抗癌免疫核酸制剂中核酸生物活性的参考指标

目的：拟建立一种抗癌免疫核酸生物活性的相对参考指标。方法：用癌细胞与细菌共同致敏动物到相当滴度后，提取之抗癌兼抗菌的免疫核酸制剂，用此保护小鼠后，再用细菌攻击。结果：免疫核酸保护组动物存活率明显高于对照组。说明免疫核酸制剂在制备过程中抗菌部分的核酸有相当多的分子没有降解失活，所以能表现出明显的抗菌活性。因此同一制剂中同时存在的抗癌核酸也应保留有相当多的分子不降解失活。另外，我们的动物实验也证实了免疫核酸制剂有明显的抑制肿瘤生长的作用。结论：试用免疫核酸制剂的抗菌活性作为其抗癌活性的相对参考指标，看来是有意义的     

单纯疱疹病毒壳膜蛋白22增强人巨细胞病毒糖蛋白B核酸疫苗免疫效果的体内生物学活性

人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)是造成先天畸形的主要病原体,HCMV糖蛋白B(glycoprotein B,gB)为HCMV最重要的一种膜糖蛋白,在病毒感染及诱发机体免疫反应中起着重要作用;单纯疱疹病毒壳膜蛋白22(tegument viral protein 22,VP22)是单纯疱疹病毒的一种结构蛋白,具有很强的细胞间转移作用,可将与其融合的蛋白分子高效带入邻近细胞,提高基因转移效果.本研究拟将HCMV gB基因与VP22基因连接在一起,以增加抗原与宿主免疫系统接触的机会,制备HCMV核酸疫苗,并研究其在小鼠体内的免疫活性.     

SARS相关冠状病毒M基因片段的克隆及其DNA疫苗诱导的体液免疫

目的：构建含有SARS相关冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS—CoV)M基因片段的核酸疫苗，观察其免疫小鼠后病毒特异性抗体产生情况。方法：将合成的M基因片段克隆到核酸疫苗真核表达载体pVAX1中，免疫小鼠后，用SARS—CoV抗体ELISA检测试剂盒定期检测免疫小鼠血清中抗SARS—CoV的病毒特异性抗体水平。结果：构建了重组核酸疫苗质粒pVCo—M，免疫小鼠后可诱导产生出病毒特异性抗体。结论：以M为抗原基因的DNA疫苗能诱导SARS病毒特异性抗体，为进一步改进或探索同类DNA疫苗提供有益启示。     

汉坦病毒包膜糖蛋白基因核酸免疫的初步研究

目的将克隆有汉坦病毒包膜糖蛋白基因M片段及G1、G2基因的重组质粒免疫动物，了解上述目的基因在核酸疫苗中的应用价值。方法大量制备已构建好的pcDNA3．1-M、pcDNA3．1-G1、pcDNA3．1-G2重组质粒DNA及对照空质粒pcDNA3．1。然后用这四组质粒DNA通过肌肉注射的方法免疫6～8周龄的BALB／c小鼠（每组5只），每4周免疫一次，共免疫3次，每次免疫前及最后一次免疫后2周断尾取血，用免疫荧光的方法检测基因免疫的体液免疫应答效果。结果重组质粒pcDNA3．1-G1免疫小鼠有4只血清抗汉坦病毒抗体为阳性，重组质粒pcDNA3．1-G2以及重组质粒pcDNA3．1-M免疫小鼠各有1只血清抗汉坦病毒抗体为阳性。结论汉坦病毒糖蛋白基因核酸免疫动物后可刺激机体产生特异性的体液免疫应答。     

乙肝核酸疫苗pCI/S2S接种小鼠后的免疫应答研究

目的 构建乙肝核酸疫苗pCI/S2S,研究其接种小鼠后,接种局部肌肉特异性抗原蛋白的表达以及所诱生的免疫应答反应.方法 从慢性乙肝患者的混合血清中制备HBV DNA模板,扩增出基因片段S2S,与pCI载体进行连接,得到重组质粒pCI/S2S.将其肌肉注射接种BALB/c小鼠,在不同的时间点检测血清中抗-HBs及抗-preS2;并于第12周时用细胞毒性检测试剂盒(LDH)检测体外细胞毒性T细胞(CTL)活性,同时以免疫组织化学法检测小鼠接种部位HBsAg的表达.结果 小鼠肌肉接种pCI/S2S完成后1周血清抗-HBs、抗-preS2开始阳转,阳转率于6周或8周达高峰,且能诱生特异性CTL应答.此外,免疫组织化学法能在小鼠的接种局部肌细胞中检测出目的抗原蛋白的表达.结论 乙肝核酸疫苗pCI/S2S接种小鼠后,能在小鼠体内诱生特异性的体液免疫和细胞免疫应答.     

乙肝表面抗原核酸疫苗的构建及其与宿主染色体整合的可能性分析

目的：构建乙肝表面抗原DNA疫苗，并探讨其在实验动物体内整合到宿主细胞基因组上的可能性。方法：采用PCR法扩增乙肝病毒的S基因片段后装入pVAX载体，并以此为修选疫苗免疫（BALB/c）小鼠，在不同时间、不同部位取其组织抽提基因组DNA，用PCR检测DNA整合情况。结果：构建了乙肝核酸疫苗pVAX-HBsAg。免疫接种该疫苗第3周时在小鼠肌肉、肝脏、脾脏、胸腺均有不同量的游离质粒存在；第6周除在股四头肌可检测到外，其余组织中均为阴性；第12、18周时检测所有组织中均为阴性。结论：构建的pVAX-HBsAg DNA疫苗在小鼠体内无染色体整合。     

乙肝核酸疫苗NV-HB/s接种小鼠的免疫反应

目的　研究乙型肝炎核酸疫苗 NV- HB/s经肌肉注射、皮下注射、转化伤寒杆菌 CVD90 8后再经口服等不同途径接种小鼠后 ,小鼠产生体液免疫应答的规律 ,以及磷酸钙在提高核酸疫苗免疫效能中的作用。方法用自制的乙肝核酸疫苗、佐剂化乙肝核酸疫苗及口服疫苗 ,以不同接种途径免疫小鼠 ,分别检测小鼠外周血中的HBs Ag及抗 HBs;肌肉组织标本中的疫苗质粒以及 C- m yc m RNA。结果　肌注 NV- HB/s 3天后 ,在接种部位检出了 HBs Ag;1月后外周血中检出了抗 HBs。肌注与皮下注射对 NV- HB/s的免疫效能无显著影响 ;口服接种所诱生的抗 HBs阳转率及滴度低于肌肉注射与皮下注射。磷酸钙处理可降低核酸疫苗的用量 ,增加其安全性。结论　乙肝核酸疫苗 NV- HB/s能有效地诱导小鼠产生抗 HBs;在免疫后 6个月内 ,质粒的注入未见癌基因的激活     

密码子优化对乙肝病毒表面抗原中蛋白核酸疫苗免疫原性的影响

目的:观察密码子优化能否增强乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白核酸疫苗的免疫原性.方法:根据乙型肝炎病毒(adr亚型)表面抗原中蛋白(MHBs)的氨基酸序列,在不改变其氨基酸序列的基础上,设计并人工合成了密码子优化的基因,并将该基因克隆到核酸疫苗载体pSW3891中,构建了密码子优化的表达MHBs核酸疫苗(命名为:pSW3891/MHBs/adr/opt,简称opt).用上述核酸疫苗与表达野生型MHBs核酸疫苗(命名为:pSW3891/MHBs/adr,简称adr)及空载体质粒pSW3891一起瞬时转染293T细胞,应用蛋白质印迹法检测转染细胞中MHBs的表达.采用肌肉注射法,以opt、adr及pSW3891,分别对BALB/c小鼠进行免疫.用EIJSA方法检测免疫后小鼠血清中HBs抗体的滴度,ELISPOT法检测免疫小鼠表面抗原特异性分泌IFN-γ的脾细胞.结果:opl和adr均可在体外293T细胞中高效表达,且opt的蛋白表达量要高于野生型.opt免疫组小鼠特异性抗体滴度和免疫小鼠表面抗原特异性分泌IFN-γ脾细胞数量都要显著的高于adr免疫组小鼠.结论:密码子优化可以增强乙型肝炎病毒DNA疫苗在体外的蛋白表达量及免疫小鼠的体液免疫和细胞免疫原性.     

乙型肝炎核酸免疫的研究进展

核酸免疫（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）是指将编码抗原蛋白基因序列的表达载体，用物理方法直接导入动物体内，以诱导特异性的免疫应答。核酸免疫已用于多种病毒的实验研究，包括流感病毒、艾滋病病毒、淋巴细胞脉络丛脑炎病毒、狂犬病毒、乙型肝炎病毒等。乙型肝炎是世界范围内严重危害人类健康的一种传染病，对其感染及发病的控制有赖于获得安全有效并且价廉的新疫苗。核酸疫苗的使用为解决此问题带来可     

人乳头瘤病毒、疱疹病毒Ⅱ型及人巨细胞病毒与宫颈癌关系的研究

用人乳头瘤病毒(HPV)16,18,11型、疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)N/BglⅡ,L/HindⅢ片段和人巨细胞病毒(HCMV)DNA等6个核酸探针,通过分子杂交技术对宫颈疾患活检标本进行了检测和分析,结果在同一标本中未发现3种病毒DNA均阳性者,但宫颈癌标本中46%HPV和HCMV DNA同时存在,2例HSV-2 DNA阳性的宫颈癌标本中有1例同时存在HCMV DNA。提示宫颈癌的病毒病因是多因素的,HPV,HSV-2和HCMV均可能有关,在宫颈癌发生过程中3者之间可能有某些内在联系。     

随机扩增多态DNA技术在地高辛标记HCMV DNA探针中的应用研究

应用ＲＡＰＤ－ＰＣＲ技术结合地高辛非放射性标记系统制备了人巨细胞病毒ＤＮＡ探针，并与常规随机引物法进行对照。ＲＡＰＤ－ＰＣＲ制备的ＨＣＭＶＤＮＡ探针长度呈多态性，扩增过程中不需合成特异引物，探针特异性强，产量高，用５０ｎｇＨＣＭＶＤＮＡ模板即可制备８．０μｇ探针；标记体系中ＲＡＰＤ－ＰＣＲ方法Ｄｉｇ－ｄＵＴＰ浓度为５．２％。表明ＲＡＰＤ－ΡＣＲ技术可用于少量ＤＮＡ模板制备大量ＤＮＡ探针，适用于原位杂交等需高浓度探针的核酸杂交及临床大量标本的测试，是一种经济方便的探针制备技术     

核酸杂交法检测分娩期妇女血及新生儿尿中HCMVDNA

以地高辛标记人巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）ＤＮＡＪ序段为探针，用核酸杂交法检测南通地区７８３例分娩期妇女血标本，ＨＣＭＶ　ＤＮＡ阳性者６１８例，感染率为７８．９３％；检测６９１例出生后１周内新生儿尿标本，ＨＣＭＶＤＮＡ阳性者４５例，排毒率为６．５１％；其中３３５对母婴中ＨＣＭＶ　ＤＮＡ同时阳性者３９例，垂直传播率为１０．９９％。本文结果证明了ＨＣＭＶ感染的普遍性和严重性，垂直传播是新生儿先天性ＨＣＭＶ感染的重要途径。     

干扰灵联合免疫核糖核酸治疗慢性乙肝疗效分析

采用干扰灵联合抗乙肝免疫核糖核酸治疗慢性乙肝２６例，并与１８例对照组比较。结果表明：治疗结束时，ＨＢｓＡｇ转阴率１５４％（４／２６），ＨＢｅＡｇ转阴率７７２％（１７／２２），ＨＢＶＤＮＡ转阴率５７７％（１５／２６），明显高于对照组（Ｐ＜０．０１）；随访一年１例患者ＨＢｅＡｇ、ＨＢＶＤＮＡ转阴，２例患者ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ、ＨＢＶＤＮＡ转阴后变阳，其有效率仍显著高于对照组（Ｐ＜０．０１）。上述结果表明：干扰灵联合抗乙肝免疫核糖核酸疗法能明显抑制ＨＢＶ复制，提高抗病毒疗效。本文并对影响抗病毒疗效的诸多因素进行了分析。     

免疫核糖核酸体外介导白细胞粘附抑制反应中转录和翻译的意义

以[~3H]Leu-LAI为指标,观察放线菌素D和嘌呤霉素对小鼠S_(180)腹水瘤细胞特异性iRNA体外转移细胞免疫活性的影响。结果表明,正常小鼠脾淋巴细胞经iRNA致敏后,用放线菌素D阻断其转录,或用嘌呤霉素阻断其翻译,并不能使该淋巴细胞失去对相应抗原产生LAI反应的能力;若先将淋巴细胞分别与放线菌素D或嘌呤霉素温育,使转录或翻译被阻断后再用iRNA作用时,见对相应抗原无LAI反应。这些结果说明iRNA体外介导LAI反应的过程,必须有受体细胞的转录或翻译功能参与;同时也提示临床使用iRNA治疗恶性肿瘤时,先行治疗方法若能抑制淋巴细胞的转录或翻译,则有可能降低iRNA的疗效,     

大鼠内耳组织微量核酸的提取及PCR扩增

分别用提质粒法，SDS-蛋白酶K法，TRIZOL法提取大鼠内耳组织微量核酸，对所提核酸进行紫外吸收光谱分析及PCR扩增。结果表明，提质粒法可制备不含核DNA的线粒体DNA；SDS-蛋白酶K法可制备总DNA；TRIZOL法可同时制备总DNA和总RNA。     

不同蛋白含量饮食对糖尿病大鼠肾组织核酸含量的影响

将糖尿病鼠随机分成三组,分别饲以7%,20%和40%的蛋白质饮食一个月,结果发现7%组肾组织内核酸含量及RNA/DNA比率明显降低,而40%组则明显增加。提示蛋白质摄入量可以影响糖尿病大鼠肾组织内核酸的代谢,从而影响肾脏结构和功能。     

云南森林脑炎病毒核酸的提纯及其性质研究

通过蜱传脑炎病毒复合群和云南森林脑炎病毒核酸基本性质的研究，建立了病毒核酸的提纯方法，为今后的试验打下了基础。比较蜱传脑炎病毒复合群中的中国东北株ＲＳＳＥ与云南森林脑炎病毒的电泳图谱，发现它们基本处于同一位置。     

人巨细胞病毒对脐血多向祖细胞体外生长的影响及干预研究

目的探讨人巨细胞病毒(HCMV)对脐血多向造血祖细胞(CFU-Mix)体外增殖的影响及黄芪对此的保护作用.方法采用甲基纤维素半固体培养技术,培养、观察、计数HCMV-AD169感染的CFU-Mix集落数、抑制率、集落峰值及集落维持时间;用聚合酶链反应(PCR)和荧光定量PCR技术检测集落细胞内HCMV-AD169DNA.在110感染组中加入黄芪,观察黄芪对HCMV-AD169感染的CFU-Mix集落增殖抑制的干预作用.结果 HCMV-AD169感染的CFU-Mix集落数较对照组明显减少(P＜0.05),集落数随病毒感染滴度的增高而减少,抑制率随病毒感染滴度的增高而逐渐增加;感染组集落维持时间较对照组明显缩短(P＜0.01),但各组集落峰值出现时间无明显差异(P＞0.05);用PCR技术在感染组集落细胞内检测到HCMV-AD169DNA;在110感染组中加入黄芪后,CFU-Mix集落数明显提高,集落增殖提高率为38.9%,集落维持时间较110感染组明显延长(P＜0.01),荧光定量PCR技术检测集落细胞内HCMV-DNA copies较110感染组明显减少.结论在体外HCMV-AD169对CFU-Mix生长和集落形成有明显的抑制作用,HCMV能直接感染多向造血祖细胞,此可能与临床HCMV感染引起贫血、血小板减少和粒细胞减少有关;黄芪在体外有明显的抗HCMV作用.     

用脱脂奶粉代替小牛胸腺DNA进行核酸分子杂交

本文应用脱脂奶粉代替小牛胸腺DNA等大分子物质配制预杂交液和杂交液进行核酸分子杂交,同时用经典的含小牛胸腺DNA等大分子物质的预杂交液和杂交液作为对照。结果表明,用脱脂奶粉可以代替小牛胸腺DNA等大分子物质进行核酸分子杂交,此法经济,配制简便,实际可用。     

DETECTION OF HUMAN CYTOMEGALOVIRUS INFECTION BY DNA-DNA HYBRIDIZATION

A rapid detection method has been established to identify human cytomegalovirus (HCMV) in specimens of urine and white blood cells with use of DNA-DNA hybridization technology. Since radioactive labels should be avoided if possible, the DNA-DNA hybridization procedure has also been modified to employ biotin labelled probe. Preliminary experiments for sensitivity and specificity showed that hybridization with the probe HCMV DNA EcoRI J fragment could detect 0.9 pg (~(32)P-probe) or 90 pg (biotin-probe) homologous DNA; 60 cells (~(32)P-probe) or 325 cells (biotin-probe) of HCMV infected fibroblasts, and 0.3125 TCID_(50) HCMV-AD_(169). The labelled probe failed to hybridize to DNA from ather herpesviruses, uninfected human lung fibroblasts and human placental DNA. Some specimens have been detected for HCMV by DNA hybridization with ~(32)P-probe. Of 76 urine specimens and 46 white blood cell specimens from 51 newborn infants with clinically suspected cogenital HCMV infection, 11 (12%) and 9 (19%) were positive for HCMV DNA, respectively. Of 11 white blood cell specimens from normal women of childbearing age and 47 white blood cell specimens from blood donors, 6 (55%) and 30 (63%) were positive for HCMV DNA, respectively.