重组外源性人热休克蛋白70基因真核表达载体的构建及鉴定

背景：热休克蛋白70的肿瘤免疫作用近年来受到国内外学者的广泛关注,然而目前常用的诱导内源性热休克蛋白70表达的方法,如热应激、缺血预处理等均存在一些弊端。 目的：拟构建携带并正确表达外源性人热休克蛋白70基因的重组真核表达载体。 方法：外源性热休克蛋白70基因连接入真核表达载体pDC315-EGFP中,转化大肠杆菌感受态细胞,重组真核表达载体外源基因测序及PCR检测鉴定阳性克隆后转染人胚肾293细胞,荧光显微镜及western blot鉴定外源基因在细胞中的表达。 结果与结论：经PCR和测序证实外源性人热休克蛋白70基因正确重组入真核表达载体pDC315-EGFP,转染293细胞后荧光显微镜观察到绿色荧光蛋白GFP的表达,Western blot检测到热休克蛋白70在293细胞中有效表达。     

以海马神经元为靶细胞Ad-Easy系统快速构建携带PTEN基因的重组腺病毒表达载体

摘要：目的：应用Ad-Easy腺病毒载体系统快速构建携带PTEN (Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten)基因的重组腺病毒表达载体,为应用基因技术研究PTEN对缺血性脑损伤后的神经保护作用奠定基础。方法：采用RT-PCR法从大鼠海马神经元扩增获得目的基因PTEN, 克隆入pAdTrack-CMV穿梭质粒（含绿色荧光蛋白（Green fluorescence protein,GFP）基因）形成转移载体pAdTrack-CMV-PTEN,将其在大肠杆菌BJ5183内与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1同源重组;重组子酶切鉴定正确后转染HEK293细胞,PCR分析鉴定扩增情况及Western blot检测受腺病毒感染的海马神经元内PTEN蛋白的表达。结果：荧光显微镜检测到受腺病毒感染的HEK293细胞表达GFP,出现明显的细胞病变效应（Cytopathic effect,CPE）,经3轮扩增得到了病毒所需滴度。PTEN蛋白在受感染腺病毒神经元内表达显著增强。结论：利用Ad-Easy系统成功快速的构建了携带PTEN基因的腺病毒表达载体,为研究基因治疗缺血性脑损伤奠定了基础。     

大鼠Rars基因siRNA重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的 构建针对大鼠Rars基因的siRNA重组腺病毒载体,并观察大鼠神经元细胞病毒转染前后目的蛋白表达量变化。方法 将原代培养的大鼠神经元细胞随机分为观察组、阴性对照组及空白对照组。观察组细胞转染携带Rars siRNA序列的重组腺病毒,阴性对照组细胞转染携带Scramble无意义序列的重组腺病毒,空白对照组不转染任何病毒。观察各对照组表达绿色荧光蛋白（GFP）的阳性细胞数,计算转染率,并检测转染前后Rars基因对应产物精氨酰-tRNA合成酶（ArgRS）蛋白的表达量,评价基因沉默效率。结果 成功构建包含Rars基因干扰序列及Scramble序列的重组腺病毒,病毒滴度达1010级。利用重组腺病毒感染大鼠神经元细胞48 h后,绝大部分细胞表达GFP,转染率>95%。含Rars干扰序列的病毒转染细胞可使ArgRS蛋白表达量显著降低（P<0.01）,沉默效率>60%。含Scramble对照序列的病毒则不能产生明显的基因沉默效应。结论 本实验所构建的siRNA重组腺病毒载体可有效沉默大鼠Rars基因,降低ArgRS蛋白表达。     

应用AdEasy腺病毒载体系统构建鼠白细胞介素10基因重组腺病毒★

目的：AdEasy系统可在原核细胞E.coli BJ5183中完成穿梭质粒与骨架质粒之间的高效同源重组，经抗生素培养板筛选重组体，然后转染293细胞获得重组病毒，极大简化了载体的构建过程。实验利用AdEasy腺病毒载体系统构建鼠白细胞介素10基因重组腺病毒。 方法：实验于2006-08/2007-05在青岛大学医学院病毒学实验室完成。①实验材料：清洁级SD大鼠5只，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV，骨架质粒pAdeasy-1，大肠杆菌BJ5183和DH10B，人胚肾293细胞均由青岛大学医学院微生物教研室罗兵教授惠赠。②实验方法：从脂多糖刺激培养的大鼠脾细胞中提取细胞总RNA，应用反转录多聚酶链反应技术扩增白细胞介素10 cDNA，定向亚克隆至pAdtrack-CMV中构建腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV-IL-10，酶切线性化后转化到含腺病毒骨架质粒pAdEasy的BJ5183大肠杆菌中，获得重组腺病毒质粒pAd-IL-10，Lipofectamin包装转染293细胞，获得重组腺病毒vAd-IL-10，荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达。将293细胞接种于96孔板中，每孔1×104个细胞，浓缩后的病毒贮存液按不同比例稀释加至培养板中，测定重组腺病毒滴度。用重组腺病毒vAd-IL-10感染293细胞3 d后，以TRIzol一步法提取细胞总RNA，所获RNA加入DNaseⅠ消化处理可能污染的DNA后，PCR产物行琼脂糖电泳检测白细胞介素10 mRNA的表达。 结果：①重组腺病毒的包装及滴度测定：经限制性内切酶转染293细胞16 h后，荧光显微镜观察到细胞中有GFP荧光，可间接反映目的基因的表达。将病毒上清反复感染293细胞扩增重组腺病毒，通常传至第4~5代于接种病毒后24~48 h，几乎可观察到所有细胞出现荧光，此时收获病毒，重组病毒命名为vAd-IL-10。vAd-IL-10滴度为5.5×108 pfu/mL，vAd-GFP滴度为9.0×108 pfu/mL。②目的基因RT-PCR产物的鉴定：提取重组腺病毒感染293细胞总RNA，RT-PCR扩增后琼脂糖电泳显示特异性580 bp预计大小的片段，表明该重组腺病毒可在293细胞中有效转录。 结论：利用AdEasy腺病毒载体系统成功构建了携带白细胞介素10基因的重组腺病毒载体，并制备出高滴度的重组腺病毒vAd-IL-10，可在293细胞中有效转录。     

构建人HCN4基因重组腺病毒载体及其对大鼠骨髓间充质干细胞的感染效率

背景：超极化激活及环化核苷酸门控阳离子通道(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation channel, HCN)基因由于具有不增加诱发心律失常的风险、能够接受自主神经系统调节等优势,成为目前最受关注的生物起搏备选基因。 目的：构建携带人HCN4基因的重组腺病毒载体,并测定其对大鼠骨髓间充质干细胞的感染效率。 设计、时间及地点：细胞-基因学体外实验,于2008-02/09在中山大学附属第二医院林百欣实验中心完成。 材料：SD大鼠10只,由中山大学实验动物中心提供。携带目的基因人HCN4 cDNA的质粒pcDNA3.1-HCN4、人胚肾293细胞、大肠杆菌DH5α由中山大学附属第二医院林百欣实验中心保存。腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV、骨架质粒pAdxsi购自北京诺赛基因组研究中心有限公司。 方法：质粒pcDNA3.1-HCN4用Hind Ⅲ+Xba Ⅰ双酶切后回收HCN4片段,亚克隆至pShuttle-CMV中,得到重组穿梭质粒;I-Ceu Ⅰ+I-Sce Ⅰ双酶切处理pShuttle-CMV-HCN4,回收CMV-HCN4片段,亚克隆至腺病毒骨架载体pAdxsi,得到重组腺病毒质粒;重组腺病毒质粒酶切线性化后,应用脂质体法转染293细胞进行包装扩增,得到重组腺病毒AdHCN4;应用AdHCN4转染大鼠骨髓间充质干细胞。 主要观察指标：重组腺病毒质粒载体的鉴定,重组腺病毒的鉴定及滴度测定,重组腺病毒的感染效率。 结果：构建的重组穿梭质粒pShuttle-CMV-HCN4用Hind Ⅲ+Xho Ⅰ双酶切,得到大小为3 600 bp(HCN4)和5 100 bp (pShuttle-CMV)两个片段,DNA测序结果证实人HCN4基因的全长序列已正确插入到pShuttle-CMV穿梭质粒中;重组腺病毒质粒pAdxsi-CMV-HCN4用XhoⅠ酶切得到7个片段,而作为对照的空腺病毒质粒只得到6个片段;重组腺病毒质粒在293细胞中包装后产生的重组腺病毒对293细胞有致病作用;重组腺病毒AdHCN4 PCR鉴定可见657 bp的阳性扩增条带;经多次重复感染后,病毒滴度检测达2.5×1011PFU/mL。成功转染AdHCN4的大鼠骨髓间充质干细胞可表达绿色荧光蛋白,当病毒感染复数值为800,转染效率最高,达90%。 结论：实验成功构建携带人HCN4基因的重组腺病毒载体,并可在体外有效转染大鼠骨髓间充质干细胞。     

骨髓间充质干细胞中突变型人低氧诱导因子1α真核表达载体的表达

背景：转基因小鼠体内实验证实,重组的低氧诱导因子1α可以促进皮肤形态功能正常的血管新生。 目的：构建能够在常氧条件下同时表达突变型低氧诱导因子1α目的蛋白和绿色荧光蛋白报告分子的新型腺病毒真核表达载体,并转染SD大鼠骨髓间充质干细胞,检测该基因在细胞中的表达情况。 方法：利用Lipofectamine 2000介导将构建成功的重组腺病毒真核表达载体pAd-HIF1αmu- IRES-hrGFP-1转染HEK293A细胞,包装病毒,以最佳感染指数=50将重组腺病毒转染大鼠骨髓间充质干细胞,并设3个对照组,即阳性对照组：转染Ad-CMV-HIF1α-IRES-hrGFP-1;阴性对照组：转染Ad-CMV-IRES-hrGFP-1组;空白组：未转染病毒。 结果与结论：①腺病毒载体成功转染HEK293A细胞,包装成功,细胞内有大量绿色荧光表达。②转染突变型低氧诱导因子1α腺病毒表达载体的细胞在常氧条件下蛋白表达量明显高于转其他3组,3个对照组间差异无显著性意义(P > 0.05)。提示突变型腺病毒真核表达载体Ad-HIF1α-IRES-hrGFP-1在HEK293A内成功包装;突变后低氧诱导因子1α基因能够在常氧条件下大量且高效表达。     

人血管生成素1和血管内皮生长因子165重组腺病毒载体构建及目的基因表达*★

目的：拟构建人血管生成素1和血管内皮生长因子165腺病毒载体，观察靶细胞转染后目的基因的表达水平。 方法：通过RT-PCR方法克隆人Ang-1全长编码基因，PCR法以pcDNA3.0-VEGF165质粒为模板扩增VEGF165基因，分别将目的基因酶切连接到带有GFP标记的pTrack-CMV质粒上，构建重组质粒pTrack-CMV-Ang-1和 pTrack-CMV-VEGF165，经PCR、酶切和测序鉴定后将其PmeI线性化与腺病毒质粒pAdeasy-1共转化BJ5183细菌，获得重组腺病毒载体pAdeasy-1-pTrack-CMV-Ang-1/VEGF165，经PacI线性化后转染QBI-293A包装细胞，收获重组腺病毒Ad-Ang-1及Ad-VEGF165。 结果：PCR﹑双酶切和测序鉴定结果证实成功构建pTrack-CMV-Ang-1/VEGF165重组转移质粒，PmeI线性化后重组腺病毒载体获得成功包装。脂质体转染QBI-293A细胞后光镜下可见由腺病毒引起的细胞圆缩、聚集呈菌落状的典型细胞病理性改变；荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白的表达，且荧光强度随培养时间延长而逐渐增强；经多轮感染、扩增后，病毒效价可达（2.0~5.0）×1010 pfu/mL。转染48 h后，293A细胞中的血管生成素1与血管内皮生长因子含量均明显提高（F=427.93，17.93，P < 0.05）。 结论：成功构建并获得了Ad-Ang-1及Ad-VEGF165重组腺病毒，血管生成素1与血管内皮生长因子165均能在靶细胞中有效表达。     

Vasculostatin慢病毒表达载体的构建

目的构建Vasculostatin慢病毒表达载体。方法通过基因合成方法获得Vasculostatin的完整序列,将此片段定向克隆到pL enti-CMV-EF1p-eG FP载体多克隆位点区,筛选重组质粒,采用磷酸钙方法将Lenti-CMV-Vasculostatin/EF1p-eG FP与载体pC MV-VSGS与pC MV-Gag-Pol共转染293T细胞,转染后收获上清离心纯化病毒并检测病毒滴度。结果成功构建Vasculostatin的慢病毒表达载体,检测病毒的滴度为2.5×107/ml。结论 Vasculostatin慢病毒表达载体为研究Vasculostatin对血管生成的抑制作用提供工具。     

携带低氧诱导因子1αmu和人源化海肾绿色荧光蛋白双基因真核表达载体 构建及其在HEK293A细胞中的表达*

背景：低氧诱导因子1能够调控多种基因共同表达,在骨缺损部位可诱导成熟的血管生成,为各种细胞的成骨分化和成骨活动提供营养支持和代谢保证,促进骨愈合,但其真核表达载体的构建及表达却少见报道。 目的：实验拟构建携带低氧诱导因子1αmu(hypoxia inducible factor 1 alpha,HIF-1α)目的蛋白和人源化海肾绿色荧光蛋白(human renilla reniformis green fluorescent protein,hrGFP)的双基因真核表达载体,并将其转染HEK293A细胞,观测其在细胞中的表达。 方法：利用PCR技术定点突变目的基因供体质粒pCMV6-XL5-HIF1α携带的人HIF1α基因编码区的第402位、564位和803位氨基酸以及去掉其终止密码子,之后在基因序列前后添加新的酶切位点Not Ⅰ和Pvu Ⅰ,酶切、测序检测突变情况,将正确突变的HIF1αmu定向连入腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV-IRES-hrGFP-1中。经测序鉴定、Pme Ⅰ酶切线性化后转化BJ5183-AD-1电感受态细胞,通过hrGFP基因荧光表达检测转染情况。 结果与结论：经基因测序证实,HIF-1α基因编码区的第402位、564位和803位氨基酸均定点突变成丙氨酸,终止密码子成功去除。经酶切鉴定及测序证实,重组腺病毒表达载体构建成功。荧光显微镜下观察表明,感染重组腺病毒的HEK293A细胞内有大量绿色荧光表达证实通过Lipofectamine 2000途径可使得重组腺病毒载体成功转染HEK293A细胞。 关键词：低氧诱导因子1α;基因突变;腺病毒载体;绿色荧光蛋白;HEK293A细胞 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.46.011     

一种重组腺病毒载体的扩增、纯化和病毒滴度检测方法

目的建立扩增、纯化和生物活性鉴定重组腺病毒AxCA-BDNF的有效方法,为进一步研究应用腺病毒介导的BDNF进行神经系统疾病的基因治疗奠定基础。方法应用人胚肾293细胞作为包装细胞,扩增携带BDNF cDNA表达片段的重组腺病毒载体AxCA-BDNF;利用改良的CsCl超速离心法对其进行纯化;应用病毒空斑试验,对纯化病毒液进行病毒生物活性测定。结果获得了50 μl纯化病毒液;病毒滴度达2.2×108~1.8×1010 pfu/ml。结论通过培养扩增293细胞,可成功扩增重组腺病毒AxCA-BDNF;纯化病毒液量可完全满足体内基因转染实验的需要;病毒空斑实验证明其具有高强度的生物活性。     

携带人内皮抑素基因的重组腺病毒构建及表达*☆

目的：内皮抑素是目前发现的作用最强的内皮细胞抑制因子，但内皮抑素蛋白极不稳定，难以制备及应用，故需要借助基因治疗发挥其抑制血管生成的作用。实验利用AdEasy-1系统构建并鉴定人内皮抑素重组腺病毒，并在人血脐静脉内皮细胞中表达出内皮抑素蛋白。 方法：实验于2006-03/10在中山大学生命科学院完成。以Pshuttle-Endostatin质粒为模板，应用特异引物，通过聚合酶链反应扩增纯化得到Endostatin基因片断，经测序鉴定后，酶切插入穿梭质粒pAdTrack-CMV中，再与骨架质粒AdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组，重组质粒经筛选、提取、纯化后，经酶切及测序鉴定正确，再大量扩增为腺病毒载体，线性化后利用脂质体2000转染AAV293细胞包装并扩增，得到的病毒液纯化扩增后，感染人脐静脉内皮细胞，反转录-聚合酶链反应检测感染细胞中目的基因的表达，蛋白免疫印迹检测感染细胞中蛋白的表达。 结果：获得的Endostatin基因片段经酶切及测序鉴定正确，重组腺病毒质粒经酶切及测序鉴定正确，成功转染AAV293细胞，包装并扩增出病毒液，纯化后测滴度为2.06×1010 pfu/mL，进一步感染人脐静脉内皮细胞，在其中检测到目的基因及蛋白表达。 结论：人内皮抑素重组腺病毒pAd-Endo构建成功，且可在人脐静脉内皮细胞中表达出相应的目的基因及蛋白。     

腺病毒表达载体pAdEasy-1/pAdTrack-CMV-Shh-N的构建及表达

目的构建携带Son ic hedgehog氨基端(Shh-N)基因的腺病毒表达系统并在包装细胞中制备相关病毒颗粒,以用于中枢神经系统疾病的基因治疗。方法应用多聚酶链式反应(PCR)技术扩增Shh-N,然后克隆至含巨细胞病毒(CMV)启动子的真核表达载体pAdTrack-CMV,在细菌中与缺陷型腺病毒基因组pAdEasy-1进行重组,构建pAdEasy-1/pAdTrack-CMV-Shh-N,然后转染包装细胞293细胞系。结果成功获得Shh-N片段并构建了缺陷型腺病毒表达载体pAdEasy-1/pAdTrack-CMV-Shh-N,经限制性酶切后证实该表达载体含Shh-N基因,在293细胞中小规模扩增病毒后,经PCR检测证实病毒颗粒中存在Shh-N基因。结论获得了携带Shh-N的腺病毒颗粒,可将之用于基因修饰神经细胞,进行促细胞存活和定向分化诱导研究,为自身干细胞和外源性细胞移植治疗中枢神经系统疾病的临床应用提供理论和实验基础。     

双顺反子真核表达载体pIRES2-EGFP-hBMP-2的构建及鉴定

背景：骨形态发生蛋白等因子及以其为中心构建的支架或载体已经广泛应用于实验研究中，并逐渐应用于临床，然而，治疗效果的示踪方法为实验提出了挑战。增强型绿色荧光蛋白基因的发现和应用解决了这一难题。 目的：构建双顺反子真核表达载体PIRES2-增强型绿色荧光蛋白-人骨形态发生蛋白2，检测其表达情况。 方法：利用RT-PCR方法从人骨肉瘤组织中提取人骨形态发生蛋白2基因，使之与PMD18-T载体连接，经酶切回收后，与目的载体pIRES2-增强型绿色荧光蛋白连接。用PCR技术及基因测序鉴定构建结果。然后将构建好的载体转染人胚肾293细胞，通过荧光显微镜及Western blot技术观测其表达。 结果与结论：实验成功扩增了人骨形态发生蛋白2基因并构建了pIRES2-增强型绿色荧光蛋白-人骨形态发生蛋白2载体，将pIRES2-EGFP-hBMP-2用脂质体转染入人胚肾293细胞后48 h，荧光显微镜观察约30%细胞发出绿色荧光，Western blot结果发现在Mr46×106处有一特异性骨形态发生蛋白条带，表明所构建载体中靶基因能成功表达。     

表达大鼠脑源性神经营养因子(BDNF)腺相关病毒的构建及体外表达分析

目的构建携带大鼠脑源性神经营养因子(BDNF)基因的重组腺相关病毒(AAV)载体,并检测体外表达目的基因的能力。方法应用基因克隆技术将大鼠BDNF的cDNA基因序列克隆入腺病毒质粒pAAV-MCS,PCR酶切测序鉴定序列。与AAV病毒包装质粒pAAV-RC、pHelper用磷酸钙法共转染HEK293细胞,包装得到含转基因过表达BDNF的病毒载体(rAAV-BDNF)。重组病毒感染体外培养的Hela细胞后,用RT-PCR和Western Blot方法检测细胞BDNF基因及蛋白表达情况,用ELISA法测定培养液中表达产物浓度。结果证实BDNFcDNA片段插入到病毒基因组内,并整合到宿主基因组后稳定表达,病毒滴度可以达到1.29×108PFU/mL。重组病毒感染Hela细胞后能高水平表达BDNF,ELISA结果表明,Hela细胞从病毒感染后第2天到第10天表达BDNF水平呈上升趋势,第10天达到2253pg/mL。结论成功地构建了表达BDNF基因的腺相关病毒载体,并可在体外高水平表达其所携带的目的基因,为将其进一步应用于神经系统损伤性疾病治疗的研究奠定了方法学基础。     

甲胎蛋白特异性小干扰RNA重组腺病毒载体的构建

背景：RNA干扰技术的应用，关键在于能够采用1个有效的基因转移系统将小干扰RNA转入至靶细胞，目前广泛应用的是构建小干扰RNA表达载体。 目的：利用AdMax腺病毒载体系统构建表达人甲胎蛋白-小干扰RNA的腺病毒载体。 设计、时间及地点：开放性实验，于2007-03/10在山东大学附属济南市中心医院中心实验室完成。 材料：穿梭质粒pDC316-EGFP-U6为本元正阳基因技术公司产品；AdMax KitD试剂盒与低代数HEK293细胞为Microbix Biosystems Inc.（Canada）公司产品。 方法：选择针对甲胎蛋白 mRNA的特异性小干扰RNA靶序列，设计合成为相应的双链DNA，并将其与酶切线性化的pDC316-EGFP-U6载体片段连接，构建好的穿梭质粒pDC316-EGFP-U6-AFP-siRNA和腺病毒骨架质粒pBHGlox_E1,3Cre共转染HEK293细胞，同源重组产生重组腺病毒。 主要观察指标：对重组腺病毒进行聚合酶链反应鉴定及扩增、纯化、滴度测定。 结果：构建的穿梭质粒载体经聚合酶链反应鉴定和测序分析，证实与设计一致。重组腺病毒Ad-AFP-siRNA经聚合酶链反应和绿色荧光蛋白表达检测证实构建成功，测定滴度为1.4×109 nfu/L。 结论：实验成功构建了Ad-EGFP-U6-AFP-siRNA重组腺病毒。     

DMT1第四功能区腺病毒表达载体的构建及其功能的初步研究

目的:构建携带DMT1第四功能区基因的重组腺病毒表达载体,并对其功能进行初步探讨。方法:采用AdEasy系统构建携带DMT1第四功能区基因的重组腺病毒载体pAd-DMT1-4,脂质体法转染人胚肾293细胞,包装产生重组腺病毒vAd-DMT1-4。vAd-DMT1-4感染C6胶质瘤细胞后,采用RT-PCR检测目的基因表达,用铁孵育感染重组腺病毒的靶细胞后,测定C6胶质瘤细胞内OH.和MDA含量。结果:PCR、序列测定以及限制性酶切证实vAd-DMT1-4基因正确插入穿梭质粒,并与病毒骨架质粒pAdEasy-1重组,重组腺病毒表达载体构建成功。经293细胞包装获得具有稳定感染性的重组腺病毒vAd-DMT1-4,感染重组腺病毒的C6胶质瘤细胞DMT1-4表达增加。用铁孵育感染重组腺病毒的靶细胞后,C6胶质瘤细胞内OH.和MDA含量有增高的趋势。结论:重组腺病毒vAd-DMT1-4可有效感染C6胶质瘤细胞。     

起搏通道HCN2基因和增强型绿色荧光蛋白双基因载体在人胚胎肾细胞的共转染表达*★

背景：获得高效、安全的基因转移载体是目前研究的目标。 目的：构建携带起搏通道(HCN2)基因和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）双基因真核表达载体，并观察在人胚胎肾细胞（HEK293）表达情况。 设计、时间及地点：单一样本观察，实验于2006-07/2007-08在全军重点实验室解放军总医院老年心血管病研究所完成。 材料：质粒pIRES-EGFP为Clontech公司产品，PCI-HCN2质粒，含有人全长HCN2基因为解放军总医院老年心血管病研究所惠赠。 方法：利用脑炎心肌炎病毒的内部核糖进入位点(IRES),构建HCN2与增强型绿色荧光蛋白基因真核表达载体pIRES-EGFP-HCN2。将脂质体和pIRES-EGFP-HCN2基因混合后转染人胚胎肾细胞,用反转录-聚合酶链反应检测HCN2 mRNA表达。 主要观察指标：①重组质粒pIRES2-EGFP-HCN2的构建。②起搏通道基因HCN2 cDNA的克隆。③增强型绿色荧光蛋白表达的荧光检测。 结果：构建的pIRES-EGFP-HCN2在转染8 h后开始表达，48 h达到最高。经酶切鉴定含有增强型绿色荧光蛋白和HCN2基因。 结论：实验成功地构建了pIRES-EGFP-HCN2真核共表达载体，具有HCN2、增强型绿色荧光蛋白的双重活性，IRES能够介导外源基因HCN2在人胚胎肾细胞表达。