人Polycomb家族成员NSPc1蛋白的原核表达纯化及多克隆抗体制备

目的Polycomb家族成员NSPc1多克隆抗体的制备与检测。方法应用PCR技术扩增人NSPc1编码区全长序列并插入到pET-43.1a（＋）载体中,在大肠杆菌BL21中表达融合蛋白HIS-NSPc1。利用所表达的融合蛋白中含有的6×His标签进行亲和纯化。用所获得的纯化蛋白免疫新西兰大白兔,获得兔抗人NSPc1多克隆抗体。用Western blot检测抗体免疫反应的特异性。结果在大肠杆菌中表达并纯化了人NSPc1重组蛋白,纯度达95%,用其免疫新西兰大白兔,成功制备了相应兔源多克隆抗体,Western blot实验中该抗体可以特异识别内源及外源性NSPc1蛋白。结论原核表达的NSPc1融合蛋白可以被纯化,并具有足够的蛋白免疫原性,所制备的相应多克隆抗体具有良好的特异性,可以运用于NSPc1基因的功能研究。     

人核糖体蛋白S13的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的克隆人核糖体蛋白S13(ribosomal protein S13,RPS13)cDNA全长,构建原核表达质粒,诱导表达、纯化RPS13蛋白并制备其多克隆抗体。方法应用RT-PCR方法从胃癌多药耐药细胞SGC7901/VCR中扩增出RPS13的cDNA全长,利用DNA重组技术构建重组原核表达载体pET-28a( )-RPS13,双酶切及测序鉴定。将重组载体转化入大肠杆菌BL21中,筛选抗性克隆并经DNA测序证实。IPTG诱导融合蛋白的表达,利用镍离子亲和层析柱提纯融合蛋白,经SDS-PAGE和Western blot鉴定。用纯化的融合蛋白His-RPS13免疫BALB/c小鼠,ELISA法测定抗体效价,饱和硫酸铵沉淀法纯化抗体,Western blot检测抗体活性。结果RT-PCR扩增片段与预计目的基因片段大小一致;双酶切鉴定表明,重组表达载体pET-28a( )-RPS13构建成功,DNA测序结果显示所获基因序列与GenBank中收录完全相同。IPTG诱导3h后,经SDS-PAGE检测显示在Mr19000处出现一新生条带,与预计的融合白大小一致;利用抗His标签的抗体进行Western blot,结果证实融合蛋白表达成功。其免疫血清经Western blot证实可特异性的识别蛋白RPS13。结论成功地获得了RPS13的编码基因序列,并获得了纯化的RPS13蛋白质,为制备RPS13的单克隆抗体、进一步研究RPS13在肿瘤中的作用奠定了基础。     

人SUMO-1基因原核表达、纯化及多克隆抗体制备与鉴定

目的 构建人SUMO-1基因的原核表达载体,诱导表达重组蛋白,制备兔抗人SUMO-1抗血清.方法 从质粒pcDNA-HA-SUMO1-GG中用PCR方法克隆到编码人SUMO-1 N端97个氨基酸的基因片段,构建了SUMO-1原核表达载体pET41a(+)-SUMO1,转化大肠杆菌B121(DE3)pLysS,IPTG诱导蛋白表达并利用GST亲和层析柱进行纯化,以纯化后的融合蛋白GST-SUMO1为抗原免疫家兔,获得抗血清.Western blotting、ELISA法鉴定获得的抗血清.结果 成功构建原核表达载体,纯化到融合蛋白GST-SUMO1,用纯化的融合蛋白免疫家兔制备了多克隆抗体,Western blotting、ELISA法证实多克隆抗体制备成功.结论 成功获得了人SUMO-1多克隆抗体,为进一步研究人SUMO-1蛋白的功能奠定了基础.     

FILIP-1L 蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

目的： 表达、纯化GST-FILIP-1L融合蛋白,制备FILIP-1L多克隆抗体。方法：pGEX-4T3-FILIP-1L重组质粒转化E-coliBL21大肠杆菌,IPTG诱导GST-FILIP-1L融合蛋白表达,Glutathion Sepharse 4B纯化GST-FILIP-1L融合蛋白。将纯化的GST-FILIP-1L融合蛋白免疫新西兰大耳白兔,制备FILIP-1L多克隆抗体,用ELISA方法检测多克隆抗体效价,Western blot检测多克隆抗体与FILIP-1L蛋白、细胞转染FILIP-1L蛋白及细胞FILIP-1L蛋白的结合能力。结果：在大肠杆菌中诱导出高表达的FILIP-1L融合蛋白,经Glutathion Sepharse 4B纯化后免疫新西兰大耳白兔,获得了高效价的抗FILIP-1L多克隆抗体,亲和层析获得纯度较高的多克隆抗体,WB检测显示多克隆抗体能够与FILIP-1L蛋白、293细胞转染FILIP-1L蛋白及肝癌细胞FILIP-1L蛋白结合。结论：成功表达、纯化了GST-FILIP-1L融合蛋白,制备了高效价的抗FILIP-1L多克隆抗体,为研究FILIP-1L蛋白生物学功能提供了有用的实验工具。     

人SUMO-2基因原核表达、纯化及多克隆抗体制备

目的:构建人SUMO-2基因的原核表达载体,纯化融合蛋白GST-SUMO2-SUMO2并以其为抗原免疫家兔,制备人SUMO-2多克隆抗体.方法:用PCR的方法得到人SUMO-2基因并克隆至pET41a( )原核表达载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS诱导融合蛋白GST-SUMO2-SUMO2表达;所获得的可溶性蛋白经亲和层析纯化、SDS-PAGE电泳鉴定后,免疫家兔制备抗血清,分别采用ELISA、Western blot检测抗体效价和特异性.结果:测序证实重组质粒pET41a( )-SU-MO2-SUMO2构建成功;SDS-PAGE结果证实获得Mr为52 000的GST-SUMO2-SUMO2融合蛋白且为可溶性蛋白;经过GST亲和层析有效纯化;以该融合蛋白免疫家兔制备得到的抗血清经Western blot检测证实能与目的蛋白发生特异性结合,ELISA检测为阳性.结论:获得了人SUMO-2蛋白及特异性多克隆抗体,对进一步研究人SUMO-2及SUMO第二类家族的功能提供了有用工具.     

人CL-L1基因片段的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的 获取重组人CL-L1颈区.糖识别区纯化蛋白,制备多克隆抗体.方法 采用PCR方法扩增人CL-L1颈区.糖识别区目的 基因片段,构建原核表达载体,进行原核表达与蛋白纯化,然后免疫家兔,制备多克隆抗体.采用EIJSA检测抗体效价,免疫印迹法检测蛋白纯度和抗体的特异性.结果 成功构建了人CL-L1颈区.糖识别区原核表达载体pRSET-C/NECK-CRD△K,在E.coli BL21中表达,镍亲和层析柱纯化,得到相对分子质最19 200的融合蛋白,免疫家兔后收获抗血清,ELISA显示抗体效价为1/20 000,具有高度特异性,免疫印迹结果显示制备的多抗可以与重组人CL-L1颈区一糖识别区蛋白特异性结合.结论 本研究获得了人CL-L1颈区.糖识别区纯化蛋白,制备了人CL-L1颈区.糖识别区多克隆抗体,为cL厂L1的结构、组织表达谱和功能的研究奠定了基础.     

Nono蛋白的原核表达、纯化和多克隆抗体的制备

目的表达和纯化带多聚组氨酸(6×His)标签的Nono(non-POU-domain-containing,octamer-bindingprotein)融合蛋白并制备抗Nono多克隆抗体。方法构建pET-28a( )-Nono重组表达质粒,转入Rosetta(DE3)大肠埃希菌,以IPTG诱导6×His-Nono融合蛋白表达,经镍离子金属螯合树脂纯化后,用纯化出的蛋白免疫BALB/C小鼠制备多克隆抗体,并用ELISA检测多克隆抗体的效价,Western印迹检测多克隆抗体的特异性。结果在大肠埃希菌中诱导出高水平表达的His-Nono融合蛋白,经亲和树脂纯化后免疫小鼠,获得了高特异性的抗Nono抗血清。结论成功构建pET-28a( )-Nono原核表达质粒,表达并纯化出高纯度的目标蛋白,制备出高滴度、高特异性的多克隆抗体。     

肺炎链球菌SpxA蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的 构建肺炎链球菌SpxA蛋白的原核表达系统,制备其多克隆抗体.方法 设计引物,利用PCR技术扩增肺炎链球菌D39菌株的spxA基因,并插入表达载体pET-28a(+)内,测序鉴定.重组质粒转化至大肠埃希菌BL21(DE3)中,以IPTG诱导表达含6个组氨酸标签的SpxA重组蛋白,经Ni-NTA亲和层析柱纯化后,以其为抗原免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体.用ELISA及Western印迹方法分别检测多克隆抗体的效价及特异性.结果 从大肠埃希菌中诱导出高表达的SpxA重组蛋白,纯化后免疫小鼠获得抗血清,ELISA测定其效价可达1:2 560 000以上,Western印迹结果显示其能特异性地作用于肺炎链球菌SpxA.结论 成功构建了pET-28a(+)-spxA原核表达质粒,获得了高纯度的目的 蛋白和高滴度、高特异性的多克隆抗体.     

AAV9衣壳蛋白VP的原核表达、纯化及多克隆抗体制备

目的：表达腺相关病毒（AAV）9型衣壳蛋白VP,制备抗VP蛋白的多克隆抗体。方法：使用PCR技术从AAV9病毒包装质粒中扩增AAV9衣壳蛋白VP,同源重组法构建衣壳蛋白表达质粒pET30a-AAV9-VP。质粒转化表达菌E.coli BL21(DE3)后,IPTG诱导目的蛋白VP表达,亲和层析法纯化VP蛋白,将纯化后的蛋白免疫日本大耳白兔,3次免疫后获得针对VP蛋白的兔多克隆抗体。以Western blot和细胞免疫荧光法检测抗体的应用,ELISA检测所得抗体的效价。结果：成功构建pET30a-AAV9-VP表达质粒,在大肠杆菌BL21中,IPTG可诱导VP蛋白表达。亲和层析法纯化获得高纯度的VP蛋白。该蛋白在日本大耳兔体内能够诱导产生多克隆抗体,ELISA检测抗血清效价达到1∶512 000。结论：成功原核表达和纯化AAV9衣壳蛋白VP并制备了兔多克隆抗体。制备的抗AAV9 VP抗体能够特异性识别和结合AAV衣壳蛋白,并可有效用于Western blot和细胞免疫荧光分析,为后续深入研究AAV9在基因治疗中的作用及AAV9载体开发提供了研究基础。     

人肠道病毒71型VPO蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

目的:原核表达并纯化人肠道病毒71型(EV71)VPO蛋白,免疫豚鼠制备多克隆抗体,并鉴定其用于EV71检测的反应性和特异性.方法:PCR方法扩增VPO基因,构建原核表达质粒pET-VPO并转化大肠杆菌,诱导表达并纯化VPO重组蛋白,免疫豚鼠制备抗VPO多克隆抗体,ELISA方法检测抗VPO抗体效价,细胞免疫荧光和Western blot方法鉴定抗体特异性.结果:VPO重组蛋白在大肠杆菌BL21中高效表达,制备的抗VPO抗体效价为1:106.细胞免疫荧光及Western blot检测结果显示,抗VPO多克隆抗体可以识别原核表达及EV71感染细胞中的VPO蛋白.结论:原核表达了EV71的VPO蛋白并制备出抗VPO多克隆抗体,为EV71的临床诊断、疫苗开发和分子病毒学研究提供了新的研究工具和手段.     

果蝇硒蛋白D-SelK原核表达及多克隆抗体制备

目的:克隆编码果蝇硒蛋白D-SelK结构基因并在大肠杆菌中表达,纯化后制备兔抗D-SelK的抗体。方法:利用PCR从pGM-T-D-SelK质粒中扩增D-SelK基因,构建重组表达质粒pGEX-6p-1-D-SelK,以重组质粒转化E.coli BL21(DE3),筛选阳性重组菌株,IPTG诱导目的蛋白表达,通过变性、电泳纯化D-SelK蛋白,SDS-PAGE和Westem blot方法鉴定目的蛋白的表达;以表达的D-SelK蛋白免疫家兔,制备抗D-SelK的多克隆抗体并进行效价及特异性鉴定。结果:扩增了D-SelK基因,克隆于表达载体pGEX-6p-1中,PCR筛选和酶切鉴定获得阳性克隆,测序证实正确。经诱导在大肠杆菌中表达出目的蛋白,纯化后免疫家兔,能有效地刺激特异性抗体的产生,抗血清的效价达到1∶51 200以上,且具有良好的特异性。结论:已成功构建D-SelK基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达;制备出兔抗D-SelK抗体,效价及特异性均良好,这为进一步研究功能特异性的D-SelK提供了有效的手段。     

F10蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

目的：表达F10蛋白，并制备兔抗F10多克隆抗体。方法：利用PCR方法扩增F10基因片段，经BamHⅠ和EcoRⅠ酶切后连接人pET-GST原核表达载体，构建的pET-GST／F10融合重组表达质粒转化大肠杆菌B121，经IPTG诱导表达蛋白，并以亲和层析的方法进行纯化。表达产物用SDS—PAGE电泳和Western blot进行分析鉴定。以纯化的F10蛋白免疫新西兰大白兔，制备兔抗F10的多克隆抗体，并以ELISA法检测抗体效价。结果：经酶切和核酸序列分析证实重组质粒包含有正确编码的F10读码框。SDS—PAGE电泳分析显示pET—GST／F10诱导后表达一相对分子质量（Mr）约为61000的融合蛋白，与预期结果相符。目的蛋白纯化后的纯度达90％以上，Western blot证实该蛋白是GST／F10的融合蛋白。将纯化的GST／F10融合蛋白免疫家兔，得到的兔抗F10抗体效价达1：20000。结论：成功构建了人F10基因原核表达载体，并获得了高纯度的F10重组蛋白及兔抗F10抗体，为下一步研究F10基因功能奠定了实验基础。     

QKI蛋白的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备与鉴定

目的:获得原核表达的RNA结合蛋白QKI-7蛋白,并制备其兔抗QKI多克隆抗体。方法:将成功插入QKI-7编码区cDNA的PET32b( )原核表达载体用热休克法转化BL21(DE3)感受态细菌,以IPTG诱导6×His-QKI-7融合蛋白的表达,分别经金属鳌合柱、反向柱和强阴离子交换柱进行层析纯化。经SDS-PAGE和Western blot鉴定后,应用纯化的融合蛋白,分别以弗氏佐剂、聚丙烯酰胺凝胶、NC膜作为佐剂免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并以Western blot进行检测。结果:经表达并纯化的QKI-7蛋白纯度达到95%以上,应用纯化的融合蛋白以弗氏佐剂作为佐剂免疫新西兰大白兔后获得高滴度,特异性的抗QKI的多克隆抗体。结论:成功地表达并纯化了QKI-7蛋白,并制备了高滴度、高特异性的抗QKI多克隆抗体。采用弗氏佐剂作为免疫佐剂进行免疫的效果优于聚丙烯酰胺凝胶和NC膜。     

人肠道病毒71型VP0蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

目的:原核表达并纯化人肠道病毒71型(EV71)VP0蛋白,免疫豚鼠制备多克隆抗体,并鉴定其用于EV71检测的反应性和特异性。方法:PCR方法扩增VP0基因,构建原核表达质粒pET-VP0并转化大肠杆菌,诱导表达并纯化VP0重组蛋白,免疫豚鼠制备抗VP0多克隆抗体,ELISA方法检测抗VP0抗体效价,细胞免疫荧光和Western blot方法鉴定抗体特异性。结果:VP0重组蛋白在大肠杆菌BL21中高效表达,制备的抗VP0抗体效价为1∶106。细胞免疫荧光及Western blot检测结果显示,抗VP0多克隆抗体可以识别原核表达及EV71感染细胞中的VP0蛋白。结论:原核表达了EV71的VP0蛋白并制备出抗VP0多克隆抗体,为EV71的临床诊断、疫苗开发和分子病毒学研究提供了新的研究工具和手段。     

PPM1A蛋白的表达纯化及鼠多克隆抗体制备研究

目的 表达、纯化PPM1A-His融合蛋白及制备鼠多克隆抗体.方法 将pBEX1-PPM1A-His原核表达质粒在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS内进行诱导表达,用纯化的PPM1A-His融合蛋白免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体,并用ELISA、免疫组化和免疫荧光检测抗体的灵敏度和特异性.结果 成功表达并纯化了PPM1A-His融合蛋白,纯化后纯度可达90%;ELISA法测定抗体效价为1:100 000;免疫组化和免疫荧光结果显示所制备的抗体可特异性检测肝和肝癌细胞的PPM1A.结论 获得的PPM1A鼠多克隆抗体有较高的效价和特异性,为PPM1A在肝癌的相关研究打下了基础.     

人RGS22蛋白表达及多克隆抗体制备

目的:构建人RGS22真核表达载体,表达人RGS22蛋白,制备其多克隆抗体,以探讨其在精子发生和肿瘤转移中的作用.方法:以cDNA文库为模板,用PCR法扩增人的RGS22基因.将其克隆到原核表达质粒PET22b中,构建重组质粒PET22b-RGS22.将该重组质粒依次进行PCR、酶切鉴定及测序后,转化BL21菌,以IPTG诱导表达.表达产物用质谱鉴定.纯化蛋白免疫小鼠,制备多克隆抗体,ELISA测定滴度.结果:用PCR法扩增出3 800 bp的RGS22基因编码框,测序证实为人RGS22基因,并在BL21菌中表达RGS22重组蛋白,用亲和层析Ni柱进行纯化得到人RGS22蛋白.质谱分析其肽混合物的肽质量指纹谱,数据库检索证实为RGS22蛋白.用纯化的RGS22重组蛋白免疫小鼠2个月后,得到相应的多克隆血清抗体,经ELISA检测,滴度均能达到1/10万.结论:制备了RGS22的多克隆抗体,为进一步研究RGS22在精子发生中的作用创造了有利条件.     

人ULBP1重组蛋白的克隆表达和多克隆抗体制备

目的:表达人UL16结合蛋白l(ULBP1)胞外段重组蛋白,并制备兔抗人ULBP1多克隆抗体.方法:利用RT-PCR技术获得人ULBP1分子胞外段的基因编码序列,并将其亚克隆至原核表达载体pQE30,构建重组表达质粒pQE30-ULBP1.测序鉴定正确后转化入大肠杆菌感受态细胞M15,经IPTG 30℃诱导4h后,对表达产物进行鉴定.用镍柱对人ULBP1重组蛋白进行纯化,并将纯化的重组蛋白免疫新西兰白兔,采用流式细胞术(FCM)、Western blot法对制备的多克隆抗体进行生物学鉴定.结果:成功构建了原核表达载体pQE30-ULBP1(aa81～244),并获得了高纯度的人pQE30-ULBP1 (aa81～244)重组蛋白.制备的多克隆抗体能够识别肺癌细胞株A549表面表达的天然构象ULBP1分子.结论:成功表达了人ULBP1(aa81～244)重组蛋白并成功制备了兔抗人ULBP1的多克隆抗体.     

果蝇Hey蛋白的原核表达与多克隆抗体制备

正Hey基因属于碱性螺旋-环-螺旋(basic helix-loop-helix,bH LH)转录因子超家族,具有bH LH结构域、Orange结构域和C末端的YRPW保守四肽。哺乳动物的Hey基因通常作为Notch信号通路的靶基因,参与心血管系统形成、神经发生、骨骼和骨骼肌发育等[1]。Hey2基因敲除小鼠出现明显     

GST-snail融合蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备

目的制备snail多克隆抗体,为深入研究其功能和探讨其与肿瘤等疾病的相关性提供工具。方法PCR扩增编码人snail 264个氨基酸的cDNA全长片段,DNA重组入原核表达质粒pGEX-4T-1,转化大肠杆菌BL21菌株,异丙基-β—D-硫代半糖苷（IPTG）诱导表达GST／Snail融合蛋白。经电泳纯化的融合蛋白免疫新西兰白兔,制备抗血清。通过ELISA、免疫荧光和免疫印迹法鉴定血清特异性和效价。结果成功构建了pGEX-4T-1／snail原核表达载体,转化BL21后可高效表达融合蛋白GST—snail,免疫产生的snail多抗可特异检测snail真核表达载体转染COS-7细胞后snail的表达及定位情况。结论获得了效价和特异性都良好的snail抗体,适合对snail的检测应用。     

人UL16结合蛋白3的原核表达及其多克隆抗体制备

目的:表达和纯化人UL16结合蛋白3(ULBP3)胞外段融合蛋白,制备兔抗人ULBP3多克隆抗体。方法:利用PCR技术获得人ULBP3分子胞外段的基因编码序列,并将其亚克隆至原核表达载体pQE30,构建出重组表达质粒pQE30-ULBP3(aa30-171)。测序鉴定正确后转化入大肠杆菌感受态细胞M15,经IPTG 30℃诱导4 h后,SDS-PAGE显示融合蛋白(表达产物)以包涵体形式存在。用镍柱对融合蛋白进行纯化,将纯化的蛋白免疫新西兰白兔,采用流式细胞术(FCM)、Western blot法和免疫组化染色对所得多克隆抗体的生物学特性进行鉴定。结果:成功表达及纯化了人ULBP3(aa30-171)重组蛋白。结果显示该多克隆抗体能够识别大肠癌细胞株COLO205表面表达的天然构象ULBP3分子,而且能与结直肠癌组织细胞的ULBP3分子结合。结论:成功构建了原核表达载体pQE30-ULBP3(aa30-171),并获得高纯度的人pQE30-ULBP3(aa30-171)重组蛋白;成功制备了兔抗人ULBP3分子的多克隆抗体。