实时荧光定量PCR在检测人ANP基因表达的应用

目的 建立心房钠尿肽(ANP)基因mRNA表达水平的实时荧光定量PCR检测方法,并对该方法进行初步评价.方法 以基因表达产物为模板,建立实时荧光定量PCR检测方法,对样本中的心房钠尿肽含量进行相对定量,比较不同样本组的基因表达水平.结果 所建立的实时荧光定量PCR方法熔解曲线中熔解峰单一.肺癌患者胸腔样本的ANP含量为对照样本的4.68倍,血清样本为对照样本的16.03倍.结论 所建立的ANP实时荧光定量PCR检测方法具有较高的特异性.肺癌患者胸腔液和血清中ANP的含量明显增高.     

实时荧光定量PCR在肝炎检测中的应用

目的:探讨实时荧光定量PCR在肝炎尤其是乙型肝炎(乙肝)检测中的应用。方法:对450例急、慢性乙肝患者,采用经酶联免疫吸附试验检测血清,并按血清学标志分为三组,并对所用患者血清实时荧光定量PCR检测。结果:不同血清学标志模式的实时荧光定量PCR检测阳性率分别为95.95%、31.47%、52.20%,三组之间差异均有统计学意义(P<0.01)。结论:实时荧光栋梁PCR检测可以为乙肝病毒感染诊断、治疗及预后判断提供客观依据。但对于病毒非复制感染不能有效检测,不可在肝炎检测中完全替代血清标志物检测。     

实时荧光定量PCR检测白血病患者WT1基因表达及临床意义

目的 研究白血病患者WT1基因的表达水平及与临床预后的关系.方法 建立实时荧光定量PCR检测WT1基因表达技术,并分析65例白血病患者WT1基因的表达水平及与临床预后的关系.结果 建立的实时荧光定量PCR方法的标准曲线相关系数＞0.99.急性髓性白血病(AML)和急性淋巴细胞白血病(ALL)患者WT1基因表达水平较正常对照组均显著升高(P=0.001).慢性髓性白血病(CML)急变期患者WT1基因表达水平显著高于慢性期.WT1表达量与急性白血病发病时外周血白细胞计数、血红蛋白、血小板无明显相关关系.AML和ALL患者中WT1基因高表达患者与低表达病例CR率差异无显著性.急性白血病患者治疗缓解后WT1的表达量较治疗前显著下降(P=0.032).随访显示WT1持续高表达或下降后又上升的患者呈现难治及复发.结论 实时荧光定量PCR技术检测急性白血病患者WT1基因表达量可预测难治复发及用于MRD的检测.     

荧光实时定量PCR的研究进展

生物机体的生长、发育、衰老和病变通常由基因在不同阶段和部位的差异表达来决定。基因表达差异最终表现为蛋白质合成量上的差异,并在一定程度上决定细胞的激活、增殖、分化、病变和凋亡。定量mRNA表达是了解机体生长发育调控和病理病变机理的一个重要方面,因此准确定量mRNA表达成为了生物医学研究中的一个重要内容。     

出生后大鼠螺旋神经节神经元形态学研究

目的 证实出生后第2周是大鼠耳蜗螺旋神经节神经元发育的关键时刻。方法 选用60只出生后1—49d(postnatal day 1 to 49，PND l—49)的SD大鼠(分为10组)和6只成年(4月龄)SD大鼠。取平行蜗轴的中轴切片，光镜下观察螺旋神经节神经元形态；通过形态学测量神经元细胞面积、细胞核面积、Rosenthal隧道截面积并计数神经元，计算核浆比和细胞密度。结果 PND l—14大鼠神经元细胞面积逐渐增大；PND l—3大鼠细胞核面积较小，此后无明显变化趋势；PND 7大鼠细胞密度和核浆比明显下降，PND l4大鼠核浆比有明显下降。发育最早从钩回开始，逐渐向顶回发展。结论 出生后第2周是大鼠耳蜗螺旋神经节神经元发育的重要阶段。     

新生大鼠耳蜗螺旋神经节神经元的原代培养

[目的]建立原代细胞培养大鼠耳蜗螺旋神经节神经元(SGN)的方法.[方法]选择出生后5d的SD大鼠的SGN进行原代细胞培养,采用免疫细胞染色法进行细胞学鉴定.[结果]新生SD大鼠SGN在原代培养条件下获得良好的细胞形态及表型分化,表现出稳定的神经元可塑性.[结论]原代细胞培养方法可获得状态良好的SGN细胞.     

实时荧光定量PCR的研究进展及其应用

随着PCR(聚合酶链反应)技术的飞速发展,实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR)技术以其特异性强、灵敏度高、自动化和重复性好、定量准确、污染少等优点,成为分子生物学和其它领域的重要技术工具,并广泛应用于遗传病、病原体和肿瘤等方面的检测和诊断.本文就实时荧光定量PCR技术的主要原理、定量方法及目前在研究领域中主要的应用进行了概述.     

实时荧光定量PCR检测限的统计推断

检测限是检测方法的重要性能指标,用Poisson分布的概率函数分式计算一次抽样检测出现的结果推论总体出现该结果的概率。以实时荧光定量PCR(FQ-PCR)检测乙型肝炎病毒DNA结果为例,计算可知,一次抽样反应管的检测结果≥4时,才可推论总体与0(空白)差异有显著性(P<0.05)。因而检测血清中病原体时扩增反应管中的检测限是4拷贝/ul计算也可知,1拷贝/ul表示一次抽样的结果为0的概率可达0.368,结果在0拷贝/ul～4拷贝/ul的概率为0.996,而1000拷贝/ml表示一次抽样结果为0的概率为0。结果在905拷贝/ml～1095拷贝/ml的概率为0.997;而100000拷贝/L表示一次抽样结果在997000拷贝/L～1003000拷贝/L的概率为0.997。抽样单位ul不能随意放大为ml甚至L。     

胃癌组织Twist基因的荧光实时定量PCR检测

目的探讨Twist基因在人胃癌组织、癌旁组织、胃癌转移灶组织中表达及临床意义。方法应用Trizol法提取总RNA，以总RNA为模板经逆转录合成cDNA，用实时荧光定量PCR的方法检测8例正常胃粘膜，27例胃癌原发灶，19例胃癌转移灶组织中Twist mRNA的表达情况并分析其与临床病理指标的关系。结果荧光实时定量PCR扩增结果显示，Twist基因在正常胃粘膜组织中表达量很低，而在原发性胃癌组、转移性胃癌组中均有较高的表达，原发性胃癌组织及腹膜转移组织中的表达明显高于正常胃粘膜组织（P〈0．05）；Twist基因在淋巴转移组织中的表达与原发组中的表达差异显著（P〈0．05）。结论Twist基因在胃癌中过度表达可能促进胃癌的发生与发展，并与胃癌转移密切相关，又可能成为预测胃癌转移潜能的分子基础。     

呼吸道合胞病毒实时荧光定量PCR检测

目的 建立一种快速、准确诊断人呼吸道合胞病毒(hRSV)早期感染的实时荧光定量PCR检测方法。方法 以hRSV最保守的N基因序列为参考,设计两对特异的引物和一条TaqMan荧光探针,在LightCycler定量PCR检测仪上对93例下呼吸道感染患儿进行hRSVRNA检测,并与病毒分离培养、常规PCR、巢式PCR方法和ELISA法相比较。结果 以PCR模板浓度来定义,该方法线形范围为1×10²~1×10⁷cDNAcopies/μl,灵敏度达1×10²cDNAcopies/μl,和巢式PCR相同,比常规PCR高10倍。用人脊髓灰质炎病毒Ⅰ型、柯萨奇病毒2型、甲型、乙型流感病毒、腺病毒7型作对照,均无预期扩增产物和荧光的产生;该方法在LightCycler和Rotor-Gene两种仪器上的定量结果具有一致性;采用该法对93例患儿行FQ-PCR检测出阳性44例(43.9%),ELISA方法检测阳性4例(4.3%),两者相关性不高。hRSV浓度的高低与患儿临床症状之间的关系不是很明显。结论 该方法可快速、灵敏、特异、定量检测hRSV,在hRSV感染的早期诊断和疗效监测方面具有良好的应用前景。     

水杨酸钠抑制大鼠螺旋神经节神经元电压门控钠通道的研究

目的：研究大鼠螺旋神经节神经元电压门控钠通道在水杨酸钠致听力下降过程中所起的作用。方法：采用全细胞记录膜片钳技术研究水杨酸钠对急性分离大鼠螺旋神经节神经元电压门控钠通道的影响。结果：水杨酸钠（10～1000μmol／L）作用于大鼠螺旋神经节神经元电压门控钠通道后,钠电流（Ina）的电流幅度随着浓度的增加而减小,该作用具有可逆性。水杨酸钠不改变INa的电压门控特性和稳态激活曲线。结论：水杨酸钠对大鼠螺旋神经节神经元INa具有可逆性抑制作用,但不改变钠通道激活的电压依赖特性,这可能与水杨酸钠致听力下降有关。     

高纯度大鼠胚胎背根神经节神经元的培养与鉴定

目的：建立一种取材容易、存活时间长、纯度高的原代大鼠胚胎背根神经节神经元（DRGn）的培养模型.方法：在解剖显微镜下取得胎鼠背根神经节（DRG）,通过胰蛋白酶消化,使用Neurobasal （NB）培养基联合抗有丝分裂药物纯化等方法获得DRGn.采用神经丝蛋白免疫细胞化学染色法和hoechst染核鉴定并测定DRGn的纯度.结果：原代培养的DRGn在含有神经生长因子（NGF）的NB培养基中生长良好,存活时间可达45 d,纯度可达到95％以上.结论：该培养模型简单易行,培养稳定,可获得大量高纯度和存活时间长的DRGn.     

慢性心房颤动患者心房肌mink亚单位基因mRNA水平的定量检测

目的：心房颤动是目前最为常见的快速性心律失常之一。mink是心肌细胞延迟整流钾通道（Iks）的重要辅助亚单位,在Iks发挥正常功能中起着重要的作用,同时参与心肌细胞其它离子通道电流的调控。本研究采用实时荧光定量PCR技术通过对房颤时mink基因mRNA水平进行定量研究,探讨mink在房颤中的作用和潜在调控机制。方法：①16例风湿性心脏病（rheumaticheartdisease,RHD）患者分为2组：窦性心律组（SR组）8例、房颤心律组（AF组）8例,取其常规切除的右心耳组织作为研究对象;②提取心房肌组织总RNA,通过RT-PCR和TA克隆技术构建含有目的基因片段的质粒标准品;③以GAPDH为内参照基因,采用SYBRGreenⅠ法实时荧光定量PCR技术检测慢性心房颤动和窦性心律患者mink基因mRNA水平。结果：①标准曲线和熔解曲线：标准曲线线性关系良好,相关系数R2〉0.99。熔解曲线呈明显单峰状,退火温度与预测值基本一致;②SR组和AF组mink/GAPDH比值分别为0.1890±0.0721（n=8）和0.1413±0.0954（n=8）,AF组mink基因mRNA水平低于SR组,P〈0.05。结论：与窦性心律患者相比,心房颤动患者mink基因明显下调,mink基因表达量的改变可能参与房颤重构的分子基础。     

水杨酸钠对幼年豚鼠螺旋神经节GAD蛋白表达和ABR阈值的影响

目的:观察水杨酸钠给药对幼年豚鼠螺旋神经节谷氨酸脱羧酶(GAD)蛋白表达和听性脑干诱发电位(ABR)阈值的影响.方法:将48只出生7 d的幼年健康豚鼠分为4组,每组12只.A组:对照组;B组:低剂量水杨酸钠给药组(200 mg/kg·d-1);C组:中剂量水杨酸钠给药组(300 mg/kg·d-1);D组:高剂量水杨酸钠给药组(450 mg/kg·d-1).给药前和给药15 d后检测ABR阈值,然后处死动物采用免疫组织化学染色方法检测豚鼠螺旋神经节GAD蛋白表达.结果:①给药15 d后B、C、D 3组ABR阈值较对照组均有明显提高(P<0.05), B、C、D 3组以D组ABR阈值提高最为明显,C组次之,B组ABR阈值改变最小;②B、C、D 3组GAD蛋白表达积分光密度值较对照组显著降低(P<0.01);B、C、D 3组以D组GAD蛋白表达积分光密度值降低最为明显,C组次之,B组GAD蛋白表达改变最小.结论:水杨酸钠可显著提高豚鼠ABR阈值并使豚鼠螺旋神经节GAD蛋白表达降低,其改变豚鼠螺旋神经节GAD蛋白表达以及ABR阈值与给药剂量有关.     

SOD1基因缺陷型小鼠耳蜗毛细胞和螺旋神经节及神经纤维的定量观察

定量观察了出生后１３个月的先天缺失ＳＯＤ１基因小鼠的耳蜗毛细胞以及螺旋神经蕞和疆孔内的神经纤维,并与同龄野生型和出生后２个月的野生型小鼠进行了比较。发现毛细胞和螺旋神经节的缺损约为５０％,神经纤维的减少则超过５０％,提示由于与铜和锌相结合的过氧化物歧化酶的缺失导致了耳蜗神经与终器的严重退变。     

子痫前期病人血清瞬时受体电位通道蛋白6检测

目的研究子痫前期病人血清经典瞬时受体电位通道蛋白6（TRPC6）水平变化及其意义。方法选取轻度子痫前期孕妇20例（轻度组）、重度子痫前期孕妇23例（重度组）以及因社会因素和头盆不称因素剖宫产病人25例（对照组）,采用EusA法检测3组孕妇血清中TRPC6的水平,并分析血清TRPC6与血压、血生化指标和24h尿蛋白总量的相关性。结果轻度组及重度组孕妇血清TRPC6水平均高于对照组,差异有显著性（F=5．98,q=3．43、4．68,P〈0．05）;轻度组和重度组TRPC6差异无显著性（P〉0．05）。轻度组与重度组血清TRPC6水平与24h尿蛋白总量呈正相关（r=0．841、0．897,P〈0．05）;与收缩压及舒张压也呈正相关（r=0．712、0．774,P〈0．05）;与三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）均无相关性（P〉0．05）。结论子痫前期病人血清TRPC6水平升高,并且与子痫前期病情严重程度有关。     

人FHIT基因实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

目的：建立检测人脆性组氨酸三联体（fragile histidine triad,FHIT）基因的荧光定量RT-PCR方法。方法：根据GenBank中人FHIT基因序列,在保守区设计合成一对特异引物,将PCR扩增得到的FHIT基因克隆至PMD18-T载体上,构建的重组质粒标准品倍比稀释后运用SYBR Green I染料法绘制标准曲线,并进行融解曲线分析。结果：FHIT基因的标准品稀释度在1×107～1×103copies/μl范围内具有良好的线性关系,Ct值线性范围为14.28～28.36,相关系数为0.998,融解曲线分析表明,产物为特异的单峰,Tm为92.3±0.1℃。结论：建立了人FHIT基因实时荧光定量RT-PCR方法,为在mRNA水平对人FHIT的定量分析奠定了基础。     

NMDAR1基因表达及其受体活性在大鼠感染性脑损伤时的变化

用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹杂交和放射性配基结合法，检测了百日咳杆菌脑损伤时大鼠大脑皮质ＮＭ－ＤＡ受体的变化。结果显示：注菌组Ｋｄ值较对照组小（Ｐ＜０．０５），ＮＭＤＡＲ１ｍＲＮＡ表达及Ｂｍａｘ值较对照组差异无显著性（Ｐ＞０．０５）。提示ＮＭＤＡ受体主要表现为受体功能的激活，亲和力增加，并非基因表达的改变而使受体的数量变化。     

PCR－SSCP法检测胃癌P53基因突变

应用多聚酶链反应和单链构象多态性分析法（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）检测１９例冰冻胃癌组织Ｐ５３基因第７外显子ＤＮＡ片段扩增及突变情况，同时应用免疫组化法（ＩＨＣ）检测相应胃癌石蜡包埋组织中Ｐ５３蛋白的表达。结果发现４例（２１．１％）胃癌组织Ｐ５３基因第７外显子发生突变。而Ｐ５３蛋白表达率达４７．４％（９／１９）。Ｐ５３基因突变及Ｐ５３蛋白表达与肿瘤发生部位、组织学类型、淋巴结转移及肿瘤分期无关（Ｐ＞０．０５）。提示在胃癌发生和演变过程中，Ｐ５３基因突变是重要事件，其中第７外显子是突变热区之一。     

p75神经营养素受体在新生和成年大鼠背根神经节中的不同表达

目的：研究神经生长因子低亲和力受体p75NTR在新生和成年大鼠背根经节中的表达，以探讨p75NTR在背根神经节神经元中的作用。方法：取新生和3月龄大鼠背根神经节，免疫组化ABC法观察p75NTR在神经元中分布和表达。结果：新生大鼠背根神经节中可见较多的p75NTR阳性反应神经元，免疫反应产物主要位于胞浆。成年大鼠背根神经节大多数神经元有p75NTR阳性免疫反应产物，主要位于细胞核。结论：p75NTR在新生和成年大鼠背根神经节神经元中表现为不同表达方式，提示其在神经元发育和分化的不同阶段发挥着一定的作用。