新合成壳聚糖季铵盐/DNA复合物在Hela细胞中的转染效率☆

背景：壳聚糖季铵盐衍生物可以提高载体的转染效率,同时解决了壳聚糖溶解性差的问题,扩展了其pH值适用范围。 目的：合成一种新型壳聚糖季铵盐载体,研究其与质粒结合的条件及转染效率,并与壳聚糖进行对比。 设计、时间及单位：分子生物学,对比观察实验,于2008-08/10在浙江大学医学院附属第二医院完成。 材料：壳聚糖季铵盐——N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖为北京理工大学高分子材料实验室合成。质粒pEGFP-C1为浙江大学医学院郑一春惠赠。Hela细胞为浙江大学医学院程静提供。 方法：将N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖配制成质量浓度为0.2 g/L、pH值为5.5(或6.9、7.6)、乙酸钠终浓度为50 mmol/L的乙酸溶液,迅速与质粒pEGFP-C1混合,并在旋转混合器上涡流15~30 s,室温静置30 min以上,促进复合物的形成。 主要观察指标：通过凝胶阻滞实验研究了pH值及时间对壳聚糖季铵盐与质粒结合能力的影响。通过荧光倒置显微镜观察壳聚糖季铵盐作为载体转染Hela细胞的效率,并与壳聚糖进行对比。 结果：N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖能够在酸性、中性及碱性条件下溶解,并能够与质粒DNA很好的结合形成复合物,拓展了其使用范围。在酸性条件下,N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖与质粒的结合作用强于壳聚糖。壳聚糖及N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖在酸性条件下,30 min即可与质粒形成稳定的复合物,并在12 h内保持良好的稳定性。Hela细胞的体外转染结果表明,N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的转染效率大于壳聚糖。 结论：N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖所适用的pH值范围较壳聚糖更加广泛,其稳定性与壳聚糖无明显差别,并且对Hela细胞的体外转染效率略高于壳聚糖,值得对其进行更深入的研究。 关键词：壳聚糖季铵盐;基因载体;Hela细胞;转染     

壳聚糖季铵盐的最新研究进展*★

学术背景：壳聚糖作为一种性能卓越的生物材料已广泛应用在各个领域，但其在某些方面还存在一定的缺陷和不足。对壳聚糖进行改性可以得到新的衍生物壳聚糖季铵盐，增强了正电性和在水中的溶解性，体现壳聚糖季铵盐在生物医学方面的新性能。 目的：综述壳聚糖季铵盐在生物医学和轻工业等领域的最新研究进展。 检索策略：查找有关壳聚糖季铵盐应用研究方面的文献，应用计算机检索PUBMED数据库和EBSCO数据库，检索词“quaternary AND chitosan”，年限不限，限定语言为英语；计算机检索维普资讯中文科技期刊数据库，检索词为“壳聚糖，季铵盐”，年限为1989/2007，限定语言为中文。同时手工检索有关书籍。在PUBMED上共收集到39篇相关的英文文献，在EBSCO数据库中搜索到55篇相关的英文文献，在维普资讯上共搜索到55篇相关的中文文献，对文献进行筛选，并确定纳入标准：①选取针对性强，相关度高的文献。②对同一领域的文献选择近期发表或权威杂志的文献；排除重复研究和Meta分析类文章。最后27篇被选用。 文献评价：选用27篇文献，均为临床与实验研究。 资料综合: 壳聚糖作为优良的生物材料，应用已十分广泛，但是它的水不溶性限制了它在很多方面的运用。新的壳聚糖衍生物壳聚糖季铵盐克服了壳聚糖本身的溶解性差的缺点，在生理条件下也能很好地溶解，在生物相容性、抗菌性、吸湿保湿等性能方面均明显优于壳聚糖。 结论：壳聚糖季铵盐的研究已经成为各领域研究的新热点，其应用前景将更加广阔，对相关作用的认识有待于进一步深入。     

壳聚糖作为基因载体及其改性*★

学术背景：基因治疗是近年来全球研究的热点，其最大障碍是缺乏有效的基因载体。非病毒性载体比病毒性载体具有更高的安全性，因而越来越受到人们关注。壳聚糖具有优良的生物相容性、生物可降解性、低毒以及高正电荷，是一种良好的非病毒性基因载体。带正电荷的壳聚糖能与带负电荷的DNA形成聚电解质复合物，有效复合保护质粒DNA免遭DNase酶解，使基因得以传递和表达。 目的：概述壳聚糖作基因载体及其改性研究所取得的有意义的最新研究进展。 检索策略：应用计算机检索Science Direct，Springer, Wiley数据库和中国期刊全文数据库1991-01/2007-12的有关文献，检索关键词为“壳聚糖、基因载体、DNA、进展”。共检索到425篇相关文献，其中英文文献217篇，中文文献208篇。对文献进行筛选，选取关键文章，对同一领域的文献选择近期发表或权威杂志的文献，排除重复研究的文章。最后70篇被选用。 文献评价：所选用的70篇文献中，60 篇为英文文献，10篇为中文文献；其中10篇为综述，其余均为实验研究论文。 资料综合：壳聚糖有优良的生物相容性、生物可降解性，无免疫原性，是当今最具潜力的非病毒性基因载体之一。通过优化壳聚糖的分子质量、脱乙酰度、N/P比、血清浓度和介质的 pH值等可对壳聚糖的转染效率和细胞吸收进行调控。化学改性壳聚糖，尤其是偶联配体可传递基因进入靶细胞。 结论：改性后的壳聚糖可作为潜在的优良基因载体。     

壳聚糖季铵盐包裹甲状旁腺激素相关肽制备纳米缓释颗粒

摘要 背景：小范围研究显示,低剂量、间歇性应用甲状旁腺激素相关肽能有效治疗绝经后妇女骨质疏松症。但其存在着易变性、半衰期短、价格昂贵等缺陷,因此研制应用缓释系统控制甲状旁腺激素相关肽的释放速度,提高其生物利用效率极为必要。 目的：制备一种新型纳米载药颗粒,探讨其对甲状旁腺激素相关肽的包封及体外释放特性。 方法：采用离子交联法制备壳聚糖季铵盐纳米载药颗粒,用傅里叶红外光谱、透射电镜等进行表征,检测纳米颗粒的包封及体外释放特性。 结果与结论：在常温磁力搅拌条件下,当壳聚糖季铵盐与三聚磷酸钠投药量为5︰1~2︰1时可形成纳米颗粒,粒径100~ 180 nm,为规则球形,甲状旁腺激素相关肽投药质量浓度越高时包封率增大但载药量有所减少,体外PBS溶液中纳米载药颗粒表现出缓慢释放特性。 关键词：壳聚糖;壳聚糖季铵盐;纳米粒子;甲状旁腺激素相关肽;体外释放 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2011.03.019     

阳离子聚合物基因载体的理论研究

目的：介绍阳离子聚合物非病毒基因载体的种类,并分析它们各自的特点和作用。 资料来源：以基因治疗,非病毒载体,阳离子聚合物,壳聚糖,环糊精为检索词,检索清华同方数据库(1980-01/2009-01)。以gene therapy, non-viral vectors, Cationic polymer, chitosan, cyclodextrin为检索词,检索sciencedirect数据库(1980-01/2009-01)。文献检索语种限制为英文和中文。 资料选择：纳入阳离子聚合物作为非病毒基因载体的实验研究,排除其他形式基因载体的研究。 结局评价指标：①细胞毒性。②基因表达率。③转染效率。 结果：计算机初检得到154篇文献,根据纳入排除标准,对阳离子聚合物作为非病毒基因载体的种类和治疗作用进行分析。目前,应用于基因治疗的载体主要有病毒载体和非病毒载体两种。病毒载体转染效率高,但存在免疫原性高、毒性大、目的基因容量小、靶向特异性差、制备较复杂及费用较高等缺点。因此,人们愈来愈重视非病毒载体的研究。阳离子聚合物作为非病毒基因载体显示出巨大的优势和潜力。它不但可以降低药物在细胞内的蓄积和毒性,还可以通过自身的降解来控制基因的释放。阳离子聚合物用作非病毒基因治疗载体包括多聚赖氨酸类共聚物、聚氨酯、聚乙烯亚胺阳离子共聚物、聚磷腈类、壳聚糖类及其衍生物和环糊精及其衍生物。 结论：阳离子非病毒载体相比于其他非病毒载体,具有毒性低,基因转染率高,释药可控制等优点,是一种相对安全、高效的非病毒基因载体。 关键词：基因治疗;非病毒载体;阳离子聚合物;壳聚糖;环糊精     

壳聚糖颅内局部缓释化疗载体的初步研究

目的探讨壳聚糖作为颅内局部缓释化疗载体的可行性。方法64只SD大鼠,随机分为实验组和对照组,分别于颅内注入50μl壳聚糖混悬液或生理盐水,术后3d、7d、14d和30d采样,双抗体夹心酶标免疫分析法测量血清中NSE和S-100蛋白含量,并观察脑组织形态学变化。结果两组血清NSE和S-100蛋白水平在各时间点均无显著差异。组织学上除实验组局部有轻度异物有反应外,与对照组无明显差异。结论壳聚糖对脑组织无明显不良影响,可用作颅内局部缓释化疗的载体。     

口服胰岛素载体材料的研究现状**

摘要：作为口服胰岛素载体的材料主要是高分子材料和脂质体。天然高分子材料主要集中在多糖的研究;脂质体具有类似细胞膜的结构,有很好的生物相容性,但本身不够稳定,因此主要集中在经表面修饰的脂质体研究;合成高分子的形态较多,用于口服胰岛素载体的形态主要有微球、水凝胶、囊泡等。文章探讨了近几年来国内外关于高分子材料和脂质体作为药物载体包埋胰岛素的研究现状,但至今尚未见到实际应用在糖尿病治疗的临床报告,主要原因是口服胰岛素的生物利用度低,制剂的稳定性等尚未解决。随着药物新剂型、药物载体材料和制药技术的不断研究和发展,期望能研发出方便、安全、稳定的口服胰岛素制剂。     

构建人热休克蛋白70基因重组腺病毒载体及鉴定

背景：腺病毒载体作为低毒高效的基因载体已被广泛应用,但是人热休克蛋白70基因腺病毒载体较为少见。 目的：构建重组人热休克蛋白70基因的腺病毒载体,鉴定外源基因在真核细胞中的良好表达。 方法：采用AdMax腺病毒系统将外源基因人热休克蛋白70基因重组入腺病毒载体中,转染人胚肾293细胞并重组包装出毒,检测外源基因的表达和病毒滴度。 结果与结论：观察转染后的人胚肾293细胞出现明显细胞病变效应后,收获并纯化重组病毒;荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况良好,Western blot检测人热休克蛋白70蛋白表达良好,收获病毒的滴度为1×1011 efu/mL,证明实验已成功构建携带人热休克蛋白70基因的重组腺病毒载体。     

骨髓间质干细胞作为基因载体治疗胶质瘤的研究进展

胶质瘤基因治疗的传统载体及神经干细胞都存在缺陷,近期研究表明骨髓间质干细胞作为胶质瘤治疗的新型载体,具有强大的迁移力、趋瘤性及低免疫原性和免疫调节功能等优点。     

叶酸-壳聚糖介导survivin shRNA基因纳米载体的制备***★

背景：叶酸-壳聚糖纳米粒是一种新型的高靶向纳米载体，可进一步提高药物的靶向性，并进一步实现缓释和控释给药。 目的：探讨叶酸-壳聚糖纳米粒作为survivin shRNA重组质粒载体传递系统的可行性以及对大肠癌细胞(SW480)的转染效率。 设计、时间及地点：对比观察实验，于2008-06/2009-01在中南大学卫生部纳米生物技术重点实验室完成。 材料：壳聚糖(脱乙酰度>90%)由上海伯奥生物科技有限公司提供，叶酸由国药集团化学试剂有限公司提供，survivin shRNA重组质粒由上海吉凯基因化学技术有限公司提供。 方法：首先制备粒径均匀的叶酸偶联壳聚糖纳米粒，然后将20 mg/L survivin shRNA重组质粒和10 mg/L 叶酸-壳聚糖混合制备基因纳米复合物，同时以阳离子脂质体基因复合物作为对照，将上述两者转染大肠癌细胞。 主要观察指标：基因纳米复合物的理化性质及转染效率；Western blotting检测转染后肿瘤细胞中survivin蛋白的表达。 结果：成功制备叶酸-壳聚糖介导的survivin shRNA重组质粒基因纳米复合物。该基因纳米复合物转染大肠癌细胞的效果强于阳离子脂质体基因复合物。且转染后大肠癌细胞中survivin蛋白的表达显著低于阳离子脂质体基因复合物。 结论：叶酸-壳聚糖纳米粒作为载体系统能将survivin shRNA重组质粒高效递送到大肠癌细胞，从而诱导人大肠癌细胞的凋亡。     

Targeted in utero delivery of a retroviral vector for gene transfer in the rodent brain

In vivo application of viral vectors for gene transfer is a commonly used tool in anatomical and functional studies, as well as in development of neuroprotective and restorative strategies for therapy. Although the most common route of administration is via direct injection into the brain parenchyma in adult animals, a number of short-term studies have been performed in the developing central nervous system. Here we investigated the long-term transgene expression following in utero delivery of a retroviral vector encoding for the green fluorescent protein (GFP) marker gene at embryonic days 14.5-17.5 using an ultrasound-guided injection system. Intraparenchymal injections of the ganglionic eminence were compared with vector delivery to the intracerebroventricular space. Injections into the ganglionic eminences resulted in a predominantly unilateral transduction localized to the forebrain, giving rise to GFP-positive (GFP+) neurons and astrocytes in the striatum, olfactory bulb, cortex and hippocampus. When the vector was injected into the lateral ventricle, on the other hand, widespread expression of GFP was seen throughout the brain. The total number of GFP+ cells in the striatum was estimated to be between 20,000 and 50,000 cells using a computerized stereological quantification tool. Phenotypic characterization of these transduced cells using confocal microscopical analysis showed that 64% were NeuN+ neurons, 14% APC+ oligodendrocytes and 15% glial cells labelled with GFAP, S100beta and Iba1, when the vector injection was performed at E14.5. Delivery into later embryos resulted in a reduction in neuronal profiles with a reciprocal increase in glial cells.     

单纯疱疹病毒Ⅰ型基因治疗载体的快速构建

背景：单纯疱疹病毒Ⅰ型载体因具有独特的优点目前被广泛应用,但其构建尚缺乏一种快速有效的方法。 目的：利用Cre/Loxp高效重组系统构建单纯疱疹病毒Ⅰ型载体。 方法：分离单纯疱疹病毒HSV-1,将含Cre重组酶的c66-SV40-cre质粒转染Vero细胞,构建一株带有Loxp位点的重组HSV-1框架载体HSVLoxp。构建穿梭载体pShuttle- SV40-Cre-Loxp-IRES及重组单纯疱疹病毒Ⅰ型载体HSV-GDNF,用HAT培养基筛选出阳性毒株后用GDNF引物做PCR鉴定,扩增培养后测定滴度。 结果与结论：成功构建pHV-TK-GFP质粒,并在Vero细胞内发生重组,分离出缺失了Us3基因的重组病毒HSVtk-Loxp-GFP01。成功构建HSV-1框架载体HSVLoxp及穿梭载体pShuttle- SV40-Cre-Loxp-IRES,成功获得GDNF基因,并将其转移到了HSV-1基因组上,成功构建了表达GDNF的单纯疱疹病毒HSV-1载体,测定其滴度约为2.25×106 IU/mL。     

大鼠半乳凝素9基因克隆及真核表达载体的构建

背景：研究提示,半乳凝素9在介导细胞分化、凋亡、黏附、细胞间聚集、炎症反应的调控方面发挥作用,但其作用机制尚不明确。 目的：克隆大鼠半乳凝素9基因片段,构建pDC316-GFP-Galectin-9真核表达质粒,以进一步了解半乳凝素9各种功能和反应机制, 设计、时间及地点：单一样本观察,于2008-11/2009-01在北京本元正阳基因技术有限公司完成。 材料：SPF级雄性Lewis大鼠1只。 方法：采用反转录聚合酶链反应技术,从大鼠肝脏组织中扩增出大鼠半乳凝素9基因片段,通过基因重组技术将该基因片段重组到pDC316-GFP真核表达载体上,构建pDC316-GFP-Galectin-9重组质粒,通过用PCR扩增、酶切电泳分析及DNA测序的方法对重组DNA进行鉴定。 主要观察指标：重组质粒的鉴定结果。 结果：总RNA经RT-PCR扩增后,经琼脂糖凝胶电泳,在1 kb下方可见一条明显扩增的条带,与预计的半乳凝素9-cDNA长度相符。重组质粒经NotⅠ/HindⅢ双酶切和未作酶切的重组质粒pDC316-GFP-Galectin-9一起经琼脂糖凝胶电泳,前者出现了980 bp和5.8 kb 2条带(980 bp为Galectin-9-cDNA产物,5.8 kb为pDC316-GFP线状质粒),后者出现6.7 kb条带(重组质粒pDC316-GFP-Galectin-9),初步表明重组质粒构建成功。测序结果用NCBI上的BLAST进行比对分析,其核酸序列与GeneBank中的半乳凝素9的mRNA的编码序列(NM_012977)同源性完全相符,进一步证实所克隆的基因为大鼠半乳凝素9-cDNA。 结论：成功克隆了半乳凝素9基因并构建成其真核表达质粒。     

Beclin1 基因慢病毒表达载体的构建和鉴定*☆

背景：Beclin1基因是哺乳动物的自噬调控基因。 目的：实验拟构建Beclin1 基因慢病毒过表达载体。 方法：聚合酶链反应扩增目的基因Beclin1 后插入慢病毒表达载体pLenex中,构建重组载体pLenex-Beclin1。使用聚合酶链反应、双酶切和DNA的测序方法对其进行鉴定,并与辅助包装质粒共感染293T细胞。慢病毒颗粒转染非小细胞肺癌A549细胞后,用蛋白质印迹法检测Beclin1 基因的过表达效率。 结果与结论：聚合酶链反应鉴定结果显示扩增的阳性片段已插入pLenex载体,聚合酶链反应、双酶切和DNA测序结果表明,重组慢病毒载体pLenex-Beclin1 的插入序列完全正确,重组慢病毒载体感染A549细胞后,细胞内Beclin1蛋白高效表达。结果证实,实验成功构建了Beclin1 基因慢病毒过表达载体。     

构建携带重组人胰岛素基因慢病毒表达载体及其病毒包装

背景：腺病毒载体作为脂肪组织工程转基因载体,在应用中存在转导细胞免疫排斥及炎症反应等问题。应用慢病毒作为载体转染干细胞尤其是应用含胰岛素基因的慢病毒载体转染干细胞可避免腺病毒载体的诸多问题。 目的：实验拟构建含有人重组胰岛素(insulin)与增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)基因慢病毒表达载体pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP,并进行病毒颗粒包装。 方法：应用聚合酶链反应方法获得目的基因,在目的基因上、下游分别加上BamHⅠ,AscⅠ两个酶切位点,进行T载体克隆,转化入感受态DH5α细胞中,通过筛选获得重组质粒。用限制性内切酶酶切,将目的基因片段和pLenti6.3-IRES-EGFP载体连接,转化入感受态DH5α细胞中,通过筛选获得慢病毒表达载体pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP,并进行测序。抽提慢病毒载体,转染293T细胞,包装病毒,测定病毒滴度。 结果与结论：通过聚合酶链反应获得长度为347 bp带有BamHⅠ和AscⅠ序列的目的基因。pMD18-T 载体和慢病毒表达载体pLenti6.3-IRES-EGFP连接,慢病毒表达载体pLenti6.3 -insulin-IRES-EGFP构建与预期相匹配,成功包装慢病毒颗粒。     

ORMOSIL nanoparticles as a non-viral gene delivery vector for modeling polyglutamine induced brain pathology

Studies have shown the presence of expanded polyQ containing proteins in brain cells related to Huntington disease (HD) and other poly-glutamine disorders. We report the use of organically modified silica (ORMOSIL) nanoparticles as an efficient non-viral gene carrier in an effort to model brain pathology associated with those disorders induced by expanded polyQ peptides. In experiment 1, plasmids expressing Hemaglutinin-tagged polypeptides with 20 glutamine repeats (Q20) or with extended 127-glutamine repeats (Q127) were complexed with ORMOSIL nanoparticles and injected twice (2 weeks apart) into the lateral ventricle of the mouse brain. Fourteen days post-injection of Q127, immunocytochemistry revealed the presence of the characteristic nuclear and cytoplasmic Q127 aggregates in numerous striatal, septal and neocortical neuronal cells as well as ubiquitin-containing aggregates indicative of the neuronal pathology. The mice receiving Q127 showed a marked increase in the reactive GFAP (+) astrocytes in striatum, septum and brain cortex, further indicating the neurodegenerative changes, accompanied by motor impairments. In experiment 2, plasmids Q20 or Q127 were complexed with ORMOSIL and were injected into the brain lateral ventricle or directly into the striatum of adult rats. In both routes of transfection, Q127 induced the appearance of reactive GFAP (+) astrocytes and activated ED1 antigen expressing microglia. An increase in the size of the lateral ventricle was also observed in rats receiving Q127. In transgenic mouse polyQ models, extensive pathologies occur outside the nervous system and the observed brain pathologies could reflect developmental effects of the toxic polyQ proteins. Our experiments show that the nervous tissue restricted expression of poly Q-extended peptides in adult brain is sufficient to evoke neuropathologies associated with HD and other polyQ disorders. Thus, nanotechnology can be employed to model pathological and behavioral aspects of genetic brain diseases in mice as well as in other species, providing a novel research tool for in vivo testing of single or multi-gene therapies.     

小鼠IL-10重组腺病毒载体的构建及对树突状细胞的基因修饰

目的 构建mIL-10腺病毒重组体Ad-mIL-10,获得mIL-10基因修饰的树突状细胞。方法 根据IL-10基因序列及腺病毒载体的多克隆位点,合成包括酶切位点的基因序列,连接到pMD18-T载体并测序鉴定。用基因工程的方法将小鼠IL-10基因克隆到BD Adeno-XTM腺病毒载体,于人胚肾293细胞中包装、扩增病毒并测定IL-10蛋白表达,转染到体外培养的小鼠骨髓来源的树突状细胞。结果 成功构建小鼠Ad-mIL-10重组腺病毒载体并高包装、扩增成功,测定高表达IL-10蛋白,体外成功培养小鼠骨髓来源的小鼠树突状细胞并顺利转染Ad-mIL-10。结论 用基因工程方法构建小鼠Ad-mIL-10重组腺病毒载体并转染小鼠骨髓来源的树突状细胞是可行的,为进行相关的基因治疗的可能性提供了更充足的理论依据。     

Cdc2基因敲低逆转录病毒载体设计与构建方法

目的设计和构建cdc2基因敲低的表达siRNA的逆转录病毒重组载体。方法利用在线软件siRNASelectionProgram和siDirect设计干扰cdc2基因靶序列,合成回文DNA序列,退火后克隆至线性化pSUPER质粒载体,重组质粒载体扩增、抽提后行双酶切电泳鉴定和测序分析,再转染phoenix细胞,产生逆转录病毒,并利用NIH3T3细胞测定病毒滴度。结果pSUPER表达siRNA重组质粒载体经双酶切电泳鉴定和DNA测序分析,证实插入的60bp序列与原序列一致,位置正确。pSUPER.retro-C1、pSUPER.retro-C2病毒滴度值分别为4.25×105CFU/ml和6.00×105CFU/ml。结论cdc2基因表达siRNA逆转录病毒重组载体构建成功,可为研究胶质瘤分子病因学提供有用工具。