系统性红斑狼疮血管炎相关自身抗原的血清学筛选

目的 通过重组cDNA表达文库的血清学分析(SEREX)技术获得系统性红斑狼疮(SLE)血管炎相关自身抗体所对应自身抗原的cDNA序列.方法 收集SLE病人血清作为筛选血清,采用SEREX技术筛选人微血管内皮细胞(HMVEC)cDNA文库.结果 通过两轮筛选获得11个阳性克隆.通过生物信息学分析发现这11个阳性克隆cDNA序列编码三种不同的自身抗原,分别为SSA、SSB和YB-1.其中YB-1尚未被报道过与SLE血管炎相关.结论 首次发现YB-1与SLE血管炎相关.通过SEREX技术,我们可能找到有助于SLE诊断、治疗和判断预后的自身抗原.     

应用SEREX技术筛选与鉴定鼻咽癌相关抗原

目的:应用SEREX技术筛选与鉴定鼻咽癌相关抗原,为鼻咽癌的早期诊断、免疫治疗和预后监测提供候选的生物学指标和理论基础。方法:从鼻咽癌新鲜活检组织中提取mRNA,构建cDNA表达文库。用鼻咽癌患者的血清筛选所构建的cDNA表达文库,获得的阳性克隆经扩增后提取噬菌粒DNA进行测序。所得序列与GenBank数据库中已知基因进行同源比较,分析其生物学特性。结果:所构建的cDNA原始文库含1×106个重组体,蓝白斑试验显示重组率为93%。用鼻咽癌血清对表达文库进行筛选,共获得21个阳性克隆,分别代表14个不同的cDNA插入片段。12个插入片段的DNA序列分别与基因库上的基因有不同程度的同源性,其中6个基因与鼻咽癌或其它肿瘤的发生、发展关系密切;另6个基因的生理功能未见文献报道。2个插入片段未发现有同源基因,推测可能为新发现的基因。结论:SEREX技术是目前筛选肿瘤抗原最简便、有效的手段之一。本文研究发现的抗原将为鼻咽癌的研究提供进一步的理论基础。     

卵巢癌相关抗原cDNA表达文库的筛选

目的：从卵巢癌腹腔积液肿瘤细胞cDNA表达文库中筛选卵巢癌相关抗原。方法：采用SEREX方法从卵巢癌腹腔积液肿瘤细胞构建的cDNA表达文库中筛选阳性克隆。血清学筛选出的阳性克隆与SSH所得的差异表达基因探针进行杂交,最终得到特异性较高的阳性克隆。对这些克隆进行酶切鉴定、测序分析。结果：经二轮血清学筛选和DotBlot杂交,最终得到55个在血清中有相应IgG和（或）IgM自身抗体的卵巢癌差异表达的候选肿瘤抗原克隆。经核苷酸测序、序列分析和相似性比对,结果表明这55个EST片段代表45个基因,可分为6类：①3个与已知卵巢癌相关基因相似的基因,如BARD1等;②15个与其它肿瘤相关基因相似的基因,如TM4SF1等;③6个在一些特殊组织中表达的基因,如FXR1（fragileX-relatedgene1,脆性X染色体相关基因1）等;④8个与一些特殊功能蛋白基因相似的基因,如TIZ;⑤5个与胚胎来源的基因相似的基因,如PKHD1等;⑥8个在GenBank中无相似序列的新基因,如OV-189等。结论：SEREX方法与SSH方法相结合筛选肿瘤抗原的技术路线是一种行之有效的、能筛选具有较高特异性肿瘤抗原的策略。本研究为进一步研究这些抗原在卵巢癌的发生、发展及诊断方面的应用奠定了基础。     

RSD-7的克隆及其在睾丸组织中的定位

目的 分离、克隆精子发生相关基因,深入了解精子发生的分子机制。方法 采用本组克隆的大鼠睾丸EST筛选cDNA文库、Northern blot、原核表达和纯化、抗体制备和免疫组化等技术。结果 (1)获得1个新的全长cDNA序列,命名为RSD-7。全长l238bp,编码232个氨基酸,GenBank接收号为AF315467。序列分析显示,RSD-7基因编码蛋白质含有1个Ubiquitin-like结构域。(2)Northern blot结果显示,在8种成鼠组织中,RSD-7基因仅在睾丸组织中有明显表达。不同发育天龄的大鼠睾丸组织Northern blot结果显示,出生后30d的大鼠RSD-7基因开始表达,一直到120d仍有表达。(3)RSD-7 cDNA在大肠杆菌中获得高效表达,并纯化了GST-RSD-7融合蛋白,以此为抗原制备了高效价的抗RSD-7蛋白的多克隆抗体。(4)通过免疫组织化学方法,RSD-7蛋白定位于Sertoli细胞胞浆和质膜上。结论 初步分析了RSD-7基因的表达特征并制备了抗RSD-7多克隆抗体,为进一步研究RSD-7蛋白在精子发生过程中的功能提供了条件。     

大肠癌抗原基因的筛选与初步分析

目的 筛选鉴定大肠癌抗原基因,并进行生物信息学的初步分析。方法 采用自体或异体大肠癌患者血清。应用SEREX方法对大肠癌cDNA噬菌体表达文库进行免疫筛选。阳性克隆噬菌体在扩增、提取、纯化DNA后,用PCR方法和EcoRⅠ、HindⅢ双酶切鉴定cDNA片段的大小。阳性克隆eDNA插入pUCm-T载体测序。序列生物信息学分析采用NCBI的All GenBank＋EMBL＋DDBJ＋PDB Sequences Database进行BLAST基因比对分析。结果 筛选出11个阳性克隆,cDNA片段大小分别为1100、1300、1000、2000、1200、1200,700、900、600、1200和1000bp,代表9个抗原基因,7个与已知基因同源。有3个阳性克隆为同1个基因片段,与干扰素诱导的跨膜蛋白．1基因同源．具有抗增殖作用：另6个阳性克隆分别与不同的基因同源,分别是：BAC clone RP11-453E17“肿瘤解剖计划”基因,功能尚不清楚;软骨．毛发发育不良区基因,发生软骨-毛发发育不良综合征;入5号染色体克隆的序列,有插入突变,功能尚不清楚;类似抗肿瘤坏死因子α抗体的轻链Fab段基因,与IgG1抗体的y链（重链）和k链（轻链）的编码和调控其生物功能有关,可能与肿瘤的生长有关;β2微球蛋白的mRNA,与肿瘤细胞的增殖有关;醛缩酶A基因,异常表达可能促进肿瘤细胞的增殖;尚有2个阳性克隆的cDNA序列没有同源性,功能有待进一步研究。结论 用SEREX方法筛选大肠癌cDNA表达文库,可直接获得有价值的大肠癌抗原基因,对大肠癌发病机制的研究以及探讨早期诊断方法有重要意义。     

原发型肝癌组织cDNA文库的构建及抗原基因的筛选

目的 构建人原发型肝癌组织cDNA文库,以SEREX方法从cDNA文库中筛选肝癌抗原基因.方法 采用确诊的原发型肝癌患者新鲜手术切除癌组织构建cDNA文库,测定原始文库滴度,进行蓝白筛选以确定文库的重组率.以肝癌患者的血清,采用血清学方法筛选所构建的cDNA文库,阳性克隆经PCR检测鉴定后进行序列分析.结果 成功构建了混合原发型肝癌cDNA文库经测定原始文库滴度为7.42X106pfu/mL,含3.96×106个重组子,重组率为93%,扩增文库滴度为3.92×109pfu/mL,cDNA插入片段大小在0.5～3.0 kb之间.文库经3轮血清学筛选共获得31个阳性克隆,分别代表了24个独立的cDNA插入片段(抗原基因).其中17个与已知基因高度同源,另外7个基因与GenBank中已知基因的部分同源,其中有3个是新基因.利用SMART技术构建了高质量的人原发型肝癌组织cDNA表达文库,有利于以cDNA文库为基础的进一步的实验研究.结论 应用SEREX技术初步筛选原发型肝癌组织cDNA文库,共得到17个原发型肝癌相关抗原基因,其中有3个是新基因,可能为原发型肝癌的免疫学研究提供新的研究分子.     

肺癌相关抗原的血清学筛选与鉴定

目的:筛选和鉴定肺癌肿瘤相关抗原,为肺癌早期诊断提供血清学标志物,并为研制肺癌疫苗提供候选抗原.方法:5份异体肺癌患者血清采用重组cDNA表达文库的血清学分析(SEREX)技术对肺癌cDNA表达文库筛选;对阳性克隆插入片段进行测序、生物信息学分析.结果:①筛选出70个阳性克隆,插入片段大小为300～2 800 bp.②测序:70个阳性克隆代表63个不同的基因.③生物信息学分析:1个基因与肺癌的发生、发展关系密切;34个基因报道与细胞的分化、代谢及信号转导等有关系,与其他肿瘤的发生、发展有关;26个基因的生理功能未见文献报道;2个插入片段未发现有同源基因,推测可能为新发现的基因.结论:使用SEREX技术成功鉴定了一组肺癌相关的肿瘤抗原.     

SEREX方法鉴定胃癌肿瘤相关抗原基因

目的采用重组cDNA表达文库血清学分析法(SEREX法)寻找胃癌相关肿瘤抗原的编码基因.方法抽提胃癌细胞株SGC7901和1例胃癌组织标本PolyA+RNA,分别构建2个胃癌cDNA表达文库,用含有抗体的胃癌患者血清对2个文库进行筛选,并对筛选所得到的阳性克隆进行测序和生物信息学分析.结果经测定2个原始文库滴度分别为1.6×106pfu和2.5×106pfu,重组率为95%和98%.2个文库经3轮筛选共获得14个胃癌肿瘤相关抗原编码基因,其中一个为未知基因.13个已知基因编码产物包括代谢酶、RNA转录和翻译调控蛋白、蛋白代谢相关分子、自身免疫疾病相关抗原及未知功能蛋白分子.结论胃癌相关肿瘤抗原编码基因的筛选和鉴定,为胃癌的临床诊断和特异性免疫治疗提供了靶点,有助于对胃癌发生机制的深入理解.     

SEREX方法筛选人胎盘抗原

目的 筛选并获得来自人胎盘有潜在应用价值的抗原.方法 基于血清学筛选重组cDNA表达文库(serological analysis of recombinant cDNA expression library,SEREX)技术,制备人绒毛组织免疫的兔血清,利用该免疫血清筛选人胎盘组织cDNA表达文库,通过两轮筛选得到免疫反应阳性的单克隆重组噬菌体并测序,并对所得到的序列进行生物信息学分析.结果 经过两轮筛选共得到69个阳性反应克隆,序列分析发现它们代表12种不同的基因序列,其中功能已知基因9个,功能未知基因3个,进一步分析发现绒毛膜生长催乳激素基因(CSH1和CSH2)有57个阳性反应克隆.占总数的82.6%,可能是一个具有重要功能的抗原基因.所筛选到的其他基因与胚胎生长发育相关.结论 SEREX技术筛选胎盘抗原是行之有效的,本实验筛选出的抗原基因对研究胚胎生长发育具有一定的意义.     

鼻咽癌相关肿瘤抗原基因的筛选及鉴定

目的 通过筛选鼻咽癌肿瘤抗原，为鼻咽癌提供一个早期诊断指标；同时为进一步研究鼻咽癌的免疫治疗莫定基础。方法 应用鼻咽癌细胞株异种免疫血清，采用血清学筛选重组cDNA表达文库（SEREX）技术对鼻咽癌cDNA表达文库进行筛选，对阳性克隆测序并进行生物信息学分析。Western Blot检测鼻咽癌及正常人血清中阳性克隆的抗体。结果 共筛选出18个阳性克隆，其中包括MAGE基因、CREM基因、β2-微球蛋白以及核糖体蛋白等已知基因或表达序列标签（EST），另外有6个基因或EST在GenBank数据库中没有同源性，可能是新基因或EST。选取NPC-14、NPC-15、NPC-18克隆进行鼻咽癌患者及正常人群血清的检测，结果显示鼻咽癌患者的阳性率明显高于正常人群。结论 所获得的未知基因产物有可能成为早期诊断鼻咽癌的血清学标志物。     

人食管癌细胞cDNA表达文库的构建和鉴定

目的 构建人食管癌细胞cDNA噬菌体表达文库。方法 从食管癌细胞中提取总RNA,利用磁珠吸附法分离其中的mRNA,逆转录合成cDNA第一链,再通过碱基互补配对原则合成第二链,对双链cDNA进行末端修饰,连接EcoRⅠ适配子,磷酸化EcoRⅠ适配子5′端,除去不合要求的cDNA片段,将符合要求的与载体（噬菌体T7 Select10-3b）连接,然后进行体外包装建成初步的cDNA文库,并对文库进行鉴定。结果 食管癌细胞cDNA原始表达文库的滴度为2.01×106 pfu/mL,重组率高达100%,插入片段的大小范围在300～1 500 bp之间。结论 本实验成功构建了人食管癌T7噬菌体展示cDNA表达文库,并经过了初步鉴定,为下一步利用重组表达cDNA克隆的血清学分析技术（SEREX技术）鉴定食管癌相关抗原奠定基础。     

衰老标记蛋白-30--一种新的肝细胞癌相关抗原

目的：寻找人肝细胞癌（ＨＣＣ）特异抗原。方法：应用重组克隆表达抗原的血清学鉴定技术（ＳＥＲＥＸ）,用病人自身血清从广西肝细胞癌ＣＤＮＡ文库中选出编码ＨＣＣ肿瘤抗原的基因克隆,用肝癌患者及其他人血清检验ＨＣＣ肿瘤抗原原肝癌的特异性,测定抗原ＤＮＡ序列并一基因库核对寻找其同源结构。结果：其中一种ＨＣＣ肿瘤抗原与衰老标记蛋白－２０（ＳＭＰ－３０）是同源结构。相应抗体主要只见于ＨＣＣ病人,在２０例其它５种     

黑胸大蠊若虫免疫兔血清对美洲大蠊若虫cDNA表达文库的筛选及克隆分析

目的从美洲大蠊若虫cDNA文库中筛选黑胸大蠊抗原相关基因,以期获得黑胸大蠊有潜在药用价值的蛋白质、多肽成分。方法用黑胸大蠊若虫免疫兔血清筛选美洲大蠊若虫cDNA文库,对阳性克隆进行PCR鉴定和序列测定,通过国际互联网进行核苷酸序列的同源性分析及编码蛋白质的结构分析和功能预测。结果经三轮复筛,从多个持续阳性克隆中挑选出3个进行测序、分析,其中N1克隆为新基因,Score<50,命名为Parcxpwnx01,GenBank登录号为AY838802。该基因编码231个氨基酸,初步预测该蛋白可能为一具信号转导功能的跨膜蛋白。N2克隆与美洲大蠊核蛋白体16SRNA基因高度同源,N3与黑胸大蠊线粒体DNA高度同源。结论免疫筛选获得与黑胸大蠊若虫抗原相关的基因克隆,其编码的蛋白结构和功能有待进一步研究。     

肺癌候选抗原的血清反应分析及其联合检测的应用

目的：通过重组cDNA表达文库血清学分析（SER-EX）技术筛选鉴定的5种肺癌候选抗原的血清学反应及其联合检测分析,对其能否作为肺癌早期诊断的血清学标志物进行评价,并提供一个肺癌早期诊断的新方向.方法：采用重组克隆抗原表达技术扩增5种肺癌候选抗原[分别是X5：二羟基苯甲酸内脂结合蛋白1配偶体（POB1）;X18：DNA拓扑异构酶Ⅱα（Top2A）;X44：中枢神经系肽酶Ⅰ（TPP1）;X48：热休克蛋白90а（HSP90а）;X52：真核翻译延长因子1γ（eukaryotic translation elongation factor 1 gamma）],免疫印迹法检测肺癌患者血清、正常人血清中自身抗体的反应,流行病学方法对其检测结果进行评价.结果：POB1,Top2A,HSP90а3个肺癌候选抗原克隆在肺癌患者血清和正常人血清中的相应IgG抗体阳性率差别有统计学意义（P〈0.05）;3个阳性反应抗原抗体反应联合分析时,能够在保持特异度等基本不变的前提下,明显提高诊断肺癌的灵敏度,具有较大的临床诊断价值.结论：3个抗原可作为肺癌的早期诊断的候选标志物,为肺癌的早期诊断提供了一个新的方向.     

骨肉瘤cDNA文库的构建和筛选

目的 研究骨形态发生蛋白-2(BMP-2)在骨肉瘤发生、发展中的作用,构建SAOS-2细胞cDNA文库,寻找与BMP-2相关作用蛋白.方法 从骨肉瘤细胞系SAOS-2中提取总RNA,进而分离poly(A) RNA,用poly(A) RNA进行反转录并以SMARTⅢTM和CDSⅢoligo(dT)为引物进行PCR扩增,得到两端具有同源臂的PCR片段,以此同源臂为基础在酵母中实现同源重组.通过文库片段,线形化的pGADT7-Rec和诱饵质粒pGBKT7/HA-BMP-2共转化酵母AH109菌株在文库构建的同时进行与BMP-2相互作用蛋白的筛选;或先将文库片段,线形化的pGADT7-Rec转化AH109,再利用AH109和Y187两种酵母菌株的接合生殖进行筛选.最后用Far-Western blotting法进一步从体外论证BMP-2相互作用蛋白.结果 构建了具有基因多样性和库容量足够大的骨肉瘤cDNA文库,双链cDNA片段的长度大小范围为250～5000 bp.共转化的效率为4.3×105,重组效率为1.9×106,筛选的克隆数为4.3×105.接合法筛选时的接合效率为32%,筛选的克隆数为1.0×106.筛选到四个与BMP-2相互作用的阳性克隆.结论 此文库的多样性和库容量均符合筛选需求.可用于骨肉瘤相关基因的进一步筛选.