二烯丙基二硫化物对HL-60白血病细胞株VEGF表达及分泌的影响

为了研究二烯丙基二硫化物（diallyl disulfide，DADS）对白血病HL-60细胞株VEGF mRNA的表达及VEGF蛋白分泌的作用，并从影响VEGF生成的角度探讨DADS的抗白血病机制，应用ELISA法检测药物作用前后白血病HL-60细胞培养上清液中VEGF蛋白的含量；RT-PCR法检测药物作用前后白血病HL-60细胞VEGF mRNA的相对含量。结果表明：HL-60细胞中均有VEGF mRNA的表达和VEGF蛋白的分泌；与空白对照相比，DADS3个浓度组（0，625，1，25，2，5μg／ml）作用HL-60细胞48小时和72小时均能下调HL-60细胞VEGF mRNA的表达及VEGF蛋白的分泌（P〈0.01）。3个浓度组间差异显著（P〈0．01），其下调HL-60细胞VEGF mRNA的表达及VEGF蛋白的分泌效果与浓度相关（r〉0.9，P〈0．01）。结论：DADS可能通过抑制VEGF mRNA的表达及VEGF蛋白的分泌发挥抗白血病效应。     

槲皮素对HL-60细胞形态及血管内皮生长因子表达的影响

目的：探讨槲皮素对HL-60细胞的形态、血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法：以HL-60细胞为研究对象，细胞形态学观察采用Wright染色法：膜联蛋白Ⅴ(Annexin Ⅴ)标记检测细胞凋亡率；VEGF表达采用ELISA法。结果：①经槲皮素处理后，HL-60细胞形态学上出现凋亡特征性改变。②槲皮素处理后HL-60细胞凋亡率明显增加。③槲皮素处理后HL-60细胞显著降低VEGF表达。结论：槲皮素在体外能抑制白血病细胞HL-60生长并诱导其凋亡；槲皮素可抑制白血病细胞分泌VEGF。     

二烯丙基二硫对HL-60细胞的生长抑制和诱导分化作用

目前,研究诱导白血病细胞终末分化的药物很多,但真正能够应用于临床并产生良好疗效的只有维生素A酸类。然而,维生素A酸类也有其局限性和维甲酸综合征等不良反应,因此,寻找新的分化诱导剂仍有十分重要的意义。近年来,大蒜及其烯丙基硫化物抗肿瘤活性的研究是抗癌药物研究的一个新领域。为探讨二烯丙基二硫(DADS)抗肿瘤作用及其机制,我们观察了DADS对人急性髓系白血病HL 6 0细胞的抑制及诱导分化的影响。材料和方法1　材料和主要试剂　HL 6 0细胞引自湖南医科大学肿瘤研究所,培养于含1 0 %的热灭活小牛血清(杭州四季青公司)、1 0 0U/ml…     

血管内皮生长因子反义寡核苷酸对白血病细胞系HL-60细胞作用的研究

本研究探讨VEGF ASODN抑制白血病细胞内源性VEGF mRNA的表达作用及其与白血病细胞凋亡的关系。用阳离子聚合物介导硫代修饰VEGF ODN转染体外培养白血病细胞系HL-60细胞后,采用MTT法检测细胞增殖抑制率,RT-PCR检测VEGF mRNA表达,以细胞形态学,凝胶电泳,流式细胞术观察细胞凋亡。结果显示：反义组与错义组、空白对照组相比,在细胞增殖抑制率和VEGF mRNA的表达水平方面均具有显著性差异（p〈0.05）;错义组与空白对照组相比无统计学差异（p〉0.05）。反义组可见细胞皱缩,颗粒增多,核固缩并出现细胞碎片,而错义组、空白对照组细胞轮廓清楚,胞体透亮,生长旺盛;反义组有凋亡梯形带,错义组和空白对照组仅见1条DNA条带;反义组细胞凋亡率达19.46%,与错义组、空白对照组相比具有显著性差异（p〈0.05）;错义组与空白对照组相比,无统计学差异（p〉0.05）。VEGF ASODN联合VP16的细胞凋亡率与等同条件单用VP16组相比有统计学差异（p〈0.05）;且凋亡率具有时间和剂量依赖关系。结论：VEGF ASODN能抑制白血病细胞内源性VEGF mRNA的表达,诱导白血病细胞的凋亡,抑制增殖,且增强VP16对白血病细胞诱导凋亡作用,两者联合效应具有相加作用。     

血管内皮生长因子反义寡核苷酸对人白血病细胞血管内皮生长因子表达的影响

目的　探讨血管内皮生长因子 (VEGF)反义寡脱氧核苷酸 (AS ODN)对人白血病细胞系VEGF表达的影响。方法　将VEGFAS ODN与K5 6 2和HL 6 0细胞共孵育 ,采用RT PCR技术、免疫组化方法以及ELISA法观察VEGFAS ODN对人白血病细胞系VEGFmRNA和蛋白水平的影响。应用MTT法观察VEGFAS ODN作用后的白血病细胞培养上清对人脐静脉血管内皮细胞 (ECV30 4 )增殖的影响。结果　K5 6 2细胞和HL 6 0细胞经VEGFAS ODN(2 .5～ 15 .0 μmol L)作用 2 4h后 ,VEGFmRNA的表达量呈剂量依赖性减少 ,而其表达量不受VEGF错义ODN的影响 ;当加入 5 .0 μmol LVEGFAS ODN作用 2 4h后 ,细胞内及其培养上清液中VEGF蛋白水平显著减少 ,其培养上清对ECV30 4细胞的促增殖作用减弱 ,而错义ODN处理组白血病细胞VEGF蛋白水平及其作用未见明显改变。结论　VEGFAS ODN在体外能够抑制人白血病细胞VEGF的表达。     

小檗碱对HL-60细胞增殖、凋亡及血管内皮生长因子受体2表达的影响

本研究旨在观察小檗碱对人早幼粒白血病HL-60细胞的增殖、凋亡及血管内皮生长因子受体-2(VEGFR2)表达的影响。选用HL-60细胞体外培养,在不同浓度的小檗碱(6-96μg/ml)作用下,应用CCK-8法检测小檗碱对HL-60细胞的增殖抑制作用;应用流式细胞仪检测HL-60细胞的凋亡水平及细胞周期的分布;用RT-PCR及Western blot分别检测VEGFR2 mRNA及VEGFR2蛋白表达的变化。结果显示,小檗碱能抑制HL-60细胞的增殖,促进其凋亡,呈浓度和时间依赖关系。随着小檗碱浓度增加,G1期细胞增多,S期细胞减少,同时VEGFR2 mRNA和VEGFR2蛋白表达减少。结论:小檗碱可抑制HL-60细胞增殖,促进细胞凋亡,改变HL-60细胞周期,下调VEGFR2 mRNA及VEGFR2蛋白的表达。     

二烯丙基二硫诱导HL-60细胞G2/M期生长阻滞的分子机制研究

目的　探讨二烯丙基二硫 (DADS)诱导HL 6 0细胞G2 /M期细胞生长阻滞的分子机制。方法　用不同浓度的DADS处理HL 6 0细胞 ,分别作用 0 ,6 ,1 2 ,2 4 ,4 8h后用MTT法测定细胞增殖活性 ;用流式细胞术和有丝分裂指数测定细胞增殖周期 ;用Westernblot检测 p38丝裂原活化蛋白 (p38MAPK)及Cdc2 5B和Cdc2激酶的表达和磷酸化水平 ;用RT PCR检测p38MAPKmRNA的表达。结果　DADS抑制HL 6 0细胞增殖呈浓度依赖性 ,且DADS(2 0 μmol/L)与ATRA(1 0nmol/L)对HL 6 0细胞增殖活性影响相近 (P >0 .0 5 ) ;DADS 2 0 μmol/L作用HL 6 0细胞 1 2h后能引起G2 /M期细胞百分数增高并达到最大值 ,而此时有丝分裂指数明显下降 (P <0 .0 5 ) ;同时 ,磷酸化p38MAPK蛋白及p38MAPKmRNA的表达达到高峰 (P <0 .0 5 ) ,并引起Cdc2 5B和Cdc2磷酸化水平的相应变化。而p38特异性抑制剂SB2 0 2 1 90 (1 0 μmol/L)能阻断DADS对HL 6 0细胞增殖的抑制作用 (P <0 .0 5 )。结论　DADS能启动HL 6 0细胞G2 /M控制点 ,它的激活可能与磷酸化 p38MAPK的活化有关     

全反式维甲酸和柔红霉素对NB4和HL-60细胞株VEGF表达及分泌的影响

目的　探讨在全反式维甲酸 (ATRA)和柔红霉素 (DNR)的分别作用下 ,白血病细胞株NB4和HL 6 0VEGFmRNA表达及VEGF蛋白分泌的变化。方法　应用RT PCR法和ELISA方法研究ATRA和DNR分别对NB4和HL 6 0细胞VEGFmRNA表达及VEGF蛋白分泌的影响。结果　NB4和HL 6 0细胞中均有VEGFmRNA的表达和VEGF蛋白的分泌。ATRA(10 - 5～ 10 - 8mol L)及DNR(0 .0 1～2 .0 0 μmol L)在体外能分别下调NB4及HL 6 0细胞VEGFmRNA的表达和VEGF蛋白的分泌 ,并呈时间(3～ 72h)和剂量依赖性 (r值均为 - 1.0 0 ,P值均 <0 .0 1)。结论　这两种化疗药物除了可以诱导白血病细胞分化或抑制白血病细胞生长外 ,还可以通过抑制促血管新生 ,使新生血管减少 ,以发挥抗白血病的效应。     

全反式维甲酸和亚硒酸钠对HL-60细胞VEGF及其受体表达的影响

为了探讨非骨髓毒性药物全反式维甲酸(ATRA)及具有防癌作用的微量元素硒的化合物——亚硒酸钠(Na2SeO3)对HL-60细胞系血管内皮细胞生长因子(VEGF)及其受体表达的影响，应用ELISA法检测药物作用前后细胞培养上清液中VEGF含量，流式细胞术测定细胞表面VEGF受体表达。结果发现，5μmol／L和10μmol／L的ATRA作用48小时和72小时后细胞上清液中VEGF含量显著减低，ATRA在48小时对HL-60细胞表面的VEGF受体表达无抑制作用，在72小时可抑制细胞表面的受体表达。Na2SeO3在5μmol／L和10μmol／L浓度条件下作用48小时、72小时，对HL-60细胞培养上清液中VEGF的含量无明显抑制效应，对HL-60细胞表面VEGF-R的表达有显著的抑制作用。结论：ATRA具有抑制白血病细胞HL-60 VEGF及其受体表达的作用，Na2SeO3对HL-60细胞分泌VEGF无抑制作用，但可抑制HL-60细胞表面表达VEGF受体，其机制尚需进一步明确。由于ATRA和Na2SeO3无明显的骨髓抑制作用，但具有抗血管新生的活性，故推测它们与常规放化疗相结合，将会增强放化疗的疗效，减少后者的用量，降低毒性，有助于白血病的治疗。     

塞来西布对HL-60细胞增殖、凋亡及表达VEGF影响的体外研究

目的研究塞来西布（Celecoxib）对急性髓系细胞白血病（AML）HL-60细胞的增殖抑制、诱导凋亡作用及其机制。方法以不同浓度的Celecoxib作用于体外培养的HL-60细胞,用MTT法检测细胞生长抑制率;用流式细胞仪分析凋亡细胞的百分率和细胞周期变化;QRT—PCR法检测VEGF表达水平。结果Celeeoxib以浓度依赖性方式有效地抑制HL-60细胞增殖,Celecoxib增加G0／G1期HL-60细胞百分率,降低S、G2期HL-60细胞百分率;Celecoxib能以浓度依赖性方式诱导HL-60细胞凋亡。当Celecoxib浓度大于40μmol／L时,随着Celecoxib浓度增高,HL-60细胞VEGF-mRNA的表达逐渐降低,呈浓度依赖性变化。结论Celecoxib对HL-60细胞具有显著的增殖抑制和诱导凋亡作用,增殖抑制可能在于阻断了细胞周期的进行,降低VEGF活性可能是其诱导凋亡重要作用机制之一。     

维甲酸诱导HL-60细胞Fas蛋白表达

目的：探讨全反式维甲酸（ＡＴＲＡ）和９顺式维甲酸（９ｃｉｓＲＡ）对ＨＬ６０细胞Ｆａｓ表达水平及维甲酸对抗Ｆａｓ抗体诱导的细胞凋亡敏感性的影响。方法：用流式细胞仪检测ＨＬ６０细胞膜Ｆａｓ蛋白表达水平；分别采用形态学观察、ＤＮＡ电泳和流式细胞仪检测抗Ｆａｓ抗体诱导的细胞凋亡。结果：ＨＬ６０细胞Ｆａｓ弱表达。经１０－６ｍｏｌ／ＬＡＴＲＡ或９ｃｉｓＲＡ分别预处理４天后，ＨＬ６０细胞Ｆａｓ表达水平及对抗Ｆａｓ抗体诱导凋亡的敏感性均显著提高。９ｃｉｓＲＡ提高ＨＬ６０细胞对抗Ｆａｓ抗体诱导凋亡的敏感性的能力强于ＡＴＲＡ。结论：维甲酸可上调ＨＬ６０细胞表达Ｆａｓ，这可能与维甲酸诱导ＨＬ６０细胞分化相关。进一步深入探讨其分子机制，将为肿瘤治疗，特别是自体骨髓移植中骨髓净化提供新方法     

bFGF和VEGF在急性白血病中的表达及对HL-60细胞生长的影响

为了研究急性白血病患者血清及细胞株培养上清中碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)、血管内皮细胞生长因子 (VEGF)的表达水平 ,并初步探讨白血病患者VEGF水平的评价方法以及VEGF特异性反义寡脱氧核苷酸(ASODN)的抗血管生成作用 ,用夹心ELISA法测定患者血清、细胞株 (HL 6 0、U937、NB4、JM和K5 6 2 )培养上清中bFGF和VEGF浓度 ,比较其差异 ,将VEGF血清浓度测定值 (pg ml)、血清浓度测定值经外周血血小板计数标化后标化值VEGF PLT(pg 10 6 )分别作为比较指示 ;HL 6 0细胞经不同浓度VEGFASODN作用后 ,利用噻唑蓝、ELISA法分别测定靶细胞的生长状态及其VEGF分泌水平。结果发现 :①急性白血病患者血清bFGF阳性率 (37.5 % )高于健康对照者 (10 % ) (P <0 .0 1) ,在 5株白血病细胞株中 ,NB4 、U937和K5 6 2细胞上清中检测到了bFGF表达 ;②急性白血病患者及健康者血清VEGF测定值差异无统计学差异 ,但二者标化值测相差显著 (P <0 .0 5 ) ;除U937外 ,其余 4株细胞株培养上清中均有VEGF表达 ;③HL 6 0细胞经 0 .5 ,1及 5 μmol LVEGFASODN作用 2 4小时后 ,其存活率与对照组相比明显降低 (P <0 .0 5 ) ;经 1,5 ,2 0 μmol LVEGFASODN作用 2 4小时后 ,HL 6 0细胞培养上清中VEGF浓度均明显低于对照 (P <0 .0 5 )。结论 :     

hTERT反义寡核苷酸对HL-60细胞致瘤性的影响及其诱导凋亡作用

目的研究人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因反义寡核苷酸(ASODN)对 HL-60细胞致瘤性的影响及其诱导凋亡作用。方法用流式细胞术检测 hTERT ASODN 转染 HL-60细胞72 h 后细胞凋亡,琼脂糖凝胶电泳检测凋亡细胞 DNA 梯带;将转染及未转染寡核苷酸的 HL-60细胞分别接种BALB/c 裸鼠,观察成瘤情况,切片观察移植瘤组织形态;另取10只 BALB/c 裸鼠,改进成瘤方法使其均匀成瘤后分成两组,在瘤体局部分别注射 ASODN、磷酸盐缓冲液(PBS),经7d 治疗后测量瘤体并切片观察其细胞形态变化,采用 TUNEL 方法检测细胞凋亡。结果 hTERT ASODN 作用于 HL-60细胞72 h 后,流式细胞术检测出早期凋亡峰,琼脂糖凝胶电泳显示 DNA 梯形条带,SODN 组及空白对照组未检测出凋亡峰及 DNA 梯形条带 ASODN 转染的 HL-60细胞组 BALB/c 裸鼠接种后第16～17天成瘤,5只中2只成瘤,未转染组在第12～13天成瘤,5只中4只成瘤,成瘤后 ASODN 治疗组瘤组织间质及血管较少,PBS 治疗对照组瘤组织间质发达,血管丰富。成瘤后 ASODN 治疗前肿瘤体积为(100.9±24.6)mm~3,治疗后肿瘤与 PBS 对照组比较,生长明显减缓[瘤体积分别为(422.7±326.4)mm~3和(786.4±357.6)mm~3](P<0.05) 组织切片显示,ASODN 治疗组瘤组织中可见大量细胞呈现凋亡形态,PBS 治疗组则少见凋亡细胞 TUNEL 检测显示,ASODN 治疗组瘤组织中阳性细胞数较 PBS 治疗组明显增多(P<0.05)。结论 hTERT 基因 ASODN 能够诱导 HL-60细胞凋亡并降低其在 BALB/c 裸鼠体内的致瘤性,抑制移植瘤增长速度。     

手霉素通过线粒体凋亡途径诱导U937和HL-60细胞凋亡

目的 研究法尼酰基转移酶抑制剂手霉素（Manumycin）诱导白血病细胞凋亡的机制。方法 用2μmol／L手霉素处理白血病细胞系U937和HL-60细胞不同时间，用流式细胞术检测细胞凋亡。免疫印迹技术检测细胞色素C、caspase9、caspase8、caspase3的表达。用荧光染料JC-1检测法测定线粒体膜电位（Δψm），并用caspase抑制剂Z—VAD—fmk阻断caspase的活化，探讨caspase在手霉素诱导白血病细胞凋亡中的作用。结果 2μmol／L手霉素处理U937和HL-60细胞16h，Δψm显著下降，相对值分别是0．51±0．07和0．41±0．06（P〈0．01）。手霉素诱导细胞色素C从线粒体释放到细胞质，激活caspase-9、caspase8和caspase-3。50μmol／L的Z—VAD—fmk可完全阻断caspase激活，但仅部分阻断手霉素诱导的U937和HL-60细胞凋亡，细胞凋亡率分别减少51．69％和56．47％。结论 手霉素通过线粒体途径诱导U937和HL-60细胞凋亡。     

X连锁凋亡抑制蛋白在HL-60细胞耐药中的作用

目的 探讨X连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）在纤维连接蛋白（Fn）黏附介导的HL-60细胞耐药中的作用。方法 用Fn包被培养板，以牛血清白蛋白（BSA）包被培养板作为对照。通过CCK-8实验检测Fn黏附对柔红霉素（DNR）敏感性的影响，流式细胞仪检测HL-60细胞内DNR浓度的变化，RT-PCR、Western blot检测XIAP、bcl-2、MRP和mdr1基因mRNA和蛋白表达变化。将XIAP反义寡核苷酸通过脂质体法转染Fn黏附培养的HL-60细胞，计算DNR对HL-60细胞的IC50值。结果 HL-60细胞与Fn黏附后，对DNR的敏感性下降，Fn组IC50值为0．526μmol／L，明显高于BSA组（0．132μmol／L）和悬浮培养组（0．123μmol／L）（P〈0．05）；Fn组XIAPmRNA和XIAP蛋白表达水平均较BSA组和悬浮培养组明显上调（P〈0．05）；Fn组细胞内的DNR浓度与BSA组和悬浮培养组比较差异无统计学意义（P〉0.05）。XIAP反义寡核苷酸可使Fn黏附介导的耐药HL-60细胞XIAP表达明显下调，对DNR的敏感性增加。结论 XIAP可能参与了Fn黏附介导的HL-60细胞耐药，应用XIAP反义寡核苷酸能够逆转Fn黏附介导的HL-60细胞耐药。