小球藻多糖对人树突状细胞成熟的作用和机制研究

目的：探讨小球藻多糖（PFC）对人树突状细胞（DC）的成熟作用及其相关机制的初步研究。方法：使用纯化后的PFC对外周血单核细胞来源的不成熟DC进行干预，使用流式细胞术检测PFC干预后DC表面CD83和CD86表达变化，利用酶联免疫法（ELISA）检测细胞因子IL-6、TNF-α和IL-10水平的变化；继而通过比较PFC处理组和对照组的转录谱基因表达差异及通路富集分析，寻找其作用途径，并使用相关分子通路抑制剂进行初步验证。结果：PFC可上调DC表面CD83和CD86的表达，促进DC细胞因子IL-10的释放；生信分析结果提示PFC可能通过Toll样受体2/4(TLR2/4)发挥作用，利用TLR2和TLR4通路抑制剂下调了PFC诱导的DC CD86表达。其中TLR4抑制剂干预后CD86表达水平显著下降（P<0.05）。结论：PFC可能通过TLR2和TLR4通路上调人外周血单核细胞来源DC表面标志物CD83和CD86表达水平的提高，从而促进DC成熟。     

TLR4 mAb对人正常肝内胆管上皮细胞LPS-TLR4-NF-κB通路的影响

目的对脂多糖( LPS)及Toll样受体4单克隆抗体( TLR4 mAb)作用于体外培养的人肝内胆管细胞( HiBEC)后其TLR4 mRNA和核转录因子-κB( NF-κB) mRNA的表达情况进行了研究。方法体外培养HiBEC,采用 RT-PCR 法检测经LPS和不同浓度的TLR4 mAb作用后,HiBEC细胞株中TLR4 mRNA和NF-κB mRNA的表达情况。结果 LPS可以上调HiBEC中TLR4 mRNA和NF-κB mRNA的表达( P<0．05);而 LPS 作用于 TLR4 mAb 处理后的 HiBEC 中其TLR4 mRNA和NF-κB mRNA的表达下调;高质量浓度TLR4 mAb使NF-κB mRNA的表达下调更明显( P<0．05)。结论LPS 能上调HiBEC中TLR4 mRNA和NF-κB mRNA的表达;而 TLR4 mAb 则能拮抗 LPS 对 HiBEC 的刺激作用,下调TLR4 mRNA和NF-κB mRNA 的表达。     

脂多糖及TOLL样受体4阻断剂对蜕膜细胞中孕激素受体、IL-1β及COX-2的影响

目的:研究脂多糖(LPS)或拮抗剂TOLL样受体4阻断剂(Toll-like receptor 4 antagonist,TLR4 mAb)作用于体外培养的蜕膜细胞后其孕激素受体(progesterone receptor,PR)、IL-1β及COX-2的表达改变,以探讨LPS及其拮抗剂对蜕膜细胞中PR的影响,以及PR与炎症因子之间的关系。方法:分离培养早孕人蜕膜细胞,将细胞培养至第4代时随机分为6组,对照组:仅加培养液。研究1组:加入终质量浓度为100 ng/mL的LPS。研究2组:加入终质量浓度为1 μg/ mL TLR4 mAb。研究3组:加入终质量浓度为3 μg/mL TLR4 mAb。研究4组:终质量浓度为1 μg/mLTLR4 mAb预处理24 h,再加入质量浓度为100 ng/mL的LPS。研究5组:终质量浓度为3 μg/mL TLR4 mAb预处理24 h,再加入质量浓度为100 ng/mL的LPS。均培养24 h 后,采用RT-PCR半定量技术检测蜕膜细胞中PR,IL-1β及COX-2mRNA的表达情况。结果: LPS使蜕膜细胞中PR mRNA的表达下调(P<0.05),使IL-1β和COX-2 mRNA的表达上调(P<0.05);TLR4 mAb则使LPS作用后的蜕膜细胞中PR mRNA的表达上调(P<0.05)、IL-1βmRNA的表达下调(P<0.05);高质量浓度TLR4 mAb使COX-2 mRNA的表达下调(P<0.05)。结论:LPS作用于体外培养的人蜕膜细胞后,PR mRNA表达下调;IL-1β,COX-2的mRNA表达增加;使用TLR4 mAb后能拮抗LPS对蜕膜细胞中PR,IL-1β以及COX-2的作用。     

Toll样受体2/4-核因子κB信号通路在人结核分枝杆菌侵入小鼠树突细胞2.4中的作用

目的：研究人结核分枝杆菌侵入抗原提呈细胞后诱导树突细胞（DC）成熟的机制。方法：选择小鼠DC2.4细胞株为抗原提呈细胞的效应细胞,建立人结核分枝杆菌H37Rv株的细胞混合培养模型。在不同混合培养时段,采用实时荧光定量PCR检测DC2.4细胞Toll样受体2（TLR2）、TLR4 mRNA的表达量;蛋白质印迹法检测DC的核因子κB(NF-κB)p65蛋白的表达;免疫酶联吸附试验定量检测DC产生α肿瘤坏死因子（TNF-α）的水平;采用间接免疫荧光法和流式细胞术检测DC2.4表面CD80和CD86的表达情况。结果：H37Rv与DC2.4共培养2 h后开始有细菌侵入;共培养 6、8、10、12 h后,细菌侵入率分别为(37.9±5.6)%、(512±7.6)%、(57.2±8.9)%、(639±12.4)%;TLR2、TLR4 mRNA也开始增量,共培养10 h时达高峰,之后开始下降;共培养6 h时,NF-κB p65的表达量明显增高;TNF-α的表达量在共培养6 h开始上调,8 h时达高峰,随后逐渐下降;共培养6 h时,DC2.4表面CD80、CD86表达量明显增高。结论：人结核分枝杆菌侵入DC2.4时,通过激活TLR2/4-NF-κB信号通路,诱导DC成熟,提高其抗原提呈能力。     

猪苓多糖经TLR4刺激小鼠骨髓来源的树突状细胞成熟

目的：研究猪苓多糖（polyporus polysaccharides,PPS）诱导小鼠骨髓树突状细胞（dendriticcell,DC）表型及功能成熟的分子机制。方法：从小鼠骨髓中分离单个核细胞（MNC）,用rmGM-CSF、IL-4培养5 d后将其分为三组：实验组中加入50μg/mL PPS;阳性对照组中加1μg/mL LPS;加等量RPMI 1640培养基作为阴性对照组,继续培养48 h。苏木精-伊红（HE）染色观察细胞形态;流式细胞仪（FACS）分析DC表面CD80、CD86及MHC II（I-A/I-E）表达情况;经20μg/mL Toll-like receptor（TLR）4、TLR2单抗作用1 h后,ELISA法检测培养上清中IL-12 p40含量;混合淋巴细胞反应（MLR）检测DC对T淋巴细胞的刺激能力。结果：PPS处理的DC具有毛刺状突起,呈典型的DC形态;细胞表达MHC II、CD80及CD86增加;对T淋巴细胞刺激能力增强;分泌IL-12增加且可被抗TLR4单抗所阻断。结论：PPS通过TLR4促进体外培养的小鼠骨髓DC表型与功能成熟。     

脂多糖通过TLRs信号途径诱导树突状细胞成熟机理初探

目的探讨脂多糖(LPS)通过TLRs信号途径进一步促进人外周血单核细胞来源树突状细胞(DC)成熟的机理。方法从外周血分离单核细胞,加入rhGM-CSF及rhIL-4,在培养的第6d,实验组加入LPS刺激24h,对照组不加。分别提取细胞总RNA,行半定量RT-PCR,产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。激光扫描共聚焦显微镜检测DC内NF-κB表达情况。结果单核细胞经GM-CSF及IL-4诱导7d后的DC表达较高水平TLR2、3、4。LPS刺激24h后,TLR2、3、4表达下降,TLR4几乎测不到。激光扫描共聚焦显微镜检测到,未刺激组DC胞浆染色阳性,胞核为阴性。LPS刺激组的细胞核染色为强阳性,胞浆染色为阳性。结论DC在受LPS刺激前后TLRs的表达有显著变化,NF-κB也从胞浆移位至核内。这标志着经LPS刺激后DC在功能上进一步成熟。为下一步研究DC的功能奠定了基础。     

细菌脂多糖对人外周血单核细胞来源的树突状细胞发育和功能的影响

目的 :探讨细菌脂多糖 (LPS)对正常成人外周血单核细胞来源的树突状细胞 (Dendritic cell,DC)表面分子表达及免疫功能的影响。方法 :分离正常人 (n=5 )外周血单个核细胞 (PBMC)以 GM-CSF、IL-4联合诱生 DC,实验组在培养的第 2天加入LPS,正常对照组不加。于第 4、8天 FACS检测 DC表面分子 CD1a、CD14、CD83、CD80、HL A-DR的表达。同期检测 DC的增殖和刺激同种异体 T淋巴细胞的增殖情况。结果 :经 LPS刺激后 ,正常人 DC早期、晚期表面分子 CD1a、CD83、CD80表达增高 ,CD14表达降低 (P<0 .0 5 )。DC数量的增加及刺激同种异体 T细胞能力明显增强。结论 :GM-SF、IL-4和 L PS联合刺激能促进正常人 DC的成熟和免疫功能的提高     

昆布多糖对OX-LDL诱导的单核细胞源性树突状细胞成熟的影响

目的：研究昆布多糖对OX-LDL诱导的单核细胞源性树突状细胞（DC）成熟的影响。方法：采用密度梯度离心法分离出正常人外周血单核细胞,经由含重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF,20ng/mL）和重组人白介素4（rh IL-4,20ng/mL）的DC无血清培养基中培养,培养至第5天均加入OX-LDL（100μg/mL）。第6天将实验组分成三组,分别加入昆布多糖5μg/mL,2.5μg/mL,0.5μg/mL;对照组加入PBS。待DC与昆布多糖共同孵育24 h后,镜下观察DC形态变化,同时收集DC细胞采用流式细胞术检测DC表型（CD86,TLR2）的表达。结果：与PBS对照组相比较,实验组TLR2的表达明显上调（P〈0.05）;CD86的表达下调,各组间差异具有统计学意义（P〈0.05）,与刺激因素昆布多糖存在剂量依赖。结论：昆布多糖干预培养后,外周血单核细胞源性DC的TLR2表达上调,CD86的表达下调,进而推测昆布多糖可以抑制DC的成熟。     

罗格列酮对脂多糖作用下及高糖对大鼠腹膜间皮细胞TLR2 mRNA表达的影响

目的观察罗格列酮对脂多糖(LPS)作用下大鼠腹膜间皮细胞(RPMC)toll样受体2(TLR2)mRNA表达的影响;观察高糖对RPMC的TLR2mRNA表达的影响。方法胰蛋白酶法行RPMC的原代培养和传代,经鉴定第3代细胞融合至80%时分组。正常对照组:不同浓度LPS(1,10,100μg/ml)作用8h组;10μg/mlLPS作用不同时间(2,6,12h)组;10μg/mlLPS预孵育2h后,加入罗格列酮(10μmol/L)再作用4h组;不同浓度葡萄糖(1.5%,2.5%,4.25%)作用8h组;2.5%葡萄糖作用不同时间(5,10,20h)组。RT-PCR技术检测TLR2mRNA的表达。结果LPS及高糖均可刺激RPMC的TLR2mRNA表达显著增加,呈剂量依赖性(P<0.05),并且LPS作用下RPMC的TLR2mRNA表达增加在12h内呈时间依赖性(P<0.05),高糖作用下RPMC的TLR2mRNA表达增加在20h内呈时间依赖性(P<0.05);罗格列酮可抑制由LPS刺激导致的TLR2mRNA表达上调(P<0.05)。结论LPS及高糖可上调体外培养RPMC的TLR2mRNA表达,罗格列酮可拮抗LPS对TLR2mRNA的表达上调作用。     

伯氏疟原虫T细胞免疫调节蛋白的表达及其对DC2.4的作用

目的 应用原核载体表达PbTIP胞外重组蛋白片段（rPbTIP）并在体外刺激树突状细胞DC2.4,研究在体外PbTIP片段蛋白对DC2.4细胞是否有一定的免疫调节功能。方法 用实验室保存的含有pET32a（+）-rPbTIP 载体的 E. coil BL-21 菌株表达并纯化rPbTIP蛋白;然后在体外培养的DC2.4细胞中加入不同浓度的rPbTIP蛋白刺激,应用细胞增殖实验检测rPbTIP对DC2.4细胞是否有促进增殖的作用;对 rPbTIP刺激后的DC2.4细胞进行RT-PCR检测,分析DC2.4细胞表面分子MyD88、NF-κB、TLR9、TLR4的mRNA含量变化;rPbTIP刺激DC2.4后,应用ELISA法检测细胞培养上清中TNF-α、IL-10、TGF-β和IFN-γ细胞因子水平。结果 成功表达出rPbTIP蛋白,纯化后蛋白浓度为1 mg/mL; 1 ng/mL的rPbTIP对DC2.4细胞有一定促进增殖作用,并且细胞培养上清中TNF-α水平明显升高,有统计学意义（P<0.05）,其他细胞因子水平变化无统计学意义（P>0.05）;100 ng/L的rPbTIP对DC2.4细胞可能有一定抑制作用,并且可以上调DC2.4表面MyD88、NF-κB、TLR9 mRNA含量。结论 在体外,rPbTIP蛋白对DC2.4细胞的免疫功能具有一定的调节作用,不同浓度rPbTIP蛋白的作用可能不同,需要进一步研究。     

小鼠可溶性CD83-Ig对树突状细胞产生IL-12的影响

目的:探讨小鼠可溶性CD83-Ig对树突状细胞(DC)产生白细胞介素-12(IL-12)的影响。方法:将表达小鼠CD83胞外功能区与人IgG1αFc融合蛋白(CD83-Ig)的真核表达载体pmCD83-Ig转染COS-7细胞,表达可溶性CD83-Ig融合蛋白,并将该载体转染DC细胞系(DC2.4),筛选稳定表达CD83-Ig的细胞系。采用LPS刺激DC2.4,借助RT-PCR和ELISA法分别检测DC2.4IL-12mRNA的表达和细胞培养上清中IL-12的水平,观察CD83-Ig对DC2.4表达IL-12的影响。结果:可溶性CD83-Ig处理DC细胞组和CD83-Ig基因转染DC细胞组IL-12mRNA的表达和上清液中IL-12水平显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:CD83-Ig可抑制LPS刺激DC产生IL-12,可能是CD83-Ig负调节DC活性的重要机制。     

Lipopolysaccharide upregulates the expression of Toll-like receptor 4 in human vascular endothelial cells

目的：探讨内皮细胞TLR2和TLR4的表达以及内毒素对其表达的影响。方法：按RNA提取试剂盒说明书提取内毒素作用后的ECV-304(人脐静脉内皮细胞株)和人脐静脉内皮细胞总RNA,运用逆转录PCR(RT-PCR)检测细胞TLR2和TLR4mRNA的表达。结果：人脐静脉内皮细胞和ECV304细胞株均能表达TLR2和TLR4mRNA,但是,TLR4的表达水平明显强于TLR2的表达,LPS能明显上调TLR4的表达,但对TLR2的表达无影响。结论：本研究提示TLR4能明显上调LPS作用的信号转导分子,在LPS对内皮细胞的激活效应中具有重要的作用;ECV-304是内皮细胞研究的良好的实验模型,可代替人脐静脉内皮细胞而较为广泛应用。     

尿酸刺激树突状细胞成熟与Toll样受体mRNA表达关系的研究

目的 观察未成熟树突状细胞（DC）经尿酸刺激成熟过程中,TLRs mRNA的表达情况。方法 分离培养小鼠骨髓来源未成熟 DC。以尿酸体外刺激48 h后,RT-PCR方法检测DC TLR2 mRNA、TLR3 mRNA、TLR4 mRNA 、IL-12p70 mRNA等的表达,ELISA法检测上清IL-12P70水平。尿酸及NF-κB抑制剂PDTC刺激不同时间点时,免疫印迹法检测DC NF-κB p65活化情况。结果 尿酸刺激后DC TLRs mRNA 表达出现明显的变化,与培养基对照组相比,TLR2 mRNA、TLR3 mRNA、TLR4 mRNA表达下降（P＜0.05）,以TLR4 mRNA下降最明显;IL-12p70表达显著增高（P＜0.05）;与LPS组相比,TLRs mRNA 与IL-12p70表达水平相似（P＞0.05）。尿酸刺激后15～45 min,DC核因子NF-κB p65显著活化。结论 尿酸能调节未成熟树突细胞 TLR2 mRNA、TLR3 mRNA、TLR4 mRNA及IL-12 p70的表达,促进NF-κB向核内转移,促进DC成熟。TLRs mRNA的动态变化可能为其诱导 DC 成熟及免疫功能提高的机制之一。     

DC2.4表面分子与RelB基因表达的关系

目的 探讨DC2.4表面分子表达水平与RelB基因表达间的关系.方法 用RPMI 1640完全培养液培养DC2.4细胞系,光学显微镜观察培养细胞的形态特征;透射电镜观察DC2.4的细胞结构;流式细胞术分析DC2.4的表面标记(MHC-Ⅱ、CD86和CD40);RT-PCR检测DC2.4的RelB表达水平.结果 光镜观察DC2.4细胞表面有明显的树突状突起,形态极不规则;透射电镜显示DC2.4细胞内含许多质地均匀的脂滴,可见吞噬小泡样的结构.流式细胞术显示MHC-Ⅱ类分子和CD40呈低水平表达,而CD86分子却呈高水平表达;RT-PCR结果显示RelB呈低水平表达,与骨髓源性DC中的未成熟状态DC的RelB表达水平接近.结论 DC2.4具有强吞噬功能,其表面CD40分子和细胞内RelB基因均呈低水平表达,提示DC2.4是一种未成熟状态的细胞系.     

瑞巴匹特抑制脂多糖诱导肺上皮细胞株A549表达TLR4和释放TNF-α

目的：研究瑞巴匹特对肺上皮细胞株A549 细胞TLR4表达及分泌肿瘤坏死因子（TNF-α）的影响。方法：用脂多糖(LPS)建立体外A549 细胞体外炎症损伤模型,实验分为对照组（无干预无刺激）、模型组（LPS刺激）、干预组1（LPS和10 mg/L瑞巴匹特）、干预组2（LPS和30 mg/L瑞巴匹特）、用ELISA观察A549细胞分泌TNF-α和RT-PCR及蛋白免疫印迹观察A549 细胞TLR4的表达。 结果：LPS诱导A549 细胞分泌TNF-α（与对照组比较,P＜0.01）, 在第6 h达高峰;LPS诱导A549 细胞表达TLR4（与对照组比较,P＜0.01）;瑞巴匹特可抑制LPS诱导A549 细胞分泌TNF-α和表达TLR4（与模型组比较,P＜0.05）,但2组干预组间无统计学差异（P＞0.05）。 结论：瑞巴匹特的抗炎机制可能是通过抑制TLR4的表达,从而减少炎性细胞因子的释放;瑞巴匹特有可能作为一种有价值的抗感染治疗的辅助药物。     

细菌脂多糖、脂蛋白和DNA对小鼠肺泡巨噬细胞体外激活的协同作用

目的 通过体外实验,从受体水平观察细菌脂多糖(LPS)、细菌脂蛋白(BLP)和细菌DNA对肺泡巨噬细胞的协同刺激效应及其可能机制。方法 分离培养小鼠肺泡巨噬细胞,随机将细胞分为7组,分别为LPS组、CpG-ODN组、BLP组、LPS CpG-ODN组、LPS BLP组、LPS CpG-ODN BLP组和培养基对照组。刺激6h后,收集上清和细胞,上清用于TNF-α检测,细胞用于提取总RNA,通过RT-PCR检测主要模式识别受体(PRRs)CD14、SR、TTLR2、TLR4,TLR9的表达。结果 LPS、BLP和CpG-ODN不仅体外能协同增加肺泡巨噬细胞释放TNF-α等细胞因子,而且具有协同增强效应细胞表面模式识别受体的表达,以三者同时存在时,协同作用最强。结论 细菌内毒素、细菌脂蛋白和细菌DNA在体外不仅能上调相互的模式识别受体,而且具有协同增强其他细菌结构成分对相应受体的刺激作用。     

红树林淡紫拟青霉胞外多糖对小鼠DCs吞噬功能的影响

目的 探讨红树林来源的淡紫拟青霉胞外多糖对小鼠骨髓源性树突细胞(DCs)功能成熟的影响.方法 从小鼠骨髓腔中分离获得骨髓细胞,加入重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)、重组小鼠白细胞介素-4(rmIL-4)诱导分化为未成熟DCs,用不同浓度淡紫拟青霉胞外多糖干预,流式细胞术检测DCs的表面标志CD11c、主要组合相容性复合体(MHCⅡ)类分子、CD80、CD86的表达情况及吞噬葡聚糖(FITC-dextran)的能力,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测该多糖对DCs Toll样受体(TLR)2 mRNA和TLR4 mRNA表达的影响.结果 经300、400 μg/mL多糖作用48 h后DCs表面分子CD11c、MHCⅡ类分子、CD80、CD86的表达较空白对照组显著上调(P＜0.01);经多糖作用的DCs吞噬FITC-dextran能力下降,尤其是300、400μg/mL的多糖与空白对照组相比作用效果明显(P＜0.05);另外,该多糖还可下调DCs TLR2 mRNA和TLR4 mRNA的表达,尤其经100～400μg/mL多糖处理的DCs下调作用显著,与空白对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05).结论 淡紫拟青霉胞外多糖可上调小鼠骨髓源性未成熟DCs表面CD11c、MHCⅡ类分子、CD80和CD86的表达,降低其吞噬能力,下调TLR2 mRNA和TLR4 mRNA的表达,初步表明该多糖可刺激DCs分化成熟.