基于核基因ITS及叶绿体psbA-trnH和trnS-trnG基因怀地黄栽培起源探讨

目的从野生型驯化为栽培品种角度分析地黄Rehmannia glutinosa的遗传多样性,探讨河南焦作地区怀地黄的栽培起源。方法对地黄野生自然居群,栽培品种及其近缘物种ITS、psb A-trn H和trn S-trn G序列进行扩增和测序,分析比较中药材地黄野生自然居群,栽培品种间各序列的单倍型类型和核苷酸多态性,构建Neighbor-Joining(NJ)分子系统发育树。结果单倍型分析结果显示,地黄野生居群单倍型类型数量(ITS 6个,psb A-trn H 8个,trn S-trn G 9个)明显高于怀地黄栽培品种单倍型类型数量(ITS 3个,psb A-trn H 2个,trn S-trn G 3个)。地黄野生居群的单倍型多样性和核苷酸多样性均远高于怀地黄栽培品种间,在3个基因联合系统树上,地黄野生居群和栽培品种所有样品与茄叶地黄聚在一支,支持率为90%;23个栽培品种(29个样本)与来自温县的10号地黄野生居群聚为一支,支持率为78%。结论地黄野生型驯化为栽培品种过程发生了明显的遗传瓶颈,导致现存怀地黄栽培品种遗传基础狭窄,遗传多样性降低。怀地黄栽培品种可能起源于河南温县区域的地黄野生群体。     

不同地理居群新塔花的ITS2和psbA-trnH序列及聚类分析

目的:分析18个不同地理居群新塔花的内转录间隔区(ITS)2和psbA-trnH序列,为其种质资源评价和基原药用植物遗传多样性分析提供参考。方法:试剂盒法提取新塔花基因组DNA,聚合酶链式反应(PCR)扩增ITS2和psbA-trnH间隔区序列,双向测序,拼接,基于Kimura两参数模型(K2P)构建邻接法(NJ)系统发育树。结果:不同地理居群新塔花ITS2和psbA-trnH序列均有种内差异。ITS2序列长度平均为236 bp,检测有9个单倍型,遗传距离为0～0. 022,不同地理居群新塔花聚为两支,XTH3,XTH6,XTH9等10个地理居群聚为一支,XTH4,XTH5,XTH10等8个地理居群聚为另一支。除XTH6的psbAtrnH序列存在6 bp缺失外,其他地理居群的psbA-trnH序列长度均为355 bp,检测有4个单倍型,遗传距离为0～0. 023,不同地理居群新塔花聚为两支,XTH1,XTH3,XTH4等12个地理居群聚为一支,XTH14,XTH17,XTH18聚为另一支。基于ITS2+psbA-trnH组合序列的系统发育(NJ)树显示,不同地理居群的新塔花可分为两支,XTH11,XTH12,XTH16等12个地理居群聚为一支,XTH14,XTH17,XTH18聚为另一支。结论:不同地理居群的新塔花地理位置接近或相似,相对遗传距离较小,亲缘关系较为接近,说明不同地理居群新塔花的亲缘关系及其遗传多样性与地理位置相关。     

基于居群DNA条形码的药用植物黄芩的产地鉴别研究

目的:利用居群DNA条形码阐明不同产地(居群)黄芩的遗传分化程度,对其进行产地鉴别。方法:应用进化速率快和母系遗传的叶绿体DNA基因间序列,基于分子谱系地理学理论筛选出居群间遗传分化明显的片段,构建单倍型网状进化树,根据单倍型在网状进化树中的位置、出现的频率和地理分布范围的大小,划分出不同层次的居群DNA条形码,以用于地理分布范围宽窄不同的产地鉴别。结果:本实验筛选出3个叶绿体DNA基因间序列atpB-rbcL,trnL-trnF和psbA-trnH对17个黄芩野生居群进行分子谱系地理学分析,得到13个多态位点,共20个单倍型,其中3个分布最广、频率最高的单倍型可用于较广地域的产地鉴别,称为区域居群DNA条形码;3个分布次之、只存在于2～3个邻近居群的单倍型可用于较窄地域的产地鉴别,称为地区居群DNA条形码;另有8个仅局限在某一个居群的单倍型可用于特定居群的鉴别,称为居群特有DNA条形码。结论:叶绿体基因间序列在居群间存在明显遗传分化,可用于地理分布范围宽窄不同的黄芩产地鉴别。     

黄草乌及其混淆品ITS序列的分析鉴别

目的:比较黄草乌及其混淆品滇南草乌ITS序列的差别。方法:分别提取黄草乌及滇南草乌总DNA,进行PCR扩增、扩增产物直接测序,利用DNAStar、ClustalX1.81及MEGA4.0软件进行序列分析。结果:通过对黄草乌及其混淆品的ITS数据矩阵,得到ITS1产生229个一致位点、19个变异位点和13个信息位点;5.8S产生162个一致位点、2个变异位点和1个信息位点;ITS2产生217个一致位点、3个变异位点和1个信息位点。除了5.8S没有碱基的转换和颠换,ITS1存在2个碱基转换和1个颠换,ITS2只存在1个颠换。黄草乌2个居群和滇南草乌3个居群的ITS测序结果经数据矩阵分析后,发现二者ITS2区间第596个碱基处为鉴定二者的稳定的信息位点,黄草乌2个居群的所有样品在此位点的碱基为(C),而滇南草乌3个居群的所有样品在此位点的碱基为(A)。结论:黄草乌与其混淆品滇南草乌的核rDNA的ITS序列存在碱基的差异,有特定的变异位点,且位点变异表现出ITS1大于ITS2,因此,能在分子水平上将二者分开。     

葛根种质资源的分子地理标识研究

目的:利用葛根的ITs,psbK-psbI,trnH-psbA序列信息对不同产地葛根进行分类,为分析不同产地的葛根药材提供依据.方法:采集东北、华北、华中和西北共8个居群24份葛根样品,提取DNA,扩增ITS序列、psbK-psbI及trnH-psbA序列、测序,通过序列比对,根据差异划分基因型或单倍型.结果:ITS1,ITS2序列各有1个单碱基突变,5.8S序列有1个单碱基突变;psbK-psbI序列有2个单碱基突变;trnH-psbA序列有1个单碱基突变,还有1段10个碱基的缺失突变.结论:利用ITS序列将葛根划分成4个基因型,根据psbK-psbI和trnH-psbA序列均将葛根划分成2个单倍型,为进一步评价提供依据.     

F型、H型居群的铁皮石斛rDNAITS区序列差异及SNP现象的研究

目的 :研究铁皮石斛主产区F型和H型居群rDNAITS碱基序列的差异。方法 :运用PCR直接测序法对广西、贵州、云南铁皮石斛主要居群的rDNAITS区 (包括ITS1,5 .8SrDNA ,ITS2 )碱基序列进行了序列测定。结果 :在铁皮石斛各居群中 ,F型居群与H型居群植株的rDNAITS区碱基序列有 2个位点差异 ,且变异分别发生在ITS1区及 5.8S区内。研究表明 :铁皮石斛居群内部rDNAITS区的差异与植物生活型的差异呈一定的相关性 ,H型居群的铁皮石斛是F型的变种。在F型与H型居群间 ,其 5.8SrDNA区存在单核苷酸多态 (SNP)现象。首次报道了铁皮石斛ITS区的碱基序列 ,ITS区总长度为 634bp ,其中ITS1为 231bp ,5.8S为 163bp ,ITS2为 240bp。结论 :rDNAITS区碱基序列的比较分析进一步证明铁皮石斛F型居群与H型居群间具有显著的差异性。     

羌活不同地理种群cpDNA trnT-trnL多态性分析

目的对245份不同产地羌活Notopterygium incisum样品的遗传多样性和遗传结构进行研究。方法采用叶绿体cpDNA trnT-trnL直接测序的方法和邻接法(NJ)对245份羌活样品进行遗传多样性和遗传结构分析。结果物种水平上单倍型多样性(Hd)指数为0.873,核苷酸多样性(Pi)指数为0.004 07;种群水平上Hd介于0~0.900,Pi指数介于0~0.054 4,与同属的宽叶羌活Notopterygium franchetii相比,遗传多样性水平居中;分子方差分析表明,羌活大部分遗传变异(77.55%)发生在居群间,居群间的基因流(Nm=0.145)较低,群体间变异是羌活的主要变异来源;NJ树表明,受试的31个野生种群可分为2大类群。结论羌活的遗传多样性处于中等水平,居群间遗传分化较大。     

基于cp DNA序列和ISSR分子标记的甘肃祁连山地区麻花秦艽变异与遗传分化分析

目的 采用叶绿体基因(cp DNA)序列和ISSR分子标记技术对甘肃祁连山地区麻花秦艽进行序列变异和遗传分化分析。方法 利用试剂盒提取法提取麻花秦艽的基因组DNA,利用筛选出的trnS-trnG和rpl20-rps12引物进行扩增并测序,通过软件Chromas、ContigExpress对得到的序列进行校正、拼接,利用MegaX、DanSP5、GenALEx软件对拼接后的序列进行序列特征分析,最后利用PopART软件得到麻花秦艽的单倍型网状进化图。结果 18个麻花秦艽居群共计114个个体被成功扩增和测序;2个cp DNA片段经拼接后的长度为1 246 bp,共有676个多态性变异位点,459个单一突变位点、217个简约信息位点和107个插入-缺失位点;单倍型41个,其中特有单倍型34个;Tajima′s D检验在P>0.05水平上不显著,整体遵循中性进化模型。居群内变异百分比为89%,说明遗传变异主要存在于居群内;Fst=0.114(P<0.05),Nm=3.889说明居群间分化程度较低,居群间具有较强的基因交流。遗传距离与地理距离相关性分析r=-0.094(P<0.05),说明遗传距离与地理距离不具有明显的相关性。结论 甘肃祁连山地区麻花秦艽在物种水平上遗传多样性较高,具有丰富的单倍型类型,居群的遗传变异主要来自于遗传漂变。     

基于叶绿体DNA trnL内含子序列变异的远志谱系地理学研究

目的研究我国自然地理分布范围内远志Polygala tenuifolia的分子谱系地理情况,揭示其地理分布格局的形成原因,推测该物种潜在的冰期避难所及冰期后的迁移扩散路线。方法使用叶绿体非编码片段(trn L内含子序列)对远志在我国自然地理分布区内的39个居群308个个体的遗传变异分布模式进行检测。结果共发现26个多态性位点,得到12种叶绿体单倍型。单倍型系统发育分析显示远志自然居群可划分为南、北2个地理组群:北方(包括中国东北、中部、西北地区)组群和南方组群,南北组群没有共享单倍型。居群遗传结构分析表明2个地理组群之间遗传分化较大(Gst=0.783,P<0.001),物种水平遗传多样性较高(Ht=0.755),北方组群不存在明显的谱系地理结构。结论第四纪冰期时远志在中国北方和南方地区存在多个避难所;冰期后或间冰期,北方地区发生了明显的居群扩张事件;南、北组群的分化可能是由于长期的地理隔离所致。     

不同居群草珊瑚的ITS序列分析及模式识别研究

目的 通过分析不同居群草珊瑚Sarcandra glabra和金粟兰属5种近缘植物的核糖体基因内部转录间隔区(rDNA-ITS)序列,为草珊瑚鉴定和品种鉴别提供模式识别与思路。方法 采集不同产地的草珊瑚18份、金粟兰6份,所有样品提取总DNA,并对其ITS片段进行扩增、测序,并搜索GenBank数据库中收录的其他4种金粟兰属植物的ITS序列,运用ClustalX 2.1软件比较不同产地草珊瑚与其他金粟兰属植物的ITS序列差异,并对其进行聚类分析。结果 草珊瑚样品不同居群间的ITS序列相似度达99%,其中位点总突变率ITS1(2.7%)>ITS2(1.4%),而与金粟兰属其他植物相比,位点总突变率ITS2(20.3%~22.7%)>ITS1(15.9%~18.3%)。聚类分析表明18个不同种群的草珊瑚居群间变异极小,且与金粟兰属5种近缘植物具有显著差异的聚类识别。结论 草珊瑚ITS1与ITS2分别为不同居群间及与不同属近缘植物间比较有效的鉴别序列,具有较多个特异性信息位点的草珊瑚ITS序列用于鉴别金粟兰属5种近缘植物,具显著差异的聚类识别,是草珊瑚和金粟兰属近缘植物鉴定和品种鉴别的有效分子标记。     

基于ITS2 DNA序列的雷公藤属药材资源谱系地理学研究

目的 采用ITS2 DNA条形码技术,研究雷公藤属3种药用植物的遗传特性,揭示其地理分布格局的形成原因。方法 收集雷公藤属植物28个居群223份样本,提取基因组DNA,扩增ITS2基因序列并测序,并进行遗传多样性分析,绘制失配分布曲线检测群居历史动态变化情况,估算雷公藤属种间、种内群体间和群体内的差异及遗传分化系数。结果 雷公藤属28个居群223份样本共检测到12个碱基突变位点,构成10个单倍型。昆明山海棠Tripterygium hypoglaucum共有7个单倍型,H2～H7为特有单倍型;雷公藤Tripterygium wilfordii共有4个单倍型,H8为特有单倍型;东北雷公藤Tripterygium regelii共有3个单倍型,无特有单倍型;H1为3个物种间的共有单倍型,H9和H10为雷公藤和东北雷公藤共有单倍型。群体遗传多样性分析显示,雷公藤属具有较高的单倍型多态性（H_d＝0.615±0.024）和核苷酸多态性[P_i＝（9.47±0.58）×10⁻³]。群体遗传结构分析显示,雷公藤属的变异主要存在于物种之间（76.14%）,种内群体间和群体内的变异分别为11.42%、12.44%。群体动态历史分析表明,雷公藤属、雷公藤和东北雷公藤曾经历过扩张,而昆明山海棠未经历过扩张。结论 雷公藤属及其属下的昆明山海棠和雷公藤的遗传多样性水平较高,而东北雷公藤遗传多样性水平较低。雷公藤属植物在第4纪冰期时,将中国西南、华中和华东的部分地区作为冰期避难所,冰期后以冰期避难所为中心向四周扩散,形成当前雷公藤属植物的分布格局。     

基于ITS序列的中国药用石斛及其混伪品的分子鉴定

目的:通过测定17种药用石斛的rDNA ITS全序列,构建分子系统树,在分子水平对待检种进行鉴别,为石斛的分子鉴定提供依据.方法:采用改良的CTAB法提取石斛叶片DNA,PCR扩增rDNA ITS区全序列,产物回收纯化后直接测序,运用Bioedit,MEGA 4.0等软件分析石斛属植物的rDNA ITS序列的特征.结果:建立了17种药用石斛rDNA ITS区碱基全序列数据库,其中,ITSl的长度为228～234 bp,GC量为45.7%～53.0%,变异位点167个,占总位点67.34%,信息位点106个,占总位点42.74%;ITS2长度为241～247 bp,GC量为44.8%～55.7%,变异位点165个,占总位点66.27%,信息位点115个,占总位点46.18%.属间的遗传距离为0.295,石斛种间的平均遗传距离为0.142,种内各居群间的平均遗传距离为0.002.结论:利用17种石斛的全序列数据库及遗传分析软件,通过对待检种rDNA ITS区进行序列测定,可以在分子水平对石斛不同种质进行鉴别,为石斛的分子鉴定提供依据.     

籽用栝楼遗传多样性研究

目的分析不同来源籽用栝楼资源的遗传多样性。方法应用SRAP分子标记技术并结合ITS序列分析对11份籽用栝楼资源30个样本进行遗传特征研究,并分别应用mega 5.0和NTSYS-pc 2.1软件对ITS序列及SRAP扩增条带进行聚类分析。结果栝楼与双边栝楼ITS序列存在稳定的碱基差异;15对SRAP分子标记引物扩增得到清晰条带165条,其中多态条带136条,多态率为82.4%,聚类结果显示在相似度为0.18时栝楼与双边栝楼资源分为2大类群,双边栝楼来源的主栽品种遗传相似度较大,在相似度为0.90时分为3个分支。结论籽用瓜蒌来源品种多样,主要来源于双边栝楼,且各地栽培资源遗传差异较小。     

甘松属资源遗传多样性及其ITS二级结构系统发育信息分析

目的 基于ITS1和ITS2序列,对来自四川、青海、甘肃和西藏不同地区的甘松属植物甘松Nardostachys chinensis、匙叶甘松N. jatamansi遗传多样性进行研究及分子鉴定。方法 通过PCR扩增获得甘松ITS1、ITS2序列,采用MEGA软件进行多重序列比对,用DNA EditSeq软件进行剪切、拼接和统计等分析,运用Kimura two-parameter(K2-P)模型进行遗传距离分析,运用DNASTAR软件进行同源性和差异性分析,利用邻接法（neighbor joining,NJ）构建系统发育树,采用DNAsp V5软件进行遗传多样性分析。结果 ITS1序列长度范围为687～689 bp,仅2 bp差异;ITS2序列长度高度保守,均为468 bp。ITS1与ITS2序列G/C含量均达66.00%以上。系统发育分析发现,ITS序列可将甘松属20个样本分为2支,甘松与匙叶甘松各自为一支,但二者亲缘关系很近。遗传多样性分析发现,匙叶甘松综合遗传多样性水平指标大于甘松。结论 据形态学及遗传学分析,甘松属应分为甘松与匙叶甘松2种,且遗传多样性较低,种内遗传变异相对稳定。...     

基于ITS2序列的翻白草与委陵菜分子鉴定

目的 应用DNA条形码技术对翻白草及易混品委陵菜进行分子鉴定,保障药材质量和临床用药安全。方法 提取翻白草及委陵菜的基因组DNA,扩增内转录间隔区2（ITS2）序列并双向测序,所得序列用SeqMan软件校对、拼接;在线双序列比对翻白草对照药材（F_R）及委陵菜对照药材（W_R）的ITS2序列,并预测其二级结构;从GenBank下载部分相关序列,运用MEGA X软件进行多序列比对,分析序列变异位点,计算种内、种间遗传距离,采用邻接法（NJ）构建系统进化树。结果 所有样品均成功扩增出ITS2序列,翻白草和委陵菜的ITS2序列长度均为210 bp。双序列比对结果表明,F_R与W_R的ITS2序列相似性为92.9%,二级结构存在明显差异。多序列分析结果表明,翻白草ITS2序列平均鸟嘌呤（G）+胞嘧啶（C）占比为63.0%,存在2个变异位点,种内遗传距离为0~0.009 6;委陵菜ITS2序列平均G+C占比为64.4%,存在5个变异位点,种内遗传距离为0~0.019 3;种间遗传距离为0.054 8~0.075 8。NJ树结果显示,翻白草、委陵菜聚为不同分支,可明显区分。结论 利用ITS2序列可以准确鉴别翻白草与委陵菜,为保障其安全用药提供了新的技术手段。     

基于ITS2序列的清风藤属药用植物分类鉴定研究＊

目的 探讨核基因内部转录间隔区2（internal transcribed spacer 2，ITS2）序列在清风藤属（Sabia）药用植物中的分类鉴定可行性与系统关系。方法 对9种38个产地的清风藤属药用植物ITS2序列进行PCR扩增和测序。基于（Kimura 2-parameter）K2P计算遗传距离，分析种内和种间变异与鉴定效率，应用最大似然法（maximum likelihood，ML）构建系统发育树。结果 清风藤属药用植物ITS2序列长度均为241 bp，GC含量为51.9-64.7%。38个产地清风藤属药用植物ITS2序列，共具有保守位点168个，变异位点数目为73个，简约信息位点数目为65个。ITS2在清风藤属药用植物中的种内变异为0-0.074，种间变异为0.007-0.205，种间变异较小，种间遗传距离与种内遗传距离存在交叉，没有形成明显的间隔。ML系统树表明，属内种间具有较高的自展支持率，基本能单独聚成一支，可对清风藤属药用植物种间进行有效分类鉴定。结论 ITS2序列在清风藤属植物中具有较好的通用性与鉴定效率，可用于清风藤属DNA条形码与分类鉴定研究。本研究为清风藤属植物的分类鉴定与系统演化研究提供了一定参考。     

云贵地区金铁锁EST-SSR遗传多样性分析

目的分析云贵地区金铁锁Psammosilene tunicoides遗传多样性和变异情况。方法采用转录组测序技术开发金铁锁的EST-SSR引物,并利用筛选出的分子标记对金铁锁进行多态性分析。结果共获得了17 530条含SSR位点的EST序列;筛选出了14对具有较高多态性的EST-SSR引物,对云贵地区的17份金铁锁进行多样性分析,发现其在位点水平上多态性信息含量(PIC)范围为0.350 0~0.795 0,具有较高的多态性;在群体水平上明显偏低,多态位点百分率(PPB)为64.29%~100%,Nei’s基因多样性指数的范围为0.188 2~0.477 7,平均0.323 2;云贵地区金铁锁群体内基因流(Nm)较小(Nm均值为0.302 0),群体间存在较大的遗传分化(Fst均值为0.452 9)。结论转录组测序丰富了金铁锁EST数据库;云贵地区金铁锁的遗传多样性可能与其繁殖方式、分布区较长的进化历史有关,群体间遗传分化大可能是地理阻隔截断了不同群体间的基因交流。     

山药种质资源核糖体rDNA-ITS区序列分析

目的 分析14种山药DioscoreaeRhizoma种质ITS序列,为山药种质资源分子鉴别和进化关系研究提供依据。方法 PCR克隆扩增ITS序列并进行双向测序,Clustal X（v1.83）软件进行序列比对,Mega(V4.1)计算序列核苷酸比例及遗传距离,并构建邻接树（Neighbor-joining,NJ）和最大简约树（Maximum parsimony,MP）。结果 14种山药种质ITS序列全长为558～594 bp,其中ITS1长度为141～165 bp,ITS2长度为146～158 bp;ITS序列存在大量的转换、颠换,转化/颠换比率为5.347,ITS1和ITS2序列均显示102个变异位点;14种山药种质K2-P遗传距离为0～0.517 2;薯蓣Dioscoreaopposita、褐苞薯蓣Dioscoreapersimilis、日本薯蓣Dioscorejaponica关系亲密,组成单一支系;参薯Dioscoreaalata与山薯Dioscoreafordii关系亲密,聚为另一分支,并位于发育树基部。结论 ITS序列系统树为澄清山药类资源进化关系奠定了基础,序列中丰富的变异位点为多基原山药鉴别提供了科学依据。     

基于ISSR的甘肃中麻黄遗传多样性研究

目的研究甘肃不同居群中麻黄Ephedra intermedia的遗传多样性。方法应用ISSR分子标记技术对甘肃省11个居群的中麻黄样本进行分析,利用POPGENE 32软件分析Nei’s基因多样性指数(H)等遗传信息参数,应用NTSYS软件构建亲缘关系UPGMA聚类图。结果 12条引物共检测到175个位点,其中多态性位点150个,多态位点百分率(PPL)为85.71%。中麻黄居群间的H为0.211 4,Shannon’s多样性信息指数(I)为0.332 1,种群间基因分化系数(Gst)为0.259 3,基因流(Nm)为1.428 6,遗传距离0.014 4~0.159 8。结论甘肃中麻黄种群遗传多样性水平较高,但居群内遗传多样性水平低于居群间;中麻黄种群的遗传变异主要存在于居群内;亲缘关系与地理分布具有一定的相关性。