应用抑制性消减杂交技术筛选转化生长因子β1刺激LX02细胞的反式调节基因

目的 构建转化生长因子(TGF)β1刺激大鼠肝星状细胞(LX02)反式调节基因的cDNA消减文库,筛选并克隆TGF β1反式调节相关基因,以阐明TGF β1介导肝纤维化的分子生物学机制.方法 以TGF β1刺激LX02细胞,同时以磷酸盐缓冲液刺激的LX02细胞作为对照.提取mRNA并逆转录为cDNA,经Rsa Ⅰ酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性多聚酶链反应.将产物与pGEM-Teasy载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增;随机挑选克隆经PCR扩增后进行测序及同源性分析. 结果成功构建了TGF β1刺激LX02细胞反式调节基因的cDNA消减文库.文库扩增后得到146个200～1000bp插入片段的阳性克隆;随机挑取其中35个克隆进行测序,30个列序成功,并通过生物信息学分析发现有28个与已知基因序列和2个与未知功能基因序列高度同源.结论 应用抑制性消减杂交技术成功构建了TGF β1刺激LX02细胞反式调节基因的cDNA消减文库,筛选到一些与细胞生长调节、蛋白质合成,信号传导、细胞外基质代谢、扰脂质过氧化等密切相关的蛋白质编码基因,为进一步阐明TGF β1介导肝纤维化的分子生物学机制提供了线索.     

抑制性消减杂交技术筛选γ-氨基丁酸调节的肝星状细胞系靶基因

目的:应用抑制性消减杂交技术(SSH)筛选γ-氨基丁酸(GABA)作用肝星状细胞系HSC-T6后的差异表达基因.方法:10 umol/L的GABA作用于HSC-T6细胞24 h,提取mRNA,用分光光度计进行定量分析.以GABA处理和未处理的T6细胞mRNA为模板逆转录合成双链cDNA(dscDNA),并分别标记为Tester和Drivet,酶切后与接头连接,经两次杂交,构建消减杂交文库,将消减文库的扩增产物进行转化、克隆分析后应用生物信息学技术将测得序列再进行同源性分析.结果:15种基因表达上调,其中包括与DNA合成、线粒体、肿瘤抑制以及凋亡相关的4类基因,结果显示GABA可能促进HSC-T6细胞增殖而抑制凋亡.结论:用SSH技术可以成功获得GABA刺激肝星状细胞基因上调的监测,证明GABA能够影响肝星状细胞的基因表达谱.     

锌α2糖蛋白抑制肝星状细胞活化和增殖的体外研究

目的探讨锌α2糖蛋白(AZGP1)在肝星状细胞活化和肝纤维化发生和发展中的作用机制。方法采用转化生长因子-β1刺激诱导人肝星状细胞株LX2活化和构建四氯化碳小鼠肝纤维化模型,观察细胞和肝组织中AZGP1的表达情况。应用质粒转染法过表达和抑制表达AZGP1后,分别检测LX2细胞的活化、增殖和凋亡功能及相关因子的改变。多组间比较采用单因素方差分析。结果免疫荧光染色结果显示在活化的LX2细胞中,AZGP1蛋白减少而α-平滑肌肌动蛋白增多,二者呈负相关。AZGP1基因和蛋白在活化的LX2细胞和四氯化碳肝纤维化小鼠的肝组织内显著低表达。过表达AZGP1后,LX2细胞中Ⅰ型胶原、基质金属蛋白酶-2和α-平滑肌肌动蛋白基因和蛋白明显下调;细胞荧光显示过表达AZGP1的细胞活化和α-平滑肌肌动蛋白减少。此外,过表达AZGP1后,LX2细胞的增殖活性和G1/S-特异性周期蛋白D1蛋白显著降低;细胞周期实验显示过表达AZGP1的细胞停滞在G0/G1期比例显著增多、而S期比例显著减少。AZGP1对LX2细胞凋亡无明显影响。结论AZGP1可通过抑制肝星状细胞活化和增殖而逆转肝纤维化;过表达AZGP1有望成为肝纤维化治疗的新靶点。     

应用基因表达谱芯片技术筛选GABA作用下肝星状细胞差异表达基因

目的:应用基因芯片技术检测γ-氨基丁酸(GABA)对肝星状细胞(HSC-T6)基因表达谱的影响.方法:10μmol/L的GABA作用于HSC-T6细胞48 h,提取mRNA,逆转录为cDNA.双PBS作用的HSC-T6细胞为对照,进行cDNA芯片分析.结果:在4096个基因表达谱的筛选中,发现有11个基因表达水平显著上调,26个基因表达水平显著下调.结论:成功地应用基因芯片筛选GABA作用下肝星状细胞差异表达基因,证明GABA对肝星状细胞的表达谱有显著作用.     

移植雄性骨髓的雌性小鼠肝组织肝再生相关基因的信号通路

目的:探讨骨髓形成肝细胞的分子机制.方法:采用移植♂骨髓的♀小鼠模型,♀Balb/c小鼠随机分为模型组和正常对照组,选用小鼠基因表达谱寡核苷酸芯片,利用反转录酶合成掺有荧光标记的cDNA探针,将探针与基因表达谱芯片杂交观察小鼠肝组织基因表达谱的变化,筛选样本之间杂交信号比值有差异表达的基因.采用生物信息学方法分析模型组中小鼠肝组织再生相关基因的信号通路变化规律.结果:♀小鼠在移植♂骨髓6 mo后肝组织的基因表达谱显著不同,对照组相对于正常组的差异表达基因有865条,已知功能基因有447条,其中上调基因92条,下调基因355条.与肝再生相关基因信号通路涉及HGF,TGF-β,Focal Adhesion,JAK-Stat,VEGF等信号通路,他们相关基因的上调表达促进肝细胞的增殖分化.TGF-β信号通路中相关基因下调,抑制信号通路的激活,减弱肝再生的负性作用,利于肝细胞的增殖分化.结论:♀小鼠移植♂骨髓后的肝组织基因表达谱显著变化,有可能通过其肝再生相关基因的信号通路激活或抑制调节肝再生.     

筛选转化生长因子β1刺激肝星状细胞差异表达基因的研究

目的 筛选转化生长因子β 1(TGF β 1)刺激大鼠肝星状细胞(Hsc)的差异表达基因,以揭示TGF β1介导肝纤维化的分子发病机制. 方法分别用Trizol法抽提TGF β1刺激的HSC及磷酸盐缓冲液刺激为对照的HSC总RNA,逆转录合成双链cDNA,制备掺入生物素标记的cDNA探针,与人基因表达谱芯片杂交,用Agilent扫描仪对芯片结果进行扫描,利用软件对差异表达基因进行生物信息学分析. 结果 从13824条目的 基因中筛选出177条差异表达基因,其中123条基因表达上调,其中包括:结缔组织生长因子,微管蛋白ε 1,V型胶原α2,连环蛋白6 2,钙粘蛋白6,2型,Smad3,丝裂源活化蛋白激酶4,生长因子受体结合蛋白7,丝裂原活化蛋白激酶相互作用/丝氨酸/苏氨酸激酶1等;54条基因表达下调,包括:肿瘤坏死因子受体相关因子4,干扰素调节因子7,干扰素诱生蛋白p78,骨形态发生蛋白7,基质gLa蛋白,人类丝氨酸蛋白酶抑制剂进化支B成员8,干扰素刺激基因2.0×104,死亡相关蛋白6,金属硫蛋白1H,超氧化物歧化酶2等;同时筛选到8个未知功能蛋白. 结论 应用基因表达谱芯片技术成功筛选了TGF β 1刺激HSC的差异表达基因,初步揭示了TGF β1致肝纤维化的分子机制是诸多因素共同作用的结果,为进一步寻找新的基因治疗靶点奠定了基础.     

p27在荔枝核总黄酮抑制人肝星状细胞LX2增殖过程中的表达及其意义

目的:研究荔枝核总黄酮(total flavonoids of litchi,TFL)对人肝星状细胞LX2增殖的影响及其相关作用机制.方法:使用不同浓度(7.8125、15.6250、31.2500、62.5000、125.0000μg/m L)TFL处理LX2.采用CCK-8法检测细胞的增殖活力,通过流式细胞仪分析各组细胞周期的分布,使用RT-PCR和Western blot技术测定细胞中p27基因m RNA和蛋白的表达.结果:TFL作用48、72 h可抑制LX2细胞增殖,且随着时间延长,抑制效果更加明显.T F L处理72 h后可测得L X2细胞被阻滞在S期,且明显上调p27基因的m RNA和蛋白的表达.结论:TFL抑制人肝星状细胞增殖并将其阻滞在S期,该作用机制可能与p27表达上调相关.     

SOX9调控肝星状细胞活化与增殖促进肝纤维化进展

目的 探究SOX9基因对肝星状细胞活化与增殖的影响。方法 通过每周三次腹腔注射15%的四氯化碳或玉米油构建肝纤维化及对照小鼠模型。HE染色、Masson染色观察小鼠肝纤维化造模情况,qPCR检测小鼠肝脏SOX9、α-SMA、Col1基因表达。用TGFβ1细胞因子诱导LX2细胞活化,qPCR检测LX2细胞活化状态及敲减SOX9基因后SOX9、α-SMA、Col1、CyclinD1、PCNA基因mRNA表达。结果 HE、Masson染色表明肝纤维化模型成功构建。qPCR结果表示肝纤维化标志基因α-SMA(造模组：2.568±0.726,对照组：1.000±0.272,t=4.518,P=0.002)与Col1表达明显上升(造模组：3.125±0.775,对照组：1.000±0.398,t=5.454,P=0.001)。SOX9基因在纤维化的小鼠肝脏中也显著上升(造模组：1.986±0.634,对照组：1.000±0.288,t=3.126,P=0.014)。在活化的LX2细胞中SOX9基因表达显著上调(活化组：1.718±0.395,对照组：1.000±0.155,t=3.783,P=0....     

应用基因芯片对人肝纤维化相关基因的筛查

目的:筛查肝纤维化组织相关基因,探讨肝纤维化发生机制.方法:抽提肝纤维化组织和正常肝组织总RNA来制备探针,经杂交、洗涤后,通过计算机扫描分析肝纤维化组织和正常肝组织基因表达谱的差异情况,并用实时荧光定量PCR技术对其中部分差异基因的表达水平变化进行验证.结果: 筛选出差异表达的基因68个,其中肝纤维化组织中表达上调的基因35个,表达下调的基因33个,这些基因按照功能可以分为调控细胞信号转导、DNA损伤与修复、转录调控因子、代谢相关基因以及未知功能基因.与正常肝组织比较,肝纤维化组织中C/EBPβ mRNA表达下调(22.02±4.82 vs 59.13±8.21,P<0.01),MMP-14 mRNA表达上调(257.33±26.58 vs 21.65±4.37,P<0.01),结果与基因芯片一致.结论:多种基因参与肝纤维化的形成过程,肝纤维化组织与正常肝组织之间存在有明显的基因表达差异.     

γ-氨基丁酸对人肝细胞株基因表达的影响

目的:观察γ-氨基丁酸(GABA)对人肝细胞株Huh-7基因表达的影响.方法:将10μmol/L GABA与Huh-7细胞共同孵育24h,以PBS处理的Huh-7细胞为对照,提取mRNA,并逆转录成cDNA.与芯片杂交,根据杂交信号强弱筛选相关基因.结果:共筛选出27条差异表达的基因,其中11条基因表达下调,16奈基因表达上调,这些基因主要是与细胞增殖、凋亡及免疫功能相关,另外还有部分基因功能不详.结论:GABA对肝细胞基因表达谱有一定作用,GABA可能参与肝细胞功能的调控.     

State of knowledge of helminth fauna of freshwater fishes of Poland

A total 89 fish and lamprey species has been recorded from Polish freshwater habitats. Twenty-seven of them (30.3%) have not been surveyed for parasitic helminthes. Some of the latter fishes are either rare or not easily accessible. Other live only in specific habitats in scattered localities. An important obstacle for studying parasite faunas of some fishes may be their status on an endangered species. Among the non-surveyed fishes, are those which have been relatively recently introduced to Poland or migrated there on their own. The present paper attempts to review all hitherto not studied helminthologically fish species, their habitats, localities and current protection status.     

高血压降压治疗目标的再认识

根据传统的高血压水平的定义,1993年WHO高血压治疗指南提出血压控制目标为<140/90mm Hg(1mm Hg=0.133kPa),但是并非所有患者都必须将血压降至同一水平,而应根据患者情况进行个体化治疗。Framingham进行的一项长达10～12年的心血管事件研究发现,第5年后,正常上限血压[收缩压(SBP     

Lack of correlation of degree of villous atrophy with severity of clinical presentation of coeliac disease

BACKGROUND AND AIM: Both the clinical presentation and the degree of mucosal damage in coeliac disease vary greatly. In view of conflicting information as to whether the mode of presentation correlates with the degree of villous atrophy, we reviewed a large cohort of patients with coeliac disease. PATIENTS AND METHODS: We correlated mode of presentation (classical, diarrhoea predominant or atypical/silent) with histology of duodenal biopsies and examined their trends over time. RESULTS: The cohort consisted of 499 adults, mean age 44.1 years, 68% females. The majority had silent coeliac disease (56%) and total villous atrophy (65%). There was no correlation of mode of presentation with the degree of villous atrophy (p=0.25). Sixty-eight percent of females and 58% of males had a severe villous atrophy (p=0.052). There was a significant trend over time for a greater proportion of patients presenting as atypical/silent coeliac disease and having partial villous atrophy, though the majority still had total villous atrophy. CONCLUSIONS: Among our patients the degree of villous atrophy in duodenal biopsies did not correlate with the mode of presentation, indicating that factors other than the degree of villous atrophy must account for diarrhoea in coeliac disease.