EBV相关胃癌组织CTHRC1基因启动子区甲基化研究

目的分析比较EB病毒(EBV)相关胃癌(EBVaGC)与EBV阴性胃癌(EBVnGC)组织中胶原三股螺旋重复蛋白1(CTHRC1)基因的甲基化状态,探讨EBV感染对CTHRC1基因甲基化的影响。方法采用甲基化特异性PCR检测49例EBVaGC和50例EBVnGC组织中CTHRC1基因启动子区域CpG岛甲基化状态,分析两种胃癌组织中CTHRC1基因甲基化状态及与临床病理特征的关系。结果 EBVaGC组织CTHRC1基因的甲基化状态明显高于EBVnG组织(χ2=14.278,P<0.01)。胃癌组织CTHRC1基因甲基化率与病人性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤浸润程度、肿瘤组织分化程度以及有无淋巴结转移均无关(P>0.05)。结论 EBV感染可使EBVaGC组织中CTHRC1基因甲基化率明显升高。     

表达谱芯片对EB病毒诱导甲基化沉默基因的筛选

目的筛选EB病毒(EBV)相关胃癌中大量EBV诱导的甲基化沉默基因,为EBV相关肿瘤的研究提供理论依据。方法采用Agilent人类全基因组表达谱(4×44K)芯片,检测去甲基化药物Aza作用前后的EBV阳性和阴性胃癌细胞株,筛选出EBV相关胃癌特有的甲基化沉默基因。应用实时荧光定量PCR和亚硫酸盐测序(BGS)方法对结果进行验证。结果去甲基化药物作用前后的EBV阳性细胞系差异基因与EBV阳性与阴性胃癌细胞系差异基因的共同基因共68条,此为EBV相关胃癌甲基化沉默特异性基因。在差异倍数为1.5和2.0时,分别检测到19和3条基因。实时荧光定量PCR和BGS验证结果显示,筛选基因在EBV阳性胃癌细胞系中处于低表达、高甲基化状态。结论筛选和鉴定EBV阳性细胞株甲基化沉默的抑癌基因,对明确EBV相关肿瘤的发病机制具有重要作用。     

痘苗病毒载体介导爱泼斯坦-巴尔病毒潜伏期膜蛋白2A基因转染树突状细胞对其功能的影响

目的：探讨痘苗病毒载体介导爱泼斯坦－巴尔病毒（EBV）潜伏期膜蛋白2A（LMP2A）基因转染树突状细胞（DC）对DC的表型和功能的影响，以及EBV相关肿瘤免疫治疗性疫苗的可行性，方法：用EBV－LMP2A基因重组痘苗病毒（Vac-LMP2A)转染成熟的DC，流式细胞术（FACS）检测转染前后DC表面分子CD1a,CD83,CD40,CD80,HLA-DR变化，3H－TdR掺入法检测转染前后DC刺激同种异体T淋巴细胞增殖等功能的改变。结果：转染后LMP2A蛋白在DC细胞内高表达，Vac-LMP2A转染成熟DC前后对其表面共刺激分子及特征性表面标志无影响，转染后的DC仍具有较强的刺激同种异体TI林巴细胞增殖的能力。结论：痘苗病毒载体是介导外源基因LMP2A转染DC的有效载体，Vac-LMP2A转染成熟DC对DC表型和功能无明显影响，是EBV相关肿瘤如鼻咽癌免疫治疗的理想载体。     

爱泼斯坦-巴尔病毒潜伏期膜蛋白2A cDNA的克隆及序列分析

目的：克隆爱泼斯坦－巴尔病毒（EBV）潜伏期膜蛋白2A（LMP2A）基因，研究其基因工程疫苗，方法：用逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）扩增出EBV B95．8株LMP2A全部编码蛋白的基因，并克隆至载体pGEM-T中，通过α－插入失活，PCR及EcoRⅠ、SmaⅠ限制性内切酶双酶切等鉴定重组质粒，采用Sanger双脱氧终止法测定cDNA片段的核苷酸 序列。结果：克隆出LMP2A第1个外显子到第8个外显子的全部编码蛋白的cDNA，测序结果与EB病毒B95．8原型株LMP2AcDNA作同源比较，完全一致，结论：本实验克隆了LMP2A基因的全部编码蛋白的cDNA全长片段。     

TERT基因启动子区甲基化在胃癌发生发展中的作用研究

目的探讨TERT基因启动子区甲基化水平在胃癌组织与癌旁组织中的差异,并分析TERT基因启动子区甲基化与胃癌组织病理分化、神经转移、浸润深度、TNM分期等临床病理学参数的关系。方法采用Mass ARRAY Epi TYPER芯片检测30例胃癌组织以及胃癌癌旁组织的TERT基因启动子区甲基化水平,应用配对student t检验和线性回归检验,分析TERT基因启动子区甲基化水平在胃癌组织与癌旁组织中的差异以及其与临床病理学参数的关系。结果在胃癌组织和癌旁组织中,平均TERT基因启动子区甲基化水平分别为34.66%和35.72%,差异无统计学意义(P>0.05)。TERT基因启动子区平均甲基化水平与胃癌患者的年龄、性别、病理分化、神经转移、浸润深度、TNM分期等因素均无明显关系(P值分别为0.6290,0.5462,0.7316,0.2393,0.5913,0.0577)。Cp G_1在胃癌组织和癌旁组织中的甲基化水平与性别因素有一定关系(P=0.0498);Cp G_5.6.7、Cp G_15.16、Cp G_17在胃癌组织和癌旁组织中的甲基化水平与TNM分期均有相关关系(P=0.0421,0.0451,0.0204)。结论 TERT基因启动子区甲基化水平在胃癌组织与癌旁组织中没有显著差异,有部分Cp G位点与胃癌性别、TNM分期等临床病理学参数有关。提示临床上联合检测TERT基因部分启动子区甲基化水平对胃癌转移的预测可能会有所帮助。     

食管癌组织RASSF1A基因启动子区甲基化检测及其临床意义

目的探讨Ras相关结构域家族基因1A（RASSF1A）启动子区异常甲基化与食管癌发生发展的关系。方法采用甲基化特异性PCR方法,检测66例食管癌组织及相应的癌旁正常组织RASSF1A基因启动子区异常甲基化。分析食管癌组织中RASSF1A基因启动子区异常甲基化与临床病理特征的关系。结果在食管癌组织、癌旁正常组织中RASSF1A基因启动子区异常甲基化的发生率分别为48．5％（32／66）、6．1％（4／66）。淋巴结转移者食管癌组织中RASSF1A基因启动子区异常甲基化的发生率（61．1％）明显高于无淋巴结转移者（33．3％）（χ^2=5．055,P=0．025）;晚期（Ⅲ～Ⅳ期）食管癌组织中RASSF1A基因启动子区异常甲基化的发生率（69．2％）明显高于早期（Ⅰ～Ⅱ期）（35．0％）（χ^2=7．392,P=0．007）;食管癌组织中RASSF1A基因启动子区异常甲基化与肿瘤分化程度无相关性（P〉0．05）。结论食管癌组织中存在RASSF1A基因启动子区的异常甲基化,甲基化与食管癌病理分期和淋巴结转移有关。     

胃癌MGMT基因启动子甲基化状态与患者临床预后的关系

目的 通过回顾性分析胃癌患者MGMT基因启动子甲基化状态,探讨其对胃癌生存时间的影响.方法 收集经过治疗且通过病理学检查进行确诊的胃癌患者218例,获取胃癌组织及癌旁正常组织,采用甲基化特异性PCR检测MGMT基因启动子甲基化状态,分析其对胃癌生存时间的影响.结果 胃癌组织MGMT基因启动子甲基化状态与TNM分期有关(P＜0.01);胃癌组织MGMT基因启动子甲基化状态、TNM分期及肿瘤大小与胃癌5年生存时间相关(均P＜ 0.05).结论 MGMT基因启动子甲基化是胃癌患者5年生存时间的独立危险因素.     

RASSF1A基因启动子甲基化在胃癌中的检测意义

目的：检测胃癌患者 Ras相关结构域家族基因1 A（RASSF1 A）基因启动子甲基化的情况,探讨其相关的临床意义。方法收集漯河医学高等专科学校第一、第二、第三附属医院2003年2月至2013年10月保存的200例胃癌患者的胃癌组织蜡块,另取30例胃溃疡切除患者的正常胃壁组织作为对照。甲基化特异性 PCR检测 RASSF1 A基因启动子甲基化的改变。结果胃癌患者 RASSF1A基因启动子甲基化的阳性率（37．0％）显著高于对照组（13．3％）,二者比较差异有统计学意义（P＜0．05）。RASSF1A基因启动子甲基化阳性率在临床Ⅲ、Ⅳ期,有淋巴结转移和中、低分化的患者分别为46．2％、47．7％和48．7％,显著高于临床Ⅰ、Ⅱ期,无淋巴结转移和高分化患者的27．1％、28．6％和29．8％（P＜0．05）。RASSF1A基因启动子甲基化阳性患者复发率（16．2％）显著高于阴性患者（5．6％）,二者比较差异有统计学意义（P＜0．05）。结论胃癌组织中 RASSF1A基因启动子甲基化可能参与了胃癌的发生、发展过程,有可能作为胃癌分级、预后评估的新指标。     

EB 病毒 LMP2A 在胃癌研究中的进展

EB 病毒（EBV）是具有致瘤潜能的疱疹病毒,其编码的潜伏性膜蛋白2A（LMP2A）通过多条信号传导通路,参与上皮细胞的转化。 EB 病毒存在于胃癌组织中,在胃癌的发生和发展过程中发挥重要的作用。本文主要就 LMP2A 的结构、介导的信号传导通路与胃癌的关系进行综述。     

胃癌组织中Caveolin-1基因外显子2甲基化状态检测

目的：应用甲基化特异性PCR（MSP）技术检测胃癌组织中Caveotin-1基因外显子2启动子区域5’端CpG岛甲基化状况,探讨Caveolin-1基因甲基化在胃癌发生发展中的作用．方法：收集30例胃癌组织和6例距肿瘤5cm以上的癌旁正常胃组织,运用标准蛋白酶K消化、酚-氯仿抽提法提取组织中基因组DNA,采用CpGenome DNA Modification Kit对DNA进行修饰后以甲基化特异性引物及非甲基化引物进行PCR,通过琼脂糖凝胶电泳及产物测序判定结果．结果：6例癌旁正常胃组织Caveolin-1基因外显子2启动子区域5＇端CpG岛均为甲基化阴性．30例胃癌组织中有27例甲基化阳性,甲基化率为90％（27／30）．其中16例胃癌组织（53．3％）仅有甲基化引物扩增出目的条带,表现为完全甲基化;11例胃癌组织（36．7％）甲基化与非甲基化引物均扩增出目的条带,表现为部分甲基化．统计结果显示胃癌组织中Caveolin-1基因外显子2启动子区域甲基化率显著高于癌旁正常胃组织．结论：胃癌组织中存在Caveolin-1基因外显子2启动子区域高甲基化,且可能参与胃癌的早期过程．     

胃癌组织中微RNA-34b/c和微RNA-124a基因的甲基化

目的 探讨DNA甲基化对微RNA(miRNA)表达的影响.方法 取2009年7至11月天津医科大学总医院新鲜活检标本胃癌组、对照组各40例.应用甲基化特异性PCR(MSP)方法检测组织中miRNA-34b/c和miRNA-124a基因启动子区甲基化.结果 miRNA-34b/c基因启动子区高甲基化阳性率在胃癌组及对照组胃黏膜中分别为77.5%(31/40)和5.0%(2/40),差异有统计学意义(P<0.05).miRNA-124a基因启动子区高甲基化阳性率在两组中分别为60.0%(24/40)和0,差异有统计学意义(P<0.05).miRNA基因启动子区高甲基化阳性率与胃癌临床病理特征有关.结论 胃癌组织存在miRNA-34b/c和miRNA-124a基因启动子区高甲基化,并可能在胃癌的发生发展中起重要作用.

Abstract：

Objective To explore the effects of DNA methylation of microRNA (miRNA) gene on their expressions in patients with gastric carcinoma.Methods A total of 80 subjects were divided into gastric carcinoma group(n=40)and control group(n=40).The DNA methylation status of miRNA-34b/c and miRNA-124a gene promoters was detected by DNA methylation specific polymerase chain reaction (MSP) in gastric carcinoma tissues and normal mucosal tissues.Results The positive rate of DNA methylation of miRNA-34b/c gene promoter was 77.5%(31/40)and 5.0%(2/40)in gastric carcinoma and control groups respectively.There was statistically significant difference between two groups (P<0.05). The positive rate of DNA methylation of miRNA-124a gene promoter was 60.0%(24/40)and 0 in these two groups respectively.There was statistically significant difference between two groups (P<0.05).Also the hypermethylation positivity of gene promoter of miRNAs was correlated with the clinicopathological features of gastric carcinoma.Conclusion The hypermethylation of miRNA-34b/c and miRNA-124a gene promoters may play a crucial role in the occurrence and development of gastric carcinoma.     

鼻咽癌体外传代细胞株SUNE中EBV-LMP_1全基因的扩增

用长片段高保真度ＰＣＲ扩增系统（ｅｘｐａｎｄＴＭｈｉｇｈｆｉｄｅｌｉｔｙＰＣＲｓｙｓｔｅｍ）从鼻咽癌（ＮＰＣ）体外传代细胞株ＳＵＮＥ中扩增出ＥＢ病毒（ＥＢＶ）潜伏膜蛋白（ＬＭＰ１）全基因，经凝胶电泳分析和ＤＮＡ斑点杂交进行鉴定。扩增片段长度为３．４３ｋｂ，相当于Ｂ９５－８细胞ＥＢＶ基因序列位置为１７００３３～１６６６０８ｎｔ，包括ＬＭＰ１基因的上游启动子／增强子序列、ＬＭＰ１编码序列的３个外显子、两个内含子及下游ｐｏｌｙＡ信号序列。ＬＭＰ１全基因的扩增对于深入研究ＬＭＰ１基因的结构与功能以及ＬＭＰ１在ＮＰＣ发生发展中的作用机制具有十分重要的价值。     

EB病毒相关胃癌潜伏感染膜蛋白-1表达的研究

①目的探讨EB病毒阳性胃癌(EBVaGC)中潜伏感染膜蛋白-1(LMP-1)的表达状况。②方法原位杂交法检测胃癌患者石蜡包埋组织标本中EB病毒编码的小RNA(EBV encoded RNA,166bps,EBER-1);免疫组化法检测EBVaGC中LMP-1。③结果EBVaGC中无LMP-1表达。④结论EB病毒阳性胃癌中缺乏潜伏感染膜蛋白LMP1的表达。     

鼻咽癌中p73基因启动子甲基化状态及转录表达的研究

目的探讨鼻咽癌组织中p73基因启动子区甲基化状态及其对转录表达影响。方法运用甲基化特异性PCR和半定量反转录PCR法检测20例正常鼻咽上皮组织、54例鼻咽癌组织中p73基因启动子甲基化状态及其转录表达水平,分析鼻咽癌组织中p73基因甲基化与临床资料的关系以及p73基因甲基化对转录表达的影响。结果 54例鼻咽癌组织中p73基因启动子甲基化阳性率为38.89%(21/54),而正常鼻咽上皮组织中未检测到p73基因启动子甲基化;两组间p73基因启动子甲基化阳性率差异有统计学意义(P<0.01)。鼻咽癌组织中p73基因启动子甲基化与临床资料无关。21例甲基化鼻咽癌组织p73基因相对转录表达水平为1.04±0.64,33例非甲基化鼻咽癌组织p73基因相对转录表达水平为1.51±0.75,两者间有统计学差异(P<0.05),20例正常鼻咽上皮组织p73基因相对转录表达水平为1.12±0.31。结论鼻咽癌组织中p73基因甲基化与转录表达相关,是基因表达调节的一种重要方式,p73基因甲基化具有肿瘤特异性,p73基因甲基化与鼻咽癌发生发展有关。     

EBV-LMP1促CNE2细胞迁移的作用机制

目的：探讨EBV-LMP1对鼻咽癌细胞CNE2迁移表型的影响及作用机制。方法：用RV-LNSX,RV-LMP1和RV-LMP1^TRADD。逆转录病毒分别感染CNE2细胞,G418筛选后,观察和检测转基因细胞的形态学特点,在基质中的运动迁移能力以及R-钙黏蛋白（E-Cadherin）表达的变化;用pLNSX,pLNSX-LMP1和pLNSX—LMPI^TRADD质粒分别与E-Cadherin报告基因共转染293细胞,检测LMP1对E-Cadherin启动子活性的影响。结果：与CNE2和CNE2-LNSX细胞相比,CNE2-LMP1在培养过程中由扁平、鹅卵状上皮细胞形态逐渐演变为细胞间接触消失的长梭状纤维细胞形态,相对迁移明显增大（n=3,P〈0.05）。且E-Cadherin表达明显下调或缺失;随着共转染野生型LMP1（pLNSX-LMP1）剂量的增加（0．2,0、6,1．0μg）,对E／-Cadherin启动子转录活化的抑制率增加,呈明显浓度依赖性;LMPI^TRADD不改变CNE2细胞形态学及迁移表型,对E-Cadherin启动子的转录活性及蛋白表达亦无明显影响。结论：抑制E-Cadherin启动子活化可能是EBV-LMP1下调E-Cadherin蛋白表达、促CNE2细胞迁移的机制之一,位于LMP1羧基端的TRADD可能是其促迁移的主要活性部位。     

鼻咽癌中EB病毒潜伏膜蛋白1启动子的突变

 【目的】 检测EB病毒潜伏膜蛋白1 (LMP1) 远端启动子L1-TR在鼻咽癌(NPC)组织中的突变情况并探讨突变对启动子活性的影响。【方法】 用聚合酶链反应(PCR)方法分别扩增出B95.8细胞和新鲜鼻咽癌组织细胞中EB病毒(EBV)的L1-TR片段,并测序比较其核苷酸序列的差异。构建含原型和突变型L1-TR启动子的荧光素酶报告质粒并分别转染HaCat细胞、B95.8细胞和C666-1细胞,比较两种启动子的活性。【结果】 和B95.8原型比较,鼻咽癌组织中的EB病毒L1-TR启动子区域有多处缺失。插入和点突变,且启动子活性明显降低(P < 0.05)。【结论】 鼻咽癌组织中LMP1启动子 L1-TR的活性与B95.8原型相比明显降低,这在EB病毒的免疫逃避机制中可能有一定的意义。     

食管癌细胞中T钙黏蛋白基因启动子区异常甲基化的研究

目的 探讨食管癌细胞中T钙黏蛋白( T-cadherin)基因启动子区甲基化状态,以及5-杂氮-2’-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)作用对食管癌细胞生长、侵袭以及T-cadherin基因甲基化状态与表达的影响.方法 采用甲基化特异性PCR分析经5-Aza-CdR处理前后食管癌细胞EC1和EC109中T-cadherin启动子甲基化状态,Western印迹检测经5-Aza-CdR处理前后两种细胞中T-cadherin蛋白表达,以MTT比色法与侵袭实验测定细胞增殖与侵袭能力的变化.结果 EC1和EC109细胞中T-cadherin基因启动子区域存在异常甲基化现象,经5-Aza-CdR作用后可逆转启动子异常甲基化,显著上调食管癌细胞中T-cadherin的蛋白表达,同时显著抑制肿瘤细胞的增殖与侵袭能力(P＜0.01).结论 启动子区异常甲基化是导致食管癌细胞中T-cadherin表达水平下调的重要机制,应用5-Aza-CdR可恢复T-cadherin表达并抑制肿瘤细胞的恶性表型.     

子宫颈癌候选抑癌基因Syk表达及其启动子甲基化的测定

采用逆转录PCR（RT-PCR）法检测60例宫颈癌、50例宫颈上皮内瘤变（CIN）和20例正常宫颈组织中SykmRNA的表达,采用甲基化特异性PCR（MSP）检测Syk基因启动子甲基化情况。正常宫颈组织和CINⅠ组织中均有Syk基因表达,CINⅡ-Ⅲ组织56％（18／32）、宫颈癌组织35％（21／60）表达;有淋巴结转移的宫颈癌组织表达比例为1／13,无淋巴结转移者为43％（20／47）。宫颈癌组织中Syk基因启动子甲基化率57％（34／60）,明显高于CIN组织[18％（9／50）,X^2值为7．13,P〈0．01],正常宫颈组织和CINⅠ组织中均无Syk基因启动子的甲基化,淋巴结转移的宫颈癌组织比例为11／13;Syk基因及其启动子甲基化程度与患者年龄、肿瘤大小、临床分期、组织学类型及病理类型无明显相关性（P〉0．05）,与Syk基因表达缺失明显相关（P〈0．05）。Syk基因启动子甲基化可能是导致Syk基因失活的原因之一,可能与宫颈癌发生发展有关。     

宫颈癌RAS相关区域家族1A基因启动子甲基化检测及临床意义研究

目的 检测宫颈癌RAS相关区域家族1A(RASSF1A)基因启动子甲基化状态并探讨其在宫颈癌分子诊断与预后评估中的临床意义.方法 应用甲基化特异性PCR和逆转录PCR分别检测我院2008年1月-2009年1月确诊的65例宫颈癌组织和癌旁正常组织RASSF1A基因启动子甲基化状态和mRNA表达,比较两者间的差异与临床病理因素之间的关系.结果 65例宫颈癌组织中有48例检测出甲基化条带(甲基化率73.8%),mRNA表达呈抑制状态,癌旁组织中有4例检测出甲基化条带(甲基化率6.2%),mRNA表达正常;不同年龄的患者RASSF1A基因启动子甲基化率间差异无统计学意义(P＞0.05);肿瘤直径越大,RASSF1A基因启动子甲基化率越高;宫颈鳞状细胞癌、腺癌和腺鳞癌RASSF1A基因启动子甲基化率分别为82.0%、40.0%和60.0%,三者间差异有统计学意义(P＜0.05);宫颈癌RASSF1A基因启动子甲基化率随着临床分期和淋巴结转移增加而增加,甲基化率在不同国际妇产科联盟(FIGO)分期及有无淋巴结转移中的差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 RASSF1A基因启动子甲基化与宫颈癌的发病机制紧密相关,其在宫颈鳞状细胞癌中甲基化发生率明显高于腺癌,可作为宫颈癌的分子诊断和预后评估的生物标志物.     

甲基转移酶1表达质粒对结肠癌细胞错配修复基因甲基化及其表达的影响

目的 分析DNA甲基转移酶1(Dnmt1)基因的真核表达质粒对人结肠癌细胞错配修复基因甲基化及其转录水平和微卫星不稳定性(MSI)的影响。方法 分别构建含有人的正义Dnmt1(HMT)和反义Dnmt1(THM)的真核表达质粒,将其转染入结肠癌SW1116细胞,以Western印迹实验分析各组细胞Dnmt1蛋白的表达情况。定量PCR检测hMLH1、hMSH2基因的表达。甲基化特异性PCR分析hMLH1、hMSH2启动子区甲基化情况,银染法研究其对微卫星不稳定性的影响。结果 转染正义Dnmt1质粒的细胞hMLH1、hMSH2的启动子甲基化水平升高,基因mRNA表达降低。转染反义Dnmt1质粒可使细胞中hMSH2启动子呈非甲基化状态,基因表达增强。未发现转染正义和反义Dnmt1基因的SW1116细胞存在MSI的变化。结论 重组Dnmt1表达质粒可通过调控人结肠癌细胞中错配修复基因的甲基化影响基因的表达。