甘氨酸转运子:由基因敲除揭示的主要药理作用

基因敲除实验揭示了体内高亲和力甘氨酸转运子(GLYT)的功能。研究纯合型敲除小鼠发现,GLYT可能是调节抑制性甘氨酸神经传递的特异性临床靶标。杂合型小鼠的分子及行为学分析揭示,GLYT1抑制剂在治疗某些神经和精神疾病方面的潜力。中枢神经系统(CNS)中的GLYT甘氨酸是CNS脊髓背侧的主要抑制性神经递质。在中枢听觉神经元回路、视觉感觉区及脑干痛觉通路中,作用于特异性士的宁敏感的甘氨酸受体。甘氨酸还参与兴奋性神经传递,可与谷氨酸联合激动作用NMDA受体,结合于经修饰的NMDA受体位点(GSM),这对离子通道开放及受体内化非常重要…     

水通道4基因敲除对吗啡诱导小鼠条件性位置偏爱及神经发生的影响

目的 研究水通道4(AQP4)基因敲除对吗啡(Mor)诱导的小鼠条件性位置偏爱(CPP)及神经发生的影响.方法 取野生型(WT)和AQP4基因敲除型(KO)小鼠,分别连续8 d sc给予生理盐水(WT-Con和KO-Con组)或Mor 10 mg·kg-1(WT-Mor和KO-Mor组),同时训练小鼠,建立小鼠CPP模...     

内皮素A型受体在内皮素1诱发小鼠急性瘙痒中的作用

目的探讨内皮素A型受体(ETAR)在内皮素1(ET-1)诱发小鼠急性瘙痒过程中的作用。方法应用外周感觉神经元中条件性敲除ETAR基因技术,将转基因小鼠分为两组,即全部外周感觉神经元中条件性敲除ETAR基因(Advillin^cre/ETAR^f/f)小鼠(9只)和外周伤害性感觉神经元中条件性敲除ETAR基因(SNS^cre/ETAR^f/f)小鼠(7只),并分别以各自同窝的ETAR^f/f转基因小鼠(9只和7只)作为野生型对照。在颈背部皮内注射ET-1 50 ng,观察四组小鼠在注射后45 min内出现的抓挠次数。结果 Advillin^cre/ETAR^f/f小鼠的抓挠次数较同窝ETAR^f/f小鼠减少(P<0.01),但不能完全消除抓挠行为。SNS^cre/ETAR^f/f小鼠的抓挠次数也较同窝ETAR^f/f小鼠减少(P<0.05)。Advillin<...     

AQP4参与雌激素对单胺类神经递质的调节作用

目的：探讨AQP4对雌激素调节神经递质作用的影响。方法：应用雄性AQP4基因敲除型CD1小鼠与野生型CD1小鼠，给予不同剂量雌激素后测定不同脑区中单胺类神经递质的含量。结果：AQP4基因敲除型雄性小鼠纹状体多巴胺（DA）及5-羟色胺（5-HT）、皮层去甲肾上腺素（NE）含量增加；海马NE、下丘脑DA水平下降。同时，给予雌激素后，野生型雄性CD1小鼠纹状体DA、5-HT含量及海马5-HT含量升高，皮层DA、5-HT水平及下丘脑NE、DA水平下降；而雌激素对AQP4敲除型雄性CD1小鼠单胺类递质无显著影响。结论：AQP4敲除可改变雌激素对单胺类递质水平的调节作用，对纹状体内DA水平的影响尤为显著。AQP4参与了雌激素对单胺类神经递质的调节。     

小鼠bcl10基因敲除载体的构建

根据已知的cDNA序列设计引物，通过RT-PCR获得小鼠bcl10基因cDNA片段作为探针，用噬斑原位杂交法克隆129品系小鼠的bcl10基因组DNA，在亚克隆完成序列结构分析的基础上，利用常规分子克隆技术，构建完成了针对bcl10基因的替代型基因敲除载体。两条同源臂分别为bcl10基因exon3上游2.4kb和exon4下游4.5kb的基因片段。构建完成替代型小鼠bcl10基因敲除载体，为后续获得bcl10基因缺陷型胚胎干细胞系奠定了实验基础。     

双重荧光实时 PCR 法鉴定 SRBⅠ基因敲除小鼠

目的 建立一种双重荧光实时 PCR 鉴定 B 族Ⅰ型清道夫受体（SRBⅠ）基因敲除小鼠的方法。方法 提取小鼠尾尖 DNA, 应用自行设计的鉴定野生型和敲除型 SRBⅠ基因的引物和探针, 经 PCR 扩增后, 在 FAM 通道及CY5 通道判断小鼠基因型。同时应用基因测序技术对结果进行验证, 并构建质粒标准品分析该方法的灵敏度和重复性。结果 仅在 FAM 通道出现典型 S 型扩增曲线的为 SRBⅠ基因野生型小鼠, 仅在 CY5 通道出现典型 S 型扩增曲线的为 SRBⅠ基因敲除型小鼠, 在两个通道都出现典型 S 型扩增曲线的为 SRBⅠ基因杂合型小鼠。结果与 DNA测序法吻合, 检测野生型和突变型的灵敏度均达 4×101拷贝/μL。结论 新方法简单、 快速、 准确, 适用于分型SRBⅠ基因敲除小鼠。     

基因敲除动脉粥样硬化小鼠模型研究进展

基因敲除小鼠动脉粥样硬化模型是目前较为认可的探讨动脉粥样硬化发病机制及寻找新药物靶点的关键工具,也应用于潜在抗动脉粥样硬化药物的药理和毒理研究。载脂蛋白E(ApoE)、低密度脂蛋白受体(LDLR)和B类Ⅰ型清道夫受体(SR-B1)等基因的表达促进机体脂质、胆固醇和低密度脂蛋白等转运和代谢,维持血管正常功能,敲除这些基因会引起脂质转运及代谢紊乱从而诱发动脉粥样硬化及并发症的发生发展。常见的基因敲除小鼠有ApoE基因敲除、LDLR基因敲除及其改良品系,这些模型小鼠能够客观反映敲除基因对动脉粥样硬化发生的影响,且广泛应用于动脉粥样硬化的非临床研究。本文阐述了当前基因敲除小鼠动脉粥样硬化模型的机制、应用和优缺点,以期为动脉粥样硬化发病机制研究及抗动脉粥样硬化药物筛选提供参考。     

nNOS参与OGD介导的促神经干细胞增殖效应

目的：体外研究脑缺血促神经发生的机制。 方法： 体外培养神经干细胞（neural stem cells,NSCs）与海马神经元,并采用氧糖剥夺模型（oxygen and glucose deprivation, OGD）模拟在体缺血,通过RT-PCR、Western blot、免疫细胞化学、酶活性测定、亚硝酸盐/硝酸盐（nitrite/nitrate,NOx） 含量测定等多种方法研究神经干细胞的生物学行为以及介导这种效应的分子机制。结果： （1）OGD通过直接和间接（神经元）作用增加神经干细胞中BrdU＋ 细胞比例。（2）OGD上调神经干细胞中神经元型一氧化氮合酶（neuronal nitric oxide synthase,nNOS）并下调神经元中nNOS,且都有利于神经干细胞增殖。（3）采用nNOS基因敲除小鼠来源的神经干细胞以及神经元（用于共培养）进行实验,发现OGD并不能升高神经干细胞中BrdU＋ 细胞比例。 结论：神经干细胞和神经元中nNOS水平变化共同参与了OGD诱导的促神经干细胞增殖效应。     

TLR9基因敲除小鼠的构建及表型初步鉴定

目的构建TLR9基因敲除小鼠模型,并对其表型进行初步鉴定。方法利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建TLR9基因敲除小鼠;利用毛细管凝胶电泳技术鉴定敲除小鼠的基因型,并通过PCR产物测序分析对敲除效果进行鉴定;利用qRT-PCR和Western blot及免疫组织化学技术分别检测TLR9基因在mRNA水平和蛋白质水平的表达情况;观察基因敲除小鼠的遗传性状、体重及血常规变化;并通过苏木精-伊红(HE)染色观察小鼠组织的病理形态学变化。结果 PCR和测序结果表明TLR9基因敲除成功。敲除小鼠的脾、肝组织中TLR9基因mRNA及蛋白质水平表达显著低于野生型小鼠;TLR9基因敲除小鼠可正常生长繁殖,体重、外周血血常规各项指标均正常。TLR9基因敲除小鼠各组织形态学特征与野生型小鼠相比无明显差异。结论成功建立TLR9基因敲除小鼠模型,为研究TLR9基因的生物学功能和调控机制提供实验动物模型。     

Caveolin-1在载脂蛋白E基因敲除小鼠动脉粥样硬化形成中的变化

目的：探讨caveolin-1在apoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化形成过程中的变化。方法：取正常和apoE基因敲除小鼠(品系均为C57BL／6J)作为研究对象，分别观察不同周龄apoE基因敲除小鼠血清甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白的含量及主动脉横断面积、斑块面积的变化。免疫组织化学染色法对caveolin-1进行半定量及定位分析，Western-blotting检测caveolin-1在主动脉的表达。结果：apoE基因敲除小鼠的血清甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白水平与对照组比较显著升高，并随小鼠周龄增加而升高；斑块面积及斑块面积与主动脉面积的比值也随小鼠周龄增加而增大。免疫组织化学染色法显示，caveolin-1在实验组血管内膜表达呈阳性减弱，其程度随周龄增加有减少趋势。免疫印迹检测显示实验组caveolin-1的表达与对照组比较有所减弱，并与小鼠周龄呈负相关。结论：apoE基因敲除小鼠主动脉内皮细胞caveolin-1表达下调，可能与其动脉粥样硬化形成有关。     

外源表达持续活化型Gli2对小鼠星形胶质细胞生物学特性的影响

目的探讨外源表达持续活化型Gli2对小鼠星形胶质细胞生物学特性的影响。方法构建可表达持续活化型Gli2的慢病毒载体,包装慢病毒颗粒,继而感染小鼠星形胶质细胞,对其生物学特性的改变进行鉴定。结果研究发现,含有外源表达的持续活化型Gli2的小鼠星形胶质细胞在神经干细胞培养基中连续培养13 d后可获得形成细胞球的能力,且形成的细胞球与正常的小鼠神经球在形态上相近;对所形成的细胞球做免疫荧光染色,结果显示神经干细胞的特异性标志物Nestin呈阳性。结论在小鼠星形胶质细胞中外源表达持续活化型Gli2后可使其获得形成神经球样细胞球的能力。     

TET2在心肌纤维化中的作用初探

探究TET2在异丙肾上腺素(ISO)诱导的小鼠心肌纤维化中的作用及机制。构建ISO构建的TET2敲除小鼠和野生型小鼠模型，Western blot检测心肌组织中TGF-β1/Smad3、Collagen1和Collagen3的表达，HE及马松染色检测心肌组织病理学改变，心脏超声评估心功能。TET2在ISO诱导的小鼠心肌组织中表达显著升高；在心肌纤维化模型中，TET2敲除小鼠较野生型小鼠心功能下降，心肌组织中TGF-β1/Smad3、Collagen1和Collagen3表达升高，同时HE及马松染色示TET2敲除小鼠心肌纤维化加重。TET2通过TGF-β1/Smad3信号通路参与小鼠心肌纤维化。     

FKBP38蛋白对子宫内膜癌前期病变的影响及其机制研究北大核心CSCD

目的构建子宫特异敲除FKBP38小鼠模型,探究FKBP38对于小鼠子宫内膜癌前期病变的影响及其作用机制。方法通过胚胎注射法使小鼠FKBP38基因上携带loxP位点,构建转基因小鼠模型。在此基础上,以在子宫特异表达的孕酮受体启动子Pgr-Cre小鼠介导FKBP38条件性敲除,以获得FKBP38子宫特异敲除小鼠模型Pgr-Cre;FKBP38^(fl/fl)。通过PCR及Western blot对子宫特异敲除FKBP38小鼠进行鉴定;通过苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining,HE)检测小鼠子宫敲除FKBP38后组织病理性变化;通过Western blot技术检测小鼠子宫敲除FKBP38后对mTOR通路的影响。结果小鼠子宫特异敲除FKBP38后子宫中FKBP38蛋白表达水平明显降低,与同年龄同窝小鼠相比,差异有统计学意义(P<0.01)。在己烯雌酚刺激下,小鼠18月龄时,子宫特异敲除FKBP38小鼠中16.7%(1/6)发生复杂性非典型性增生(complex atypical hyperplasia,CAH),33.3%(2/6)发生简单性增生(simple hyperplasia,SH)。此外,子宫特异敲除FKBP38小鼠子宫中AKT、S6及4E-BP-1蛋白的磷酸化水平明显升高。结论子宫特异敲除FKBP38小鼠子宫中FKBP38蛋白明显降低,表明小鼠子宫特异敲除模型构建成功。此外,子宫特异敲除FKBP38后,小鼠发生SH以及CAH,表明FKBP38可能与子宫内膜癌癌前病变相关。这可能与FKBP38调控mTOR通路关键性蛋白Akt、S6及4E-BP-1蛋白的磷酸化相关。     

TDO2基因敲除小鼠模型的建立和初步表型研究

目的构建TDO2基因敲除的C57BL/6小鼠,初步研究其表型。方法根据CRISPR/Cas9技术原理,设计并体外转录sgRNA,用显微注射法将Cas9、sgRNA同时注射到小鼠的受精卵。经胚胎移植,获得可能出现多种基因型并存的F0代小鼠。利用PCR法进行基因型判定,获得阳性F0代小鼠。由阳性F0代小鼠与野生型小鼠回交得到F1代杂合子小鼠。阳性F1代杂合子小鼠之间配繁,得到F2代纯合子小鼠。观察和分析纯合子小鼠的生长特性,繁殖能力和子代存活率。Western blot验证TDO2基因敲除纯合子小鼠肝脏组织中TDO2的蛋白表达。结果成功繁育和鉴定出TDO2基因敲除小鼠,PCR法成功鉴别了子代鼠的基因型;Western blot结果表明,TDO2基因敲除小鼠的肝脏组织中TDO2蛋白不表达。TDO2基因敲除小鼠饮食、体质量等未发现异常改变。结论成功建立TDO2基因敲除小鼠,为研究TDO2基因的生物学功能和在疾病中的调控作用提供实验手段。     

载脂蛋白M通过内皮型一氧化氮合酶发挥抗炎作用

目的 探讨载脂蛋白M(apoM)的抗炎作用与内皮型一氧化氮合酶(eNOS)表达的关系。方法 用携带apoM基因的慢病毒(apoM^Tg)和空载慢病毒(apoM^TgN)分别转染人脐静脉细胞融合细胞株EA.hy926,随后分为apoM^Tg+TNF-α组、apoM^TgN+TNF-α组、apoM^Tg组和apoM^TgN组，采用RT-PCR检测细胞中apoM和eNOS mRNA表达，Western blot法检测apoM和eNOS蛋白表达以及eNOS磷酸化水平。选取16只apoM基因野生型(apoM^+/+)小鼠随机均分为apoM^+/++脂多糖(LPS)组和apoM^+/+组，16只apoM基因敲除型(apoM^-/-)小鼠随机均分为apoM^-/-+LPS组和apoM^-/-组，采用RT-PCR检测小鼠肾脏组织中apoM和eNOS mRNA表达。结...     

肝脏特异性Nampt基因敲除对缺血性脑卒中的影响

目的烟酰胺磷酸核糖转移酶(nicotinamide phosphoribosyltransferase,Nampt)是缺血性脑卒中的治疗新靶点。本研究旨在阐明肝脏来源的Nampt是否对缺血性脑卒中具有保护作用。方法运用Cre/loxP系统制备肝脏特异性Nampt基因敲除小鼠。将Nampt^loxP/loxP小鼠与肝脏特异性表达Cre重组酶小鼠(Alb-Cre)进行杂交,采用聚合酶链反应方法鉴定子代基因型。测定基因敲除小鼠和同窝对照小鼠的体重。蛋白免疫印迹法检测小鼠肝脏和脑中Nampt蛋白的表达。采用电凝法对肝脏特异性Nampt基因敲除小鼠和对照小鼠制备大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)脑卒中模型,造模24 h后对各组小鼠进行神经功能损伤评分,TTC染色测定脑梗死体积,ELISA法检测各组小鼠血浆Nampt水平。结果成功构建肝脏特异性Nampt基因敲除小鼠,其基因型为Nampt^loxP/loxP Alb-Cre。肝脏特异性Nampt基因敲除组肝脏Nampt蛋白表达与对照组相比下降74.2%...     

鉴定清道夫受体BI基因敲除突变小鼠的新方法

目的建立一种清道夫受体BI(SR-BI)基因敲除突变小鼠基因型的鉴定方法。方法参照碱基淬灭探针技术原理,设计鉴定野生型和突变型SR-BI基因的引物探针。反应体系经PCR扩增后,利用融解曲线功能判断小鼠基因型。结果新方法可在1h内完成基因型分析。野生型和突变型纯合子小鼠分别在(53.25±0.81)℃及(62.25±0.31)℃处出现单个融解谷;而杂合子小鼠在两处均出现融解谷。结论新方法简单、快速、准确,适用于鉴别SR-BI基因敲除突变小鼠的基因型。     

动脉粥样硬化小鼠主动脉组织中CXCL16和MMP-1表达

目的探讨动脉粥样硬化小鼠主动脉组织中CXC型趋化因子配体16(CXCL16)和MMP-1的表达。方法选取8周龄的SPF级ApoE基因敲除(ApoE^-/-)雄性小鼠10只,给予高脂饲料喂养构建动脉粥样硬化模型(实验组),另选取8周龄的SPF级雄性小鼠10只给予普通饲料喂养作为对照组。两组小鼠均在喂养8周后处死,将心脏-主动脉整条分离。采用Western blot法检测两组小鼠主动脉组织中CXCL16和MMP-1蛋白表达。采用RT-PCR法检测主动脉组织中CXCL16和MMP-1 mRNA表达。结果实验组小鼠主动脉组织CXCL16和MMP-1蛋白表达量高于对照组(P<0.05)。实验组小鼠主动脉组织CXCL16和MMP-1 mRNA表达量高于对照组(P<0.05)。结论动脉粥样硬化小鼠主动脉组织中高表达炎症因子CXCL16和MMP-1。     

专题五、其他神经-精神疾病及其药物治疗——Ciproxifan镇痛作用及其中枢机制

目的：观察H3受体阻断药ciproxifan的镇痛作用，并探讨其可能的中枢机制。方法：选用小鼠formalin痛觉模型，观察ciproxifan对formalin引起的Ⅰ相和Ⅱ相小鼠痛觉行为的影响；formalin痛觉模型半小时后，取小鼠脑和脊髓，超声破胞后分离神经元胞浆和胞膜，用western blot的方法观察神经型一氧化氮合酶（nNOS）往膜上转移的情况，即nNOS的活化情况。formalin痛觉模型1小时后，取小鼠脑和脊髓，做冰冻切片。     

MicroRNA-204/-211敲除加重DMM小鼠骨关节炎滑膜增生和滑膜炎症

目的 观察microRNA-204/-211敲除对内侧半月板失稳术（destabilization of the medial meniscus,DMM）所致骨关节炎（osteoarthritis, OA）小鼠的影响。方法使用12只C57BL/6J(WT)小鼠和12只microRNA-204/-211基因敲除（miR-204/-211-dKO）小鼠，WT小鼠随机分为假手术组和DMM组，即WT-control组和WT+DMM组；miR-204/-211-dKO小鼠随机分为假手术组和DMM组，即dKO组和dKO+DMM组。WT+DMM组和dKO+DMM组行DMM。Von Frey法测定小鼠对疼痛的敏感性。3个月后取材，膝关节行微计算机断层扫描（Micro-CT）检测、组织染色以及免疫组化分析，RT-qPCR检测DRG组织中相关疼痛和炎症因子。结果与WT-control组小鼠相比，WT+DMM组小鼠出现骨赘形成、软骨下骨硬化、疼痛阈值下降等典型OA症状，软骨中Ⅱ型胶原的表达降低、MMP13的表达升高，DRG中炎症因子以及疼痛相关因子的表达明显升高。与此同时，miR-204/-211 dKO+...