树突状细胞负载MAGE-n表位肽的体外免疫学效应研究

目的：研究树突状细胞（dendritic cell,DC）负载MAGE-n表位肽QLVFGIEVV体外诱导特异性CTL的能力及其抗肿瘤效应。方法：MAGE-n表位肽以固相多肽合成技术合成,并用HPLC进行纯化,质谱法（MS）鉴定,以流式细胞仪筛选HLA-A2＋人外周血PBMC,连续贴壁法分离培养人外周血来源树突状细胞,用成熟的DC负载MAGE-n表位肽QLVFGIEVV反复刺激活化诱导抗原特异性CTL,用51Cr释放法检测CTL的杀伤活性,并用抗HLA-A2分子单抗进行杀伤抑制实验。结果：用DC负载MAGE-n表位肽QLVF-GIEVV可诱导特异性CTL反应,对MAGE-n阳性表达细胞有较强的杀伤作用。结论：DC负载抗原肽QLVF-GIEVV在体外可诱发较强的特异性免疫反应。     

抗原致敏树突状细胞诱导CIK对胃癌细胞杀伤作用的研究

[目的]探讨抗原致敏的树突状细胞（DC）诱导CIK（cytokine induced killer）的杀伤作用。[方法]联合应用粒/巨细胞集落刺激因子（GM-CSF）及白介素-4（IL-4）从外周血单个核细胞中培养DC，用人胃癌细胞SGC提取肿瘤抗原致敏DC，流式细胞仪检测致敏前后DC表型的变化，用人胃癌细胞SGC提取肿瘤抗原致敏DC诱导CIK，用MTT法检测淋巴细胞的增殖及原致敏DC诱导CIK对SGC的杀伤效应。[结果]①利用GM-CSF及IL-4可从外周血单个核细胞中获取DC，肿瘤抗原可促进DC的成熟，肿瘤抗原致敏可促进DC成熟，细胞表面分子HLA-DR、CD86、CD86升高，CD14下降。②混合淋巴细胞反应提示成熟的DC可促进CIK细胞增殖。③SGC肿瘤抗原致敏DC诱导CIK对胃癌细胞SGC有特异性的杀伤作用，随着效靶比的升高，杀伤效应随之增强。[结论]抗原致敏的DC可通过诱导特异性CIK细胞及促进CIK细胞增殖两方面显著提高CIK细胞的杀瘤效应。     

Bcap37完全细胞抗原冲击树突状细胞诱导特异性抗乳腺癌免疫实验研究

目的　研究 Bcap37完全细胞抗原冲击树突状细胞 (DC)能否诱导特异性抗肿瘤免疫 ,探索乳腺癌的免疫治疗方法。方法　从人外周血分离单核细胞 ,用 GM- CSF和 IL - 4诱导出 DC,反复冻融制备 Bcap37完全细胞抗原 ,将此抗原冲击的 DC与 T细胞共培养 ,以 7天后分离的 T细胞为效应细胞 ,与肿瘤细胞混合培养 ,MTT法测定对肿瘤细胞的抑制作用。结果　单核细胞经细胞因子诱导 8天 ,形态、表型及功能鉴定为成熟 DC;完全细胞抗原冲击 DC诱导的 T细胞对肿瘤细胞具有明显的抑制作用。结论　 Bcap37完全细胞抗原冲击 DC可有效诱导特异性抗肿瘤免疫     

冻存后人脐血DC介导的食管癌细胞瘤苗实验研究

目的：探讨杂交瘤技术制备脐血树突状细胞（DC）和食管癌细胞的融合瘤苗在低温冻存后的生物学特性及特异性CTL活性。方法：分离脐血CD34^＋干细胞诱导扩增为成熟DC，与EC109细胞经聚乙二醇（PEG）法融合；免疫磁珠法筛选EC109-DC；鉴定瘤苗表型；-80℃低温冰箱冻存融合细胞EC109-DC，3周后融冻；观察融冻瘤苗表型及致瘤性；MTT法测定瘤苗诱导淋巴细胞增殖能力及体外特异性免疫应答能力。结果：融冻后疫苗体外半悬浮生长；同时高表达FR和CD80；融冻后瘤苗接种小鼠体内未见肿瘤形成；未冻存和冻存后融合疫苗EC109-DC活化的T淋巴细胞，可产生针对EC109细胞的特异性杀伤作用。结论：冻存未破坏融合疫苗的完整性；融冻后瘤苗无体内致瘤性，安全可靠；-80℃低温冰箱短期冻存对EC109-DC融合疫苗生物学特性及特异的CTL活性无明显影响，可望为DC疫苗提供简单可行的保存方法。     

连续贴壁法分离培养人外周血来源树突状细胞及其超微结构的观察

目的改进人外周血单个核细胞分离培养树突状细胞的方法,电镜观察树突状细胞超微结构。方法利用连续贴壁法分离获得CD14 前体细胞,经人重组粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、白介素-4(rhIL-4)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导产生成熟DC,流式细胞仪检测DC表面标志物表达水平,透射电镜(TEM)观察树突状细胞超微结构。结果连续贴壁法体外分离培养人外周血DC,所获得DC数量和纯度均都多于以往一次贴壁分离培养的DC。培养1周的DC高表达CD1a、CD40、HLA-DR、CD80、CD86。透射电镜观察到不同状态树突状细胞的超微结构。结论连续贴壁法可分离培养数量较大、纯度较高的人外周血来源DC。     

人外周血树突状细胞诱导及免疫学特性研究

[目的]从人外周血分离、纯化、扩增树突状细胞(DC),并对其形态学和免疫学特性进行初步探讨.[方法]从人外周血分离DC前体细胞(主要为CD14 细胞)用重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)和重组人白细胞介素-4(rhIL-4)联合培养,诱导扩增成熟DC.观察DC形态、分析DC表型、核型及检测DC激发同种异体淋巴细胞增殖能力.[结果]分离的DC前体经rhGM-CSF和rhIL-4共同培养1周后,可获得大量成熟DC,扩增了24.5倍,纯度达90%以上.DC高表达分化抗原CD86、CD40、HLA-DR、CD83、CDIa,能强烈激活同种异体T淋巴细胞增殖.[结论]人外周血CD14 细胞经体外诱导培养,可以生成大量功能成熟的DC,从而为进一步开展DC的基础研究和临床应用打下基础.     

四种不同来源的树突状细胞的性能比较研究

目的:探讨正常人外周血单按细胞、肿瘤患者外周血单按细胞、脐带血CD34^ 细胞、非淋巴细胞白血病细胞来源的树突状细胞性能差异。方法：分别利用正常人及肿瘤患者的外周血分离单个核细胞，黏附贴壁法收集单核细胞，在GM-CSF、IL-4及TNF-α细胞因子组合下诱导树突状细胞；脐带血细胞则利用MACS系统分离纯化CD34^ 细胞作为树突状细胞的前体细胞，培养体系为FL SCF GM-CSF IL-4 TNF-α；非淋巴细胞白血病细胞作为树突状细胞的前体细胞培养条件同CD34^ 细胞。流式细胞仅分析诱导细胞的表型，电镜分析细胞形态。结果：利用4种不同来源的前体细胞在不同细胞因子组合下可分别诱导出DC细胞，细胞CD1a，CD80，HLA-DR的表达较诱导分化前明显上调．细胞形态学表明4种细胞来源的DC均有较典型的DC细胞形态，并均可刺激同种异体T细胞的增生。结论：利用健康人或肿瘤患者外周血可成功诱导出树突状细胞，利用脐血CD34^ 细胞及部分非淋巴细胞白血病原代细胞也可体外诱生出树突状细胞，不同来源的树突状细胞在形态及初步功能上无明显区别。     

肺癌患者外周血树突状细胞的生物学特性研究

目的：探讨肺癌患者外周血来源的树突状细胞（dendritic cells, DC）生物学特性。方法：从肺癌患者外周血分离获得单个核细胞，用细胞因子GMCSF (100 μg/L)，IL4 (50 μg/L)体外培养诱导。凋亡肿瘤细胞负载24 h后加入TNFα（10 μg/L）或CD40激发型单抗于培养DC中，继续诱导3～4 d。分别测定DC的表型、DC摄取抗原能力；混合淋巴细胞反应（MLR）对T细胞增殖能力的测定；细胞计数和3HTdR掺入观察DC对T细胞的激发和扩增效应，并与健康志愿者外周血来源的DC进行比较。结果： 患者外周血单个核细胞和正常人外周血单个核细胞来源的DC均高表达CD1α，CD83，CD80，CD86和HLADR等DC的相关抗原和共刺激分子；患者的未成熟DC能有效摄取FITCDextran，经TNFα或CD40激发型单抗激发诱导后，成为成熟和有功能的DC,几乎完全失去对抗原的摄取能力，与健康人外周血来源DC组相比无明显差别(P>0.05)；患者单个核细胞来源的DC在体外具有激发自体和同种异体外周血T细胞增殖的能力。结论：肺癌患者的外周血来源单个核细胞可以诱导成为具有功能的成熟DC。     

树突状细胞负载MAGE-n表位肽的体外免疫学效应研究

目的:研究树突状细胞(dendritic cell,DC)负载MAGE-n表位肽QLVFGIEVV体外诱导特异性CTL的能力及其抗肿瘤效应。方法:MAGE-n表位肽以固相多肽合成技术合成,并用HPLC进行纯化,质谱法(MS)鉴定,以流式细胞仪筛选HLA-A2+人外周血PBMC,连续贴壁法分离培养人外周血来源树突状细胞,用成熟的DC负载MAGE-n表位肽QLVFGIEVV反复刺激活化诱导抗原特异性CTL,用51Cr释放法检测CTL的杀伤活性,并用抗HLA-A2分子单抗进行杀伤抑制实验。结果:用DC负载MAGE-n表位肽QLVF-GIEVV可诱导特异性CTL反应,对MAGE-n阳性表达细胞有较强的杀伤作用。结论:DC负载抗原肽QLVF-GIEVV在体外可诱发较强的特异性免疫反应。     

肝癌患者与正常人外周血树突状细胞的诱导与功能的比较研究

目的对比研究肝癌患者和正常人外周血树突状细胞（Dc）的诱导及其功能异同,探讨能否从肝癌患者外周血诱导出功能正常、具有抗肿瘤作用的DC疫苗。方法取肝癌患者和正常人外周血分离DC前体细胞,应用rhGM—CSF、rhIL-4及肝癌细胞抗原诱导DC。观察DC生长过程的形态学变化,以流式细胞术检测DC表面分子;EUSA法检测DC培养上清中IL-12水平;3H—TdR掺入法检测肝癌细胞抗原致敏DC刺激T细胞增殖的能力;乳酸脱氢酶4小时释放法检测肝癌细胞抗原致敏DC诱导的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的杀瘤活性。结果从肝癌患者和正常人外周血DC前体细胞诱导的DC具有相似的生长过程和细胞形态及功能,其表面分子HLA—DR、CD1a、CD83、CD80、CD86、ICAM-1的表达水平、DC培养上清中IL-12水平、DC刺激T细胞增殖的能力以及所诱生的CTL杀瘤活性等方面比较,差异均无统计学意义（P〉0．05）。结论可从肝癌患者外周血诱导出功能正常并具有抗肿瘤作用的DC瘤苗,为以DC基础的肝癌的免疫治疗提供实验依据。