rhBMP_2作用下人牙乳头细胞内Smad1分子的转位变化

目的:观察骨形成蛋白(bone morphogenetic protein)特异的细胞内信号转导分子Smadl在人牙乳头细胞内的表达及信号转位过程,从细胞内信号转导水平探讨牙齿发育过程中成牙本质细胞的分化机制。方法:原代培养人牙乳头细胞,用转化生长因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)和重组人骨形成蛋白骨形成蛋白2(recombinant hu-man bone morphogenetic protein,rhBMP2)刺激培养的细胞,对照组用0.2％FCS的DMEM的培养液培养,不加任何刺激。免疫组化观察。结果: TGF-β1和rhBMP2刺激组均可见Smadl蛋白表达,但与对照组相比无明显差异;rhBMP2组可见Smadl从胞浆转位至核内聚集,TGF-β1组未见此作用。结论:首次观察到Smadl基因在人牙乳头细胞内的表达并参与信号转位过程,提示BMP2在牙乳头细胞内信号传递可能是通过Smadl转位至核内引起基因表达实现的。     

骨形成蛋白-2对人牙乳头细胞内Smad1蛋白表达量的影响

目的：观察人牙乳头细胞内Smad1蛋白的表达及骨形成蛋白－2（bone morphogenetic protein-2,BMP2)对人牙乳头细胞内Smad1蛋白表达量影响，方法：原代培养的人牙乳头细胞用BMP2处理6h,12h,24h,48h后，提取总蛋白质，采用Western Bolt法，从翻译水平观察Smad1基因的表达变化。结果：从翻译水平观察到Smad1基因在人牙乳头细胞内的表达，但在BMP2作用48h内，Smad1蛋白表达量无显著变化，结论：人牙乳头细胞内存在Smad1信号转导途径，牙乳头细胞内Smad1蛋白表达量不受MBP2影响。     

人牙乳头细胞内Smad2在TGF—β1信号转导中的作用的研究

目的 观察体外原代培养的人牙乳头细胞内Sad2蛋白的表达,以及Smad2蛋白在转化生长因子-β1信号转导中的作用,探讨Smad2信号途径在TGF-β1调控牙乳头细胞向成牙本质细胞分化过程中的作用机制。方法 原代培养人牙乳头细胞,Western blot杂交方法检测内源性Smad2的表达和TGF-β1调控下的表达变化,用免疫组化方法观察Smad2细胞内定位变化。结果培养的人牙乳头细胞表达Ｓmad2蛋白,ＴＧＦ－β１能引起Ｓmad2从蛋白表达水平未见明显的改变。结论 人牙乳头细胞内存在Ｓmad2基因的表达,Ｓmad2能被ＴＧＦ－β１能引起Smad2从胞浆转位至核内聚集,而BMP-2无此功能;TGF-β或BMP-2刺激作用6h、12h24h和48h,牙乳头细胞内Smad2蛋白表达水平未见明显的改变。结论 人牙乳头细胞内存在Smad2基因的表达,Smad2能被TGF-β1活化后转位至核内发挥作用,但Smad2基因的表达无明显变化,提示TGF-β1在调控牙乳头细胞向成牙本质细胞分化的过程中,Smad2信号途径可能发挥一定的作用。     

人牙乳头细胞内Smad4表达的免疫组化研究

观察转化生长因子－β超家族的细胞内信号转导分子Ｓｍａｄ４在人牙乳头细胞内的表达及信号转位过程,从细胞内信号转导水平探讨牙齿发育过程中成牙本质细胞的分化机制。方法：原代培养人牙乳头细胞,用转化生长因子－β１（ｔｒａｎｓｆｏｒｎｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ－β１,ＴＧＦ－β１）和骨形成蛋白－２（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈｕｍａｎｂｏｎｅｍｏｒｐｈｏｇｅｎｎｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎ,ｒｈＢＭＰ－２）刺激培养     

Smad2蛋白在人牙乳头细胞内的表达及信号转位过程

观察体外原代培养的人牙乳头细胞内Ｓｍａｄ２蛋白的表达,以及Ｓｍａｄ２蛋白在转化生长因子－β１（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ－β１,ＴＧＦ－β１）信号转导中的作用。方法原代培养工牙乳头细胞,用ＴＧＦ－β１和骨形成蛋白－２（ｂｏｎｅｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎ,ＢＭＰ２）刺激培养的细胞,免疫化观察。结果：ＴＧＦ－β１和ＢＭＰ２刺激组均可见Ｓｍａｄ２蛋白表达,但与对照组相     

人牙乳头细胞内Smad5蛋白表达的免疫组化研究

目的：观察Smad5蛋白在体外原代培养的人牙乳头细胞内的表达及其在转化生长因子－β超家族信号转导中的作用。方法：原代培养的人牙乳头细胞,分别以骨形成蛋白－2（bone morphogenetic protein-2,BMP－2）和转化生长因子－β1（transforming growth factor－β1,TGF－β1）刺激,免疫组化检测Smad5的表达,图像分析仪半定量。结果：人牙乳头细胞（空白对照组）胞浆内可见Smad5阳性表达,胞核内未见阳性表达;BMP－2实验组胞核内Smad5强阳性表达,胞浆内为弱阳性表达;TGF－β1实验组细胞胞浆Smad5阳性,胞核未见表达。结论：人牙乳头细胞内存在Smad5的表达,Smad5能转导BMP－2信号至核内发挥作用,但不能TGF－β1信号,提示BMP－2在牙齿发育过程中信号传递可能是通过Smad5的信号途径实现的。     

Smad4基因在人牙乳头细胞内的表达及其意义的探讨

目的：观察转化生长因子－β超家族特异的细胞内信号转导基因Ｓｍａｄ４在人牙乳头细胞内的表达,及其在转化生长因子－β１１（ＴＧＦ－β１）的骨形成蛋白－２（ＢＭＰ－２）作用下的变化,从细胞内信号转导水平探讨牙齿发育过程中成牙本质细胞的分化机制。方法：原代培养人牙乳头细胞,用ＴＧＦ－β１和ＢＭＰ－２刺激培养的细胞,分别从刺激前后的细胞中提取总ＲＮＡ和总蛋白,采用Ｎｌｒｔｈｅｒｎ和Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹杂交方法     

人牙乳头细胞内Smad2在TGF-β1信号转导中作用的研究

目的观察体外原代培养的人牙乳头细胞内Smad2蛋白的表达,以及Smad2蛋白在转化生长因子-β1信号转导中的作用,探讨Smad2信号途径在TGF-β1调控牙乳头细胞向成牙本质细胞分化过程中的作用机制.方法原代培养人牙乳头细胞,Westernblot杂交方法检测内源性Smad2的表达和TGF-β1调控下的表达变化,用免疫组化方法观察Smad2细胞内定位变化.结果培养的人牙乳头细胞表达Smad2蛋白,TGF-β1能引起Smad2从胞浆转位至核内聚集,而BMP-2无此功能;TGF-β1或BMP-2刺激作用6h、12h、24h和48h,牙乳头细胞内Smad2蛋白表达水平未见明显的改变.结论人牙乳头细胞内存在Smad2基因的表达,Smad2能被TGF-β1活化后转位至核内发挥作用,但Smad2基因的表达无明显变化,提示TGF-β1在调控牙乳头细胞向成牙本质细胞分化的过程中,Smad2信号途径可能发挥一定的作用.     

人牙乳头细胞内Smad2在TGF-β_1信号转导中作用的研究

目的　观察体外原代培养的人牙乳头细胞内Smad2蛋白的表达 ,以及Smad2蛋白在转化生长因子 β1信号转导中的作用 ,探讨Smad2信号途径在TGF β1调控牙乳头细胞向成牙本质细胞分化过程中的作用机制。方法　原代培养人牙乳头细胞 ,Westernblot杂交方法检测内源性Smad2的表达和TGF β1调控下的表达变化 ,用免疫组化方法观察Smad2细胞内定位变化。结果　培养的人牙乳头细胞表达Smad2蛋白 ,TGF β1能引起Smad2从胞浆转位至核内聚集 ,而BMP 2无此功能 ;TGF β1或BMP 2刺激作用 6h、12h、2 4h和 48h ,牙乳头细胞内Smad2蛋白表达水平未见明显的改变。结论　人牙乳头细胞内存在Smad2基因的表达 ,Smad2能被TGF β1活化后转位至核内发挥作用 ,但Smad2基因的表达无明显变化 ,提示TGF β1在调控牙乳头细胞向成牙本质细胞分化的过程中 ,Smad2信号途径可能发挥一定的作用。     

人牙乳头细胞Smad1基因MH2结构域的cDNA的分子克隆

目的：从人牙乳头细胞内克隆骨形成蛋白（BMP）细胞内信号转导基因Smad1的功能性结构域－－MH2结构域。方法：原代培养人牙乳头细胞,从培养的细胞中提取总DNA,逆转录合成cDNA第1条链;设计上下游引物,进行RT－PCR,扩增Smad1基因MH2结构域的基因片段;将所获得的基因片段定向插入PUC19载体;转化大肠杆菌JM109,挑选阳性克隆,鉴定后进行序列测定。结果：获得的Smad1 MH2结构域的cDAN片段大小为444bp,并且成功构建PUC19／MH2重组质粒。结论：人牙乳头细胞内存在Smad1信号转导途径,BMP调控人牙乳头细胞分化可能是通过Smad1信号途径实现的。     

BMP2对人牙乳头细胞c-fos和c-jun诱导作用的研究

目的:探讨生长因子BMP2对体外培养的人牙乳头细胞c-fos和c-jun表达的诱导作用.方法:采用免疫组织化学和图像分析的方法,观察特定浓度的BMP2在不同时问点对体外培养的人牙乳头细胞c-fos和c-jun表达的影响.结果:不加刺激时人牙乳头细胞c-fos、c-jun在胞浆阴性表达,胞核不表达或弱阳性表达.200 ng/mL BMP2刺激30 min后,c-fos和c-jun在胞浆胞核均出现表达,但较稀疏;刺激lh胞核胞浆内表达明显增强,浆内表达较核内弱;2 h c-fos和c-jan在细胞核内表达最强,12 h胞核着色明显变浅,24 h基本已无阳性着色.结论:生长因子BMP2可诱导体外培养的人牙乳头细胞c-fos和c-jun表达,整个过程约持续24 h;c-fos和c-jun的表达存在核转位现象,提示c-fos和c-jun参与了BMP2的信号转导过程.     

人牙髓细胞Smad2基因MH2结构域的cDNA 克隆和序列测定

目的：从人牙髓细胞内克隆转化生长因子－β特异的细胞内信号转导基因Ｓｍａｄ２的功能性结构域———ＭＨ２结构域。方法：原代培养人牙髓细胞,从培养的细胞中提取总ＲＮＡ,逆转录合成ｃＤＮＡ第１条链;设计内、外侧两对引物,进行巢式ＰＣＲ,扩增Ｓｍａｄ２基因ＭＨ２结构域的基因片段;将所获得的基因片段定向插入ｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔⅡＳＫ（＋）载体;转化大肠杆菌ＪＭ１０９,挑选阳性克隆并鉴定;用ＰＥ３１７－Ａ型自动测序仪进行核苷酸序列测定分析。结果：测序结果与国外从人肾ｃＤＮＡ文库中克隆的基因序列完全一致。结论：首次从人牙髓细胞中克隆成功Ｓｍａｄ２基因的ＭＨ２结构域,证实了Ｓｍａｄ２基因在人牙髓细胞中的表达;提示人牙髓细胞内存在Ｓｍａｄ２信号转导途径,ＴＧＦ－β对人牙髓细胞分化的调节可能是通过Ｓｍａｄ２信号转导途径实现的。     

甲状旁腺激素对人牙乳头细胞牙本质基质蛋白1表达的影响

目的：观察甲状旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)对体外培养的人牙乳头细胞(human dental papilla cells，HDPC)牙本质基质蛋白1(dental matrix protein，DMP1)合成分泌的影响。方法：原代方法培养出人牙乳头细胞，用不同浓度的甲状旁腺激素刺激培养的第5代人牙乳头细胞，免疫组化观察结果，并采用图像分析的方法，进行半定量分析。结果：PTH可刺激人牙乳头细胞DMP1的表达，诱导的DMP1主要表达于细胞胞浆内，呈一定的浓度依赖性，0．3μg／mL为刺激最佳浓度。结论：PTH能够刺激人牙乳头细胞产生DMP1，对牙乳头细胞向成牙本质细胞分化有一定促进作用，可能是成牙本质细胞分化的重要介质之一。     

Recombinant human bone morphogenetic protein-2 stimulates osteoblast differentiation and suppresses matrix metalloproteinase-1 production in human bone cells isolated from mandibulae

Bone morphogenetic protein (BMP), a member of the transforming growth factor superfamily, is one of the most potent growth factors that stimulate osteoblast differentiation and bone formation. We investigated the effects of recombinant human BMP-2 (rhBMP-2) on osteoblast differentiation and matrix metalloproteinase-1 (MMP-1) production in human bone cells (HBC) isolated from mandibulae of 3 adult patients. rhBMP-2 at concentrations over 50 ng/ml significantly stimulated alkaline phosphatase activity and parathyroid hormone (PTH)-dependent 3′, 5′-cyclic adenosine monophosphate accumulation, which are early markers of osteoblast differentiation, in HBCs. rhBMP-2 (500 ng/ml) also enhanced the level of PTH/PTH related-peptide receptor mRNA expression in HBCs. Although neither HBCs untreated nor treated with rhBMP-2 produced measurable amounts of osteocalcin, which is a marker of more mature osteoblasts, 1,25-dihydroxyvitamin D₃ [l,25(OH)₂D₃] induced ostocalcin mRNA expression and its protein synthesis in these cells. rhBMP-2 inhibited l,25(OH)₂D₃-induced osteocalcin synthesis in HBCs at both the mRNA and protein level. rhBMP-2 also significantly suppressed MMP-1 production and MMP-1 mRNA expression at concentrations over 500 ng/ml. These results suggest that rhBMP-2 exerts anabolic effects on human osteoblastic cells derived from mandibulae by stimulation of osteoblast differentiation and down-regulation of MMP-1 synthesis.     

BMP-2和地塞米松对体外培养大鼠牙囊细胞矿化能力的影响

目的:探讨BMP-2和地塞米松联合作用对大鼠牙囊细胞分化能力的影响,为牙囊细胞在牙周组织工程中的应用提供实验依据。方法:取生长状态良好的第3代大鼠牙囊细胞,血清饥饿同步化后,分别加入含BMP-2(100ng/ml)、地塞米松Dex(10-8mol/ml)、BMP-2(100ng/ml)+地塞米松(10-8mol/ml)的DMEM培养液,通过碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒、钙化结节染色分别检测不同诱导条件下对大鼠牙囊细胞分化的影响。结果:经BMP-2、Dex、BMP-2+Dex诱导后,体外培养的大鼠牙囊细胞碱性磷酸酶活性均显著高于未诱导组,各组间ALP活性与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)。BMP-2+Dex诱导组ALP活性最强,与BMP-2诱导组间差异有统计学意义(P<0.01),而与Dex诱导组间ALP活性则差异无统计学意义(P>0.01)。培养14d时,BMP-2+Dex诱导组牙囊细胞ALP活性增强最为显著,与BMP-2诱导组及Dex诱导组相比差异均有统计学意义(P<0.01)。矿化结节计数分析显示,各组细胞矿化结节形成的数量及面积明显存在显著的差异,BMP-2、Dex、BMP-2+Dex诱导组与未诱导组相比,其矿化结节形成量差异均有统计学意义(P<0.01),BMP-2+Dex诱导组矿化结节形成量明显大于BMP-2和Dex单独诱导组。结论:BMP-2、地塞米松均能促进牙囊细胞的分化,然而两者联合作用促分化的能力最为显著,提示其在牙周组织工程中的应用前景。     

hBMP2基因转染对人牙龈成纤维细胞生物学特性的影响

目的分析hBMP2基因转染人牙龈成纤维细胞的生物学特性.方法用脂质体转染法将hBMP2基因转入人牙龈成纤维细胞内,经G418筛选后,获得阳性克隆.以原位杂交和免疫组化对转染细胞进行鉴定;进一步观察细胞形态、生长特性、碱性磷酸酶活性、骨钙素合成以及体外形成矿化结节的能力.结果hBMP2基因转染后,人牙龈成纤维细胞有hBMP2 mRNA的转录和蛋白表达;部分细胞由原来的长梭形转化为多角形,碱性磷酸酶活性和骨钙素合成均明显高于对照组(两组均P＜0.01);在矿化液作用下,能形成体外矿化结节.但细胞的增殖特性无明显变化.结论外源性hBMP2基因能够在人牙龈成纤维细胞表达,并促进其向成骨细胞方向转化,而对细胞的生长特性无明显影响.