人肝细胞色素P450 2C8/9、2E1比活性测定

目的　建立甲苯磺丁脲羟化酶 (CYP2C8/ 9)和氯羟苯口恶唑 6 羟化酶 (CYP2E1)比活性的测定方法 ,为深入研究CYP45 0在药物代谢中的作用奠定基础。方法　从成人肝细胞中提取微粒体 ,测定其蛋白含量 ,以甲苯磺丁脲、氯羟苯口恶唑为底物 ,用HPLC以梯度洗脱法测定其代谢产物羟基甲苯磺丁脲及 6 羟基氯羟苯 口恶唑生成量 ,据此计算人肝细胞色素P45 0 (CYP45 0 )同工酶甲苯磺丁脲羟化酶 (CYP2C8/9)和氯羟苯 口恶唑 6 羟化酶 (CYP2E1)比活性。结果　于不同时间反复测定的CYP2C8/ 9、CYP2E1比活性无差异。结论　CYP2C8/ 9、CYP2E1的测定方法较为简单、稳定、重复性好 ,可用于新药筛选、安全性评价及肝脏病理学、毒理学研究。     

人肝细胞色素P450 2C8/9、2E1比活性测定

目的　建立甲苯磺丁脲羟化酶 (CYP2C8/ 9)和氯羟苯口恶唑 6 羟化酶 (CYP2E1)比活性的测定方法 ,为深入研究CYP45 0在药物代谢中的作用奠定基础。方法　从成人肝细胞中提取微粒体 ,测定其蛋白含量 ,以甲苯磺丁脲、氯羟苯口恶唑为底物 ,用HPLC以梯度洗脱法测定其代谢产物羟基甲苯磺丁脲及 6 羟基氯羟苯 口恶唑生成量 ,据此计算人肝细胞色素P45 0 (CYP45 0 )同工酶甲苯磺丁脲羟化酶 (CYP2C8/9)和氯羟苯 口恶唑 6 羟化酶 (CYP2E1)比活性。结果　于不同时间反复测定的CYP2C8/ 9、CYP2E1比活性无差异。结论　CYP2C8/ 9、CYP2E1的测定方法较为简单、稳定、重复性好 ,可用于新药筛选、安全性评价及肝脏病理学、毒理学研究。     

rh-EGF对恒河猴肝细胞色素P450s的影响

目的研究重组人表皮生长因子(recombinant human epidermal growth factor,rh-EGF)对恒河猴肝细胞色素P450s同工酶活性的影响.方法恒河猴口服rh-EGF 16,32,160μ*kg-1*d-1,qd,连续给药26周,于停药时及停药8周后,各解剖一半动物,制备肝微粒体,进行肝细胞色素P450s总量、肝微粒体蛋白含量测定,用荧光分光光度法和HPLC法进行肝细胞色素P450s同工酶中7-乙氧基试卤灵脱乙基酶(CYP1A1)、香豆素7-羟化酶(CYP2A6)、甲苯磺丁脲羟化酶(CYP2C8/9)、S-(+)-美芬妥英羟化酶(CYP2C19)、丁呋洛尔1-羟化酶(CYP2D6)、氯唑沙宗羟化酶(CYP2E1)比活性测定.结果给药26周和停药8周后,rh-EGF对恒河猴肝细胞色素P450s总量、微粒体蛋白含量无明显影响,肝细胞色素P450s同工酶(CYP1A1,CYP2A6,CYP2C8/9,CYP2C19,CYP2D6,CYP2E1)活性无显著变化.结论本试验建立的恒河猴肝细胞色素P450s测定方法快速、简便,可广泛用于药物开发早期以及预测药物间相互作用和药物毒性的研究等.rh-EGF对恒河猴肝P450s部分同工酶无影响.     

人类细胞色素P450s研究概况及其在新药安全性评价中的应用

人类细胞色素P450s(CYP450s)对许多内源、外源性化合物在体内的I相生物转化有重要作用。人类编码CYP450s的基因已基本明确，为55个基因，29个假基因。目前欧美各国已经把CYP450s及其同工酶测定用于新药的筛选及安全性评价。本实验室建立了不同种属动物肝细胞色素P450s同工酶的测定方法，并选择来氟米特、重组人白细胞介素－11（rhIL-11)及重组人表皮生长因子（rh-EGF)，检测其对不同动物CYP450s的影响。实验结果表明：①来氟米特对Beagle犬肝微粒体蛋白含量、CYP450s总量、7－乙氧基试卤灵脱乙基酶（CYP1A1）、香豆素7－羟化酶（CYP2A6／CYP2A2）、甲苯磺丁脲羟化酶（CYP2C8／9）、氯唑沙宗羟化酶（CYP2E1）的比活性均无明显影响。②大鼠皮下注射rhIL-11后，肝微粒体中CYP1A1及CYP2A2比活性明显低于对照组，而肝微粒体蛋白含量、CYP450总量及CYP2E1比活性无明显变化。③rh-EGF对猕猴肝微粒体蛋白含量、CYP450s总量、CYP1A1、CYP2A6、CYP2C8／9、S－（＋）－美芬妥英羟化酶（CYP2C19）、丁呋洛尔1－羟化酶（CYP2D6）、CYP2E1比活性均无明显影响。本实验建立的犬、大鼠及猴肝CYP450s测定方法具有快速、简单、重复性好等特点，可广泛用于药物筛选及临床前安全性评价。除合成药物外，在基因工程药物安全性评价研究中，也应重视药物对CYP450s的影响。     

丹参注射液对人肝微粒体酶CYP2C9,CYP2C19,CYP2D6体外抑制作用的研究

目的 评价丹参注射液在体外对人肝微粒体酶CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6活性的影响。方法 将丹参注射液与CYP450酶3种亚型(CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6)的特异性探针底物甲苯磺丁脲、奥美拉唑、右美沙芬与大鼠肝微粒体进行孵育,采用LC-MS/MS法测定对应3种代谢产物4-羟基甲苯磺丁脲、5-羟基奥美拉唑、右啡烷的浓度,求算出IC₅₀。结果 丹参注射液对CYP2C9、CYP2C19和CYP2D6的IC₅₀值均>50 μg/mL。结论 丹参注射液对人肝微粒体酶CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6没有抑制作用。     

甲基原薯蓣皂苷对人肝微粒体中7种CYP450酶活性的影响

目的研究甲基原薯蓣皂苷对CYP450酶的7种亚型酶活性的影响。方法将MPD和CYP450酶7种亚型的特异性探针底物咖啡因(CYP1A2)、右美沙芬(CYP2D6)、甲苯磺丁脲(CYP2C9)、s-美芬妥因(CYP2C19)、氯唑沙宗(CYP2E1)、香豆素(CYP2A6)及咪达唑仑(CYP3A4)与人肝微粒体进行孵化反应,采用HPLC和LC-MS/MS法测定对应的7种代谢产物(1,7-二甲基黄嘌呤、去甲右美沙芬、4-羟基甲苯磺丁脲、4-羟基美芬妥因、6-羟基氯唑沙宗、7-羟基香豆素和1-羟基咪达唑仑)的浓度,通过与对照组比较,确定MPD对以上7种酶活性的影响。结果MPD在1~10μmol.L-1时对7种酶均无明显抑制作用,在100μmol.L-1时对CYP2D6有抑制趋势,但对其他6种酶无抑制作用,均无统计学意义(P>0.05)。结论MPD在与以上6种酶(CYP1A2、CYP2E1、CYP2C19、CYP3A4、CYP2C9和CYP2A6)代谢的药物联合用药时,发生药物相互作用的可能性较小。     

评价HPPH对细胞色素P450酶体外代谢活性的影响

目的:评价HPPH在体外对大鼠及人肝微粒CYP450酶的6种亚型酶活性的影响,预测使用HPPH可能出现的药物相互作用。方法:将注射用HPPH与CYP450酶的6种亚型的特异性探针底物非那西汀(CYP1A2)、甲苯磺丁脲(CYP2C9)、S-美芬妥因(CYP2C19)、右美沙芬(CYP2D6)、氯唑沙宗(CYP2E1)、咪达唑仑(CYP3A4)和睾酮(CYP3A4)与大鼠及人肝微粒进行孵育反应,采用HPLC-MS/MS法测定对应的7种代谢产物(对乙酰氨基酚、羟基甲苯磺丁脲、4-羟基美芬妥因、O-去甲基右美沙芬、6-羟基氯唑沙宗、1′-羟基咪达唑仑、6β-羟基睾酮)的浓度。结果:在本实验条件下,HPPH浓度为1.00~50.00μmol·L-1时,未发现其对大鼠的CYP1A2、CYP2C9、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4产生抑制作用。在本实验条件下,HPPH浓度为0.50~10.00μmol·L-1时,未发现其对人CYP1A2产生抑制作用;但对人CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1均存在抑制作用;对人CYP3A4,对底物咪达唑仑存在抑制作用,对底物睾酮未发现抑制作用。结论:HPPH对CYP450酶的抑制作用存在种属差异,在人体内HPPH与CYP450酶作用有待体内实验进一步证明。     

豆腐果苷对人肝微粒体CYP450酶体外抑制作用研究

目的:通过评价豆腐果苷在体外对人肝微粒体CYP450酶的7种亚型酶活性的影响,预测服用豆腐果苷可能出现的食物-药物及药物-药物代谢的影响。方法:将豆腐果苷与CYP450酶7种亚型的特异性探针底物咖啡因(CYP1A2)、右美沙芬(CYP2D6)、甲苯磺丁脲(CYP2C9)、S-美芬妥因(CYP2C19)、氯唑沙宗(CYP2E1)、香豆素(CYP2A6)及咪达唑仑(CYP3A4)与人肝微粒体进行孵育反应,采用HPLC和LC-MS/MS法测定对应的7种代谢产物(1,7-二甲基黄嘌呤、去甲右美沙芬、4-羟基甲苯磺丁脲、4-羟基美芬妥因、6-羟基氯唑沙宗、7-羟基香豆素和1-羟基咪达唑仑)的浓度,与对照组比较,确定豆腐果苷对以上7种亚酶活性的影响。结果:豆腐果苷在1～100μmol.L-1时对7种酶的抑制作用均无明显统计学意义(P>0.05)。结论:豆腐果苷可能不会引起有临床意义的CYP450酶抑制现象的发生。     

Cocktail探针药物法评价胃炎灵颗粒对大鼠体内CYP450活性的影响

目的研究胃炎灵颗粒对大鼠体内细胞色素P450酶活性的影响。方法分别以右美沙芬(CYP2D6)、咪达唑仑(CYP3A4)、奥美拉唑(CYP2C19)、茶碱(CYP1A2)、氯唑沙宗(CYP2E1)和甲苯磺丁脲(CYP2C9)作为探针底物,大鼠6只,每日灌胃胃炎灵颗粒4 g/kg,采用LC-MS/MS测定给药前后大鼠体内6种探针药物的血药浓度。结果胃炎灵颗粒连续给药10 d后,与给药前相比,大鼠体内的右美沙芬(P <0. 01)、甲苯磺丁脲(P <0. 01)代谢减慢,氯唑沙宗(P <0. 01)代谢加快,奥美拉唑、咪达唑仑、茶碱的代谢无显著差异。结论胃炎灵颗粒在大鼠体内对CYP2D6酶产生中强抑制作用,对CYP2C9酶产生弱抑制作用,对CYP2E1酶产生轻微诱导作用,对CYP3A4、CYP2C19和CYP1A2基本没有影响。     

艾瑞昔布对CYP2C9酶活性及mRNA和蛋白表达的影响

目的:评价艾瑞昔布对CYP2C9酶活性及mRNA和蛋白表达的影响。方法:采用超高效液相色谱(UPLC),色谱柱：Acquity UPLC BEH-C₁₈柱(2.1 mm×50 mm, 1.7μm);流动相为水-乙腈(76∶24,V/V);流速0.4 mL·min^-1;检测波长235 nm;柱温30℃;进样量2μL;内标为卡马西平。选择甲苯磺丁脲为CYP2C9酶特异性探针药物,与艾瑞昔布在肝微粒体中共同孵育,UPLC测定代谢产物4-羟基甲苯磺丁脲的生成量,考察艾瑞昔布对CYP2C9酶活性的影响。Wistar大鼠给予艾瑞昔布,RT-PCR和Western Blot测定肝组织中CYP2C9酶活性及mRNA和蛋白表达。结果:随着艾瑞昔布浓度的升高,肝微粒体孵育体系中4-羟基甲苯磺丁脲生成量降低,艾瑞昔布对CYP2C9活性呈剂量依赖性抑制作用,IC₅₀值为74.77μmol·L^-1;随着给药时间延长,大鼠肝脏CYP2C9酶的mRNA和蛋白表达减少(P<0.05)。结论:艾瑞昔布可降低CYP2C9酶的mR...     

细胞色素P450 CYP2C9基因多态性对甲苯磺丁脲代谢动力学的影响

目的研究细胞色素P450 CYP2C9基因多态性对甲苯磺丁脲代谢动力学的影响。方法用基因芯片对137名健康志愿者进行CYP2C9基因多态性检测，将受试者分为CYP2C9野生型、杂合突变型和纯合突变型3组，用高效液相色谱法检测甲苯磺丁脲在受试者体内的药物代谢动力学参数，统计分析各组间药代动力学性质差异。结果在137名受试者中发现了9个CYP2C9*1/*3杂合型突变体和1个CYP2C9*3/*3纯合型突变体，其余为野生型个体。将9名CYP2C9*1/*3，1名CYP2C9*3/*3以及随机抽取的10名野生型个体分组，以甲苯磺丁脲为探药进行药物代谢动力学研究。结果在杂合型突变个体组以及纯合型突变个体组中，甲苯磺丁脲的代谢率显著低于对照的野生型个体组。结论CYP2C9基因多态性对甲苯磺丁脲代谢具有显著影响并呈基因剂量效应，检测突变型个体对指导临床合理用药和个体化医疗具有重要意义。     

探针药物法评价艾瑞昔布对大鼠CYP2C9酶的影响

利用探针药物法研究艾瑞昔布对大鼠体内CYP2C9酶的影响。将大鼠随机分为试验组和对照组,每组18只,试验组经口灌胃艾瑞昔布,对照组经口灌胃等量蒸馏水,连续给药7 d(2次/d)。d8,每只大鼠经口灌胃甲苯磺丁脲,并于给药后24 h内眼内眦取血,以HPLC法测定血浆药物浓度,拟合药动学参数,并对两组的药动学参数进行统计学分析。结果表明,试验组的AUC0→24 h、AUC0→∞、tmax、CL和V与对照组相比均有显著性差异(P<0.05)。合用艾瑞昔布后,甲苯磺丁脲的AUC0→24 h和AUC0→∞显著降低,CL明显增加,表明艾瑞昔布诱导CYP2C9酶的活性,加快甲苯磺丁脲的代谢。     

超高效液相串联质谱法快速测定CYP2C9酶活性

目的：建立一种超高效液相串联三重四级杆质谱法快速测定CYP2C9体外酶学活性检测的新方法。方法：色谱柱为ACQUITY UPLCBEH C18柱（100 mm×2.1 mm,1.7μm）;流动相为乙腈-水（含0.1%甲酸和0.5%氨水）（40∶60）,流速为0.2 ml·min^-1,柱温30℃,内标为氯磺丙脲;质谱条件：电喷雾离子化源（ESI）,正离子检测模式;用实验室制备的CYP2C9＊1,＊2,＊3和＊13酶在37℃孵育甲苯磺丁脲后,加入800μl冰乙酸乙酯终止反应,10 000 g离心后取有机层于氮吹仪下吹干并用200μl流动相复溶后上样。结果：4-羟基甲苯磺丁脲的保留时间为1.21 min,线性范围为0.05-5 ng·μ^l-1（r=0.999 8）,最低定量限为0.01 ng·μl^-1,回收率为99.3%-100.3%。4-羟基甲苯磺丁脲的日内、日间RSD均〈5%,孵育体系中的其他内源性物质不干扰测定。CYP2C9＊1,＊2,＊3和＊13孵育甲苯磺丁脲后结果显示突变体CYP2C9＊2,＊3,＊13的体外酶学活性分别为野生型CYP2C9＊1的47.3%,11%和0.3%。结论：该方法快速、稳定,该方法操作简便,适于CYP2C9的快速活性检测及抑制药等的相关性研究。     

混合探针底物法同时预测细胞色素P450酶5种亚型的抑制作用

本研究建立了混合探针底物法同时预测细胞色素P450(cytochrome P-450，CYP450)酶5种亚型的抑制作用。将CYP450酶5种亚型的特异性探针底物非那西丁(CYP1A2)、右美沙芬(CYP2D6)、甲苯磺丁脲(CYP2C9)、奥美拉唑(CYP2C19)及咪达唑仑(CYP3A4)同时与人肝微粒体在体外进行孵化反应，采用液相色谱-串联质谱分析方法同时测定5个特异性底物及其生成的对应的5种代谢产物(对乙酰氨基酚、右啡烷、4-羟基甲苯磺丁脲、5-羟基奥美拉唑和1′-羟基咪达唑仑)。并选择5种细胞色素P450酶的特异性抑制剂α-萘黄酮(CYP1A2)、奎尼丁(CYP2D6)、磺胺苯吡唑(CYP2C9)、氟康唑(CYP2C19)和酮康唑(CYP3A4)加入到其所对应酶的单个探针底物及混合探针底物的反应体系中，测定生成的代谢物，计算相应IC₅₀值，对方法进行验证。5种特异性的抑制剂与混合探针底物反应后所得的IC₅₀值和与单个探针底物反应后所得的IC₅₀值具有很好的一致性且与文献报道的基本一致。本研究建立的混合探针底物法可以用于快速高通量地同时预测化合物对CYP450酶5种亚型活性的抑制作用。     

短刺小克银汉霉AS 3.910的CYP2C9同工酶抑制作用

目的探索具有药物代谢酶CYP2C9活性的微生物模型对CYP2C9抑制剂的响应。方法选用短刺小克银汉霉AS 3.910为模型菌株， 检测CYP2C9抑制剂对CYP2C9底物特定转化产物产率的影响， 并通过底物间相互影响的程度探索该转化体系中的药物代谢相互作用。 采用液相色谱-多级质谱联用技术检测转化产物。 结果 CYP2C9抑制剂苯溴马隆抑制4′-羟基甲苯磺丁脲的生成，使其产率由100%下降到14.5%；磺胺苯吡唑抑制O-去甲基吲哚美辛的生成，使其产率由75.2%降低到9.9%；丙戊酸抑制4′-羟基双氯芬酸的生成，使其产率由98.6%降低到2.7%。底物药物甲苯磺丁脲、双氯芬酸和吲哚美辛之间存在代谢相互作用，导致生成相应代谢物的产率降低。结论3种CYP2C9抑制剂不同程度地抑制了短刺小克银汉霉的CYP2C9同工酶，而且CYP2C9底物间存在药物代谢相互作用。     

中国健康人群P450 2C9基因多态性与甲苯磺丁脲代谢的关系

目的 研究甲苯磺丁脲人体代谢过程与中国健康志愿者P450 2C9基因多态性的关系。方法 不同P450 2C9＊1／＊1（n=53）、＊1／＊3（n=9）及＊3／＊3（n=1）基因型的健康志愿者单次口服甲苯磺丁脲500mg后，用HPLC方法测定血和尿中的甲苯磺丁脲及其代谢产物浓度，研究甲苯磺丁脲的药代过程。结果 P450 2C9＊1／＊3与P450 2C9＊3／＊3基因型的受试者与P450 2C9＊1／＊1基因型相比，AUC（0-∞）增加20％和116％，t1/2增加60％和813％，CL0为68％和11％，CLform仅为39％和3％。结论 P450 2C9＊1／＊3对甲苯磺丁脲的代谢活性较P4502C9＊1／＊1显著降低，P4502C9＊3／＊342谢活性更低，并呈现基因剂量关系。     

苦碟子注射液对大鼠肝微粒体CYP450酶5个亚型的体外抑制作用

目的研究苦碟子注射液对大鼠肝微粒体CYP450酶的体外抑制作用。方法制备大鼠肝微粒体。将苦碟子注射液分别与混合探针药物非那西丁、甲苯磺丁脲、奥美拉唑、睾酮和氯唑沙宗共同孵育,UPLC-MS/MS法检测各探针药物的代谢物。结果在测定浓度范围内,苦碟子注射液对CYP2E1、CYP2C9和CYP2C19的活性抑制率小于50%;对CYP1A2、CYP3A4的IC_(50)值分别为12.68%、8.11%,远高于临床日用药浓度0.20%~0.80%。结论在正常剂量下,苦碟子注射液对大鼠CYP2E1、CYP2C9、CYP2C19几乎不显示抑制作用,对CYP1A2、CYP3A4几乎没有抑制作用。     

慢性不可预见性温和应激模型大鼠的肝脏药物代谢酶活性变化研究

采用鸡尾酒(cocktail)探针药物法研究慢性不可预见性温和应激(chronic unpredictable mild stress,CUMS)造成的抑郁状态对大鼠体内6种CYP450亚酶活性的影响。根据Katz法建立CUMS大鼠抑郁模型;分别选用甲苯磺丁脲、氯唑沙宗、茶碱、咪达唑仑、奥美拉唑及右美沙芬作为大鼠CYP2C6、CYP2E1、CYP1A2、CYP3A2、CYP2D1、CYP2D2的探针底物,采用液质联用法(LC-MS/MS)测定对照组与模型组大鼠体内6种混合探针的血药浓度,计算药动学参数。结果表明,茶碱和氯唑沙宗代谢显著加快(P<0.01),甲苯磺丁脲、右美沙芬、奥美拉唑、咪达唑仑的代谢无显著差异。结果说明,慢性不可预见性温和应激造成的抑郁状态对CYP1A2有强诱导、对CYP2E1有中强诱导作用。     

Cocktail法评价白香丹胶囊对大鼠体内CYP450酶活性的影响

目的：建立同时测定大鼠血浆中6种CYP450探针药物的方法,并采用Cocktail法研究白香丹胶囊对大鼠CYP450酶活性的影响。方法：选用茶碱(CYP1A2)、氯唑沙宗(CYP2E1)、甲苯磺丁脲(CYP2C6)、右美沙芬(CYP2D2)、奥美拉唑(CYP2D1)、咪达唑仑(CYP3A2)作为探针药物。大鼠随机分为对照组和给药组,给药组每天灌胃白香丹胶囊0.675 g?kg-1,对照组灌胃等量生理盐水,连续给药14天。第15天均灌胃给予6个探针药物,于不同时间点眼眶取血,采用LC-MS/MS法测定各探针药物浓度,计算药动学参数并进行组间t检验。结果：与对照组相比,给药组茶碱(P < 0.01)、氯唑沙宗(P < 0.01)、甲苯磺丁脲(P < 0.05)代谢显著加快,右美沙芬、奥美拉唑、咪达唑仑代谢无显著性差异。结论：白香丹胶囊对大鼠CYP1A2有中强诱导作用,对CYP2E1、CYP2C6有弱诱导作用。     

葛根素对人肝微粒体中细胞色素P450酶活性的影响

目的:研究葛根素对人肝微粒体中细胞色素P450 1A2(CYP1A2)、CYP3A4、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1酶活性的影响.方法:分别以咖啡因、咪达唑仑、甲苯磺丁脲、氯唑沙宗、美托洛尔、美芬妥因为探针药,利用HPLC方法测定探针药与相应代谢产物的浓度,研究葛根素在人肝微粒体孵化体系中对CYP1A2、CYP3A4、CYP2C9、CYP2E1、CYP2D6、CYP2C19酶活性的影响.结果:在人肝微粒体反应体系中,0.1,0.2,0.4,0.8mmol·L-1葛根素使咖啡因的代谢产物的生成分别降低了(31±15)%(P＜0.01),(43±8)%(P＜0.05),(48±6)%(P＜0.05),(49±4)%(P＜0.05),0.05,0.1,0.2,0.4,0.8mmol·L-1葛根素使美托洛尔的代谢产物生成分别降低了(25±7)%(P＜0.01),(33±4)%(P＜0.05),(40±9)%(P＜0.01),(46±5)%(P<0.01),(72±9)%(P＜0.01);而对甲苯磺丁脲、美芬妥因、咪达唑仑和氯唑沙宗的代谢产物没有明显影响.结论:在人肝微粒体反应体系中,葛根素(0.1 mmol·L-1)对CYP1A2和CYP2D6酶活性有较明显的抑制作用;且随着葛根素浓度的增高,对这两种酶活性的抑制作用也随之增强,而对CYP2C9、CYP2C19、CYP3A4和CYP2E1酶活性没有影响.