细胞的凋亡,DMS则显著抑制细胞的增殖、迁移并促进细胞的凋亡(对照组、PMA组和DMS组的细胞增殖活力:0.71±0.03vs1.05±0.05vs0.46±0.04;克隆形成率:1.32%±0.26%vs2.17%±0.17%vs0.73%±0.13%;凋亡率:16.25%vs9.15%vs32.58%;迁移细胞数:72.19±3.36vs98.46±6.25vs40.48±4.27;均P<0.05).PMA显著促进黏着斑激酶(FAK)的活性和表达,相反DMS则抑制FAK的活性和表达[对照组、PMA组和DMS组FAKmRNA的表达强度:0.151±0.008vs0.212±0.014vs0.114±0.021;蛋白:0.332±0.022vs0.374±0.029vs0.296±0.018;磷酸化FAK(p-FAKTyr397)蛋白:0.186±0.032vs0.234±0.017vs0.112±0.023;均P<0.05].结论:SphK1可促进lovo细胞的增殖和迁移能力并抑制细胞的凋亡,其机制可能是通过激活FAK通路而发挥作用.     

VASH2对脑胶质瘤血管新生的影响机制

目的 通过观察血管抑制素-2(VASH2)对脑胶质瘤微血管内皮细胞增殖、迁移和管形成的调控作用,探究其对脑胶质瘤血管新生的影响机制.方法 构建人脑胶质瘤微血管内皮细胞模型,通过稳定转染获得VASH2过表达和表达沉默的细胞系,在后续实验中分组,分别为空白对照组、VASH2过表达阴性对照空质粒组[VASH2(+)NC组]、...     

LPP expression during in vitro smooth muscle differentiation and stent-induced vascular injury

Lipoma preferred partner (LPP) has been identified as a protein highly expressed in smooth muscle (SM) tissues. The aim of the present study was to determine mechanisms that regulate LPP expression in an in vitro model of SM cell (SMC) differentiation and in stent-induced pig coronary vessel injury. All trans-retinoic acid treatment of A404 cells induced a strong increase in LPP, as well as SM alpha-actin, SM myosin heavy chain, and smoothelin mRNA levels, in a Rho kinase (ROK)-dependent manner. Adenovirus mediated overexpression of myocardin in A404 cells significantly increased LPP mRNA expression. Interestingly, inactivation of RhoA with C3-exoenzyme or treatment with ROK inhibitors strongly inhibited myocardin mRNA expression in retinoic acid-treated A404 cells or human iliac vein SMCs. LPP silencing with short interfering RNA significantly decreased SMC migration. LPP expression was also markedly decreased in focal adhesion kinase (FAK)-null cells known to have impaired migration but rescued with inducible expression of FAK. LPP expression in FAK-null fibroblasts enhanced cell spreading. In stented pig coronary vessels, LPP was expressed in the neointima of cells lacking smoothelin and showed expression patterns identical to those of SM alpha-actin. In conclusion, LPP appears to be a myocardin-, RhoA/ROK-dependent SMC differentiation marker that plays a role in regulating SMC migration.     

黏着斑激酶在结肠癌细胞中的表达及对其迁移的影响

[目的]观察局部黏着斑激酶（FAK）在结肠癌细胞中的表达及对结肠癌细胞侵袭动力和生长的影响。[方法]应用RT-PCR、Western blot方法测定结肠癌细胞株（HT-29）和正常肠上皮细胞中FAK的表达；在血小板源性生长因子（PDGF）刺激肿瘤细胞后，应用细胞黏附分析和体外侵袭试验方法，测定不同时间点细胞的体外黏附能力变化及侵袭能力，同时行FAK表达测定。[结果]结肠癌细胞较正常上皮细胞存在较高水平的FAK表达。PDGF干预组与非干预组比较，能促进HT-29的黏附功能（90．0％）和侵袭能力（54．5％），在该过程中，FAK的表达和活性升高（P〈0．05）。[结论]FAK对结肠癌细胞的体外黏附与迁移发挥重要的作用。