LAMP快速检测日本血吸虫感染性钉螺的研究

目的：建立一种快速检测日本血吸虫感染性钉螺的方法。方法采用环介导等温扩增技术（LAMP ）以日本血吸虫的特异基因为靶序列,利用Primer Explorer V3软件设计扩增靶基因的4条LAMP引物,酚氯仿法提取感染性钉螺中的日本血吸虫DNA ,取适量模板DNA加入LAMP反应体系进行对日本血吸虫靶基因扩增,经肉眼观察、SYBR Green I染色电泳及测DNA序列来判定扩增产物。在99个阴性钉螺中各加入1个阳性钉螺,其中每个阳性钉螺分别感染日本血吸虫毛蚴数量分别为10、8、6、4、2、1条。结果感染性钉螺检测管经显色呈绿色为阳性,阴性钉螺呈棕色;日本血吸虫的特异基因经LAMP扩增后电泳呈现LAMP特征性梯状条带,阴性钉螺及感染肝吸虫不出现LAMP特征性梯状条带;扩增产物经酶切及序列分析显示为目的基因;在100个钉螺中只要有2条日本血吸虫毛蚴感染便可检出。结论环介导等温扩增技术（LAMP）可快速有效检测日本血吸虫感染性钉螺,有望为疫区日本血吸虫感染性钉螺高效快速检测提供一种新方法。     

以dotA基因为靶标的LAMP法快速检测嗜肺军团菌

目的建立一种简便、高效、特异、灵敏的快速检测军团菌肺炎致病原-嗜肺军团菌的方法。方法本研究分析了NCBI数据库中嗜肺军团菌IVB型分泌系统的序列,经过筛选建立了以dotA基因为靶标的环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测法。为了验证该法的特异性,提取了约旦军团菌、马氏军团菌、沙门菌、不同血清型的嗜肺军团菌基因组DNA进行检测;为了验证该法的灵敏度,对梯度浓度的阳性模板进行了检测,并与普通PCR对比;最后还将该法实际应用于环境水样的检测。结果本法可于30 min内完成扩增;扩增产物电泳呈现LAMP特有的梯形条带,酶切产物的片段大小符合理论值;阳性产物中可见白色沉淀,加入溴乙锭后在紫外光下可见明亮的荧光,阴性产物无此现象。结论该dotA-LAMP嗜肺军团菌检测法的特异性好,灵敏度高于普通PCR,可在简易的实验环境中快速、特异、灵敏、直观地检测出嗜肺军团菌,具备现场检测及基层推广的应用潜力。     

环介导等温扩增法检测孕妇血清中单纯疱疹病毒Ⅰ型方法的建立

目的建立稳定、可靠的环介导等温扩增法（LAMP）快速检测孕妇血清中单纯疱疹病毒Ⅰ（HSV-Ⅰ）DNA的方法。方法通过对影响LAMP反应体系的几个主要因素进行优化,确定最佳反应条件,并对其特异性、灵敏度及可靠性进行评判。结果 LAMP检测HSV-Ⅰ DNA的最佳反应条件：甜菜碱和Mg2＋的终浓度分别为1.0mol/L和10mmol/L,于62℃恒温反应1h。扩增产物可被Hinf Ⅰ消化,理论上检测下限可达10个拷贝,与定量PCR相比符合率达94.5%。结论本实验建立的LAMP检测HSV-I的方法具有灵敏度高、特异性强、操作简便等特点,适合基层用于HSV-Ⅰ筛查。     

环介导等温扩增法鉴定检测冬虫夏草

目的 建立冬虫夏草的环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）方法,实现对冬虫夏草的快速检测。方法 针对冬虫夏草的CS2 serine protease (csp2)基因设计LAMP内外引物对;利用CTAB法提取冬虫夏草DNA;优化扩增反应条件;采用包括冬虫夏草在内的6种不同虫草进行LAMP扩增,并对阳性产物酶切鉴定以检测其特异性,通过对模板DNA的10倍梯度稀释检测其灵敏度;紫外灯下观察凝胶电泳或加入荧光染料SYBR Green I的扩增产物。结果 设计的LAMP引物可以特异地针对冬虫夏草的csp2基因进行LAMP扩增,产物可被限制性内切酶Taq1酶切,且有较高的灵敏度,检出限达6 pg/mL。结论 LAMP法可以实现对冬虫夏草的快速鉴定检测,在中药鉴定中有着广阔的应用前景。     

HBV全基因组逆转录病毒载体的构建及鉴定

目的 构建HBV全基因组逆转录病毒载体,并进行酶切鉴定和测序.方法 用合适的引物,通过PCR方法 扩增pBlueScript sk(-)-HBV载体上的HBV全基因组,分别用Hind Ⅲ和Sd Ⅰ进行PCR产物和pLEGFP-N1载体的双酶切,用连接酶将HBV DNA和载体进行连接,转化连接产物后,进行质粒提取、酶切和测序鉴定.结果 PCR产物凝胶电泳可见3.2 kb条带.pLEGFP-N1-HBV重组质粒酶切结果 电泳后,可看见6.9 kb和3.2 kb的条带,测序结果 表明重组质粒含有HBV全基因组.结论 成功构建了HBV全基因组逆转录病毒载体,为下一步形成稳定的细胞模型奠定基础.     

选择性剪接变异体的RT-PCR检测及结果分析

目的 利用RT-PCR方法检测并分析mRNA选择性剪接变异体.方法 针对糖原合成酶激酶(GSK)3β和B细胞转位基因( BTG)3基因变异体差别设计引物,利用RT-PCR扩增后进行电泳和克隆DNA测序.结果 GSK3β和BTG3的RT-PCR产物电泳均出现3条带,经过电泳和克隆DNA测序发现GSK-3β中上面2条带为同一产物.对BTG3上(位于319 bp)、下(位于70 bp)2条带进一步PCR扩增后测序,结果发现3个条带均为同一产物.结论 RT-PCR法检测选择性剪接产物操作方便,对Western蛋白印迹结果评价具有指导意义,但是产生的非特异条带可能是由于某种特殊原因造成,如选择性剪接部位的特异核酸序列,需DNA测序做进一步确定.     

人SAMHD1基因核心启动子区域的初步鉴定和分析

目的 鉴定人不育-α-基序结构域和组氨酸/天冬氨酸残基双联体结构域包涵蛋白1 (SAMHD1)基因的核心启动子区域,研究SAMHD1的转录调控机制.方法 从HepG2细胞中提取基因组DNA,PCR扩增SAMHD1基因翻译起始位点上游937、667、553、399 bp片段.将扩增出的4个片段连入pMD19-T载体,双酶切鉴定后将DNA条带切胶回收,再连入pGL3-Basic载体中,双酶切及DNA测序鉴定.将包含有4个片段的荧光素酶表达载体与pRL-TK共转染HepG2细胞,荧光素酶报告基因活性检测并分析4个片段的启动子活性.5'RACE鉴定SAMHD1在HepG2细胞中的转录起始位点.结果 电泳结果显示已经从HepG细胞中提取出基因组DNA.PCR扩增后电泳结果显示已经扩增出937、667、553、399 bp片段.双酶切后电泳结果显示成功将扩增出的4个片段连入pMD19-T载体.双酶切及DNA测序鉴定已成功构建荧光素酶表达载体pGL3-937、pGL3-667、pGL3-553和pGL3-399.荧光素酶报告基因活性检测显示SAMHD1核心启动子区域位于0～-399区域(ATG前一个碱基为-1).5'RACE结果显示SAMHD1在HepG2细胞中转录起始位点位于-101.结论 SAMHD1的核心启动子位于翻译起始位点上游-101～-399区域,为深入研究肝细胞中SAMHD1转录调控机制奠定了基础.     

PCR在猴B病毒鉴定中的应用研究

目的为鉴定新分离毒株是否为B病毒.方法根据ScinicarielloF报道的引物,用PCR方法扩增BV147、HSV-1、HSV-2,对扩增产物进行SacⅡ内切酶消化.结果这一对引物可同时对这3种病毒进行扩增,但只有BV147的扩增产物可被SacⅡ内切酶切开.对BV147扩增片段克隆测序的结果证实,其与美国B病毒E2490株部分基因(UL27)相对应位置的核苷酸同源性为100%.结论初步建立了检测B病毒DNA的PCR方法并测定了新分离病毒毒株的部分基因序列,证明新分离的病毒为B病毒.     

大鼠MeCP2基因HSV-1型反义表达载体的构建与鉴定

目的以真核表达载体单纯疱疹病毒Ⅰ型(Herpes simplex virus type 1,HSV-1)质粒型载体(pHSV)作为表达载体,构建大鼠MeCP2基因反义表达载体.方法用PCR方法扩增出大鼠MeCP2 cDNA部分片段,将其反向插入表达载体pHSV,并以PCR、酶切电泳以及DNA测序等方法对重组质粒进行鉴定.结果经过PCR、酶切电泳以及DNA测序,鉴定出连接方向和插入序列正确的反义表达载体.结论成功构建了大鼠MeCP2基因HSV-1型反义表达载体,为进一步研究该基因的功能打下了基础.     

VCAM-1和EGFP双基因共表达重组腺病毒的构建

目的 构建VCAM-1和EGFP双基因共表达重组腺病毒载体.方法 采用DNA重组技术,将目的 基因VCAM-1克隆至含有报告基因EGFP的穿梭质粒;在BJ5183细胞中与pAdeasy-l质粒进行同源重组,产生重组腺病毒载体.结果 (1)VCAM-1基因与pAdTrack-CMV载体成功连接,经NotⅠ/XhoⅠ双酶切后电泳可见2个大小约为9kb和2kb左右条带,经PCR法扩增后电泳可见一个600bp左右条带,证明pAdTrack-CMV-VCAM-1重组质粒构建成功;(2)pAdTrack-CMV-VCAM-1质粒与pAdeasy-l质粒同源重组后,产物经PacⅠ酶切后电泳可观察到2个大小约为31kb和4kb左右条带,与预期结果相符.结论 Ad-VCAM-1-EGFP重组腺病毒载体构建成功.     

快速检测单核细胞增生李斯特菌LAMP方法的建立

目的:建立一种检测单核细胞增生李斯特菌核酸的快速、特异的环介导等温扩增(Loop-mediated isothermalamplification,LAMP)方法。方法:针对单核细胞增生李斯特菌的李斯特菌溶血素hlyA基因设计4条LAMP引物,在水浴箱内65℃保温约60 min,完成对单核细胞增生李斯特菌的扩增,扩增产物经肉眼、SYBR Green I染色和电泳鉴定。利用LAMP和PCR方法同时检测1株单核细胞增生李斯特菌和10株非单核细胞增生李斯特菌(对照组)来验证LAMP方法的特异性。用LAMP和PCR方法分别检测一系列稀释后的单核细胞增生李斯特菌菌液,比较两者的敏感性。结果:经肉眼、加染料和电泳均能观察到1株单核细胞增生李斯特菌LAMP扩增阳性反应,10株非单核细胞增生李斯特菌没有出现LAMP扩增。LAMP敏感度比PCR高,LAMP检测单核细胞增生李斯特菌的检测下限为3 cfu/ml,PCR检测下限>300 cfu/ml。LAMP检测速度比PCR更快,只需要60 min。结论:建立了一种检测单核细胞增生李斯特菌的快速、特异的LAMP方法。     

建立环介导等温扩增方法检测腹泻患者中小肠结肠炎耶尔森菌

目的建立快速的检测方法对腹泻患者中的小肠结肠炎耶尔森菌进行快速检测。方法利用析因设计试验方法建立并优化检测小肠结肠炎耶尔森菌的环介导等温扩增技术（LAMP）,并与普通PCR法对临床腹泻标本进行检测比较。结果析因设计试验确定LAMP最佳反应体系：Mg2＋＋为2．0mmol,内引物FIP／BIP为1．6umol,dNTPs为1．6mmol,时间为60rain,反应温度为63℃。对12种细菌进行LAMP扩增,仅小肠结肠炎耶尔森菌获得阳性扩增结果,小肠结肠炎耶尔森菌基因组DNA和纯培养物的检测灵敏度分别为38．05fg和15CFU／ml。对腹泻样本进行直接检测,检测限为150CFU／g。539例腹泻患者粪便标本中,LAMP成功检出13例样本中含有小肠结肠炎耶尔森菌,普通PCR检出11例,灵敏度为100％,特异度为99．62％。结论本方法检测小肠结肠炎耶尔森菌特异性强、灵敏度高．且操作简单、快速、检测成本低．适合基层单位及现场廊用．     

LAMP检测方法在尿液中检测大肠埃希菌的应用评价

目的探讨环介导等温扩增(LAMP)方法在尿液中检测大肠埃希菌的应用价值。方法利用文献报道的LAMP检测方法和分离培养法分别对95份尿液标本进行大肠埃希菌检测;检测结果经统计学分析来评价LAMP法和分离培养法的一致性。结果 LAMP方法检出20份标本大肠埃希菌阳性,阳性率为21.05%,可通过肉眼判断结果;分离培养法检出12份阳性,阳性率为12.63%;两种方法的检测结果经统计学分析,0.025相似文献   

藏药甘青乌头生物碱抗单纯疱疹病毒Ⅱ型体内外作用

目的探讨藏药甘青乌头脂溶性生物碱（ALA）和水溶性生物碱（AWA）抗单纯疱疹病毒Ⅱ型（HSV-2）的作用和机制。方法四甲基偶氮唑蓝法测定细胞毒性,细胞病变作用法和蚀斑法测定甘青乌头生物碱体外抗HSV-2活性,以半数有效浓度和治疗指数为评价指标;荧光定量聚合酶链式反应法（FQ-PCR）和蚀斑法考察ALA和AWA体外抗HSV-2作用机制。用HSV-2建立小鼠脑炎模型,对AWA体内抗HSV-2的活性进行评价。结果 ALA和AWA对Vero细胞的半数中毒浓度分别为3.57和7.87mg/mL。ALA和AWA半数有效质量浓度分别为4.99和2.81 mg/mL,治疗指数分别为0.72和2.80。ALA和AWA均能直接灭活HSV-2,能够显著抑制HSV-2的感染性。ALA对吸附到非洲绿猴肾细胞的HSV-2没有抑制作用,能微弱抑制HSV-2大分子的增殖,对HSV-2 DNA的复制没有作用。AWA能够抑制HSV-2吸附,抑制HSV-2大分子的增殖,抑制HSV-2 DNA的合成,抑制倍数达10~2。AWA对小鼠的半数中毒质量浓度为0.28mg/kg。AWA延长了小鼠的平均存活时间,对小鼠的死亡显示出10%的保护率。结论 AWA抗HSV-2的活性大于ALA,ALA主要通过直接灭活HSV-2,AWA通过抑制HSV-2复制循环的各个环节起作用。     

MTT分析法、空斑减数法及CPE观察法评估药物体外抗病毒效果的比较与分析

目的:比较MTT分析法、空斑减数试验及细胞病变效应(CPE)观察3种方法在评估药物体外抗病毒效果分析中的优劣,为选择适宜的药物体外抗病毒效果的检测方法提供实验依据。方法:分别采用 CPE法、MTT分析法和空斑减数试验法评价大黄素于体外抗疱疹病毒 1 型、疱疹病毒 2 型和柯萨奇病毒增殖的效果,比较 3 种检测方法的结果,并分析该方法的实用性与利弊。结果:在抗疱疹病毒增殖的检测中,MTT法与空斑减数法所测结果具有显著性差异,空斑减数法比MTT法更准确,但对抗柯萨奇病毒增殖的检测,MTT法与空斑减数法无明显差异。结论:MTT法与 CPE法结合,可广泛用于对抗病毒药物的筛选,但对于疱疹病毒类非杀细胞病毒,使用空斑减数法较好。     

LAMP与FQ—PCR技术检测HBVDNA的特异性和灵敏度比较

目的 采用环介导等温扩增反应（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）技术与实时荧光定量 PCR（real-time fluorescent quantitative PCR,FQ-PCR）技术检测 HBV DNA,并对 LAMP 方法的反应条件进行优化,比较两种方法检测 HBV DNA 的灵敏度及特异性。方法 选取经医院确诊的乙肝患者的血清,提取血清中的 HBV DNA 作为扩增模板,同时,对 LAMP 方法的各种条件进行优化,并分别采用 LAMP 和 FQ-PCR 两种方法对同一 HBV DNA 模板做 10 倍梯度稀释的标本进行 HBV DNA 的检测,比较其灵敏度;且分别用两种方法对乳头瘤病毒（HPV）、EB 病毒、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌以及正常人血清基因组 DNA 在相同条件下进行实验,观察两种方法在检测中是否出现假阳性结果,以确定两种方法的特异性。结果 对同一 HBV DNA 模板进行 10 倍梯度稀释后,FQ-PCR 技术在待测血清标本（2.38×107copy/ml）被稀释到 10-5,就难以进行准确检测了,而 LAMP 方法在待测血清标本被稀释到 10-7时,仍然能够获得较好的扩增结果;对 HPV、EB 病毒、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌以及正常人血清基因组 DNA 进行 LAMP 和 FQ-PCR 检测,结果均为阴性。结论 采用 LAMP方法可以成功、快速、高效、特异的扩增 HBV DNA,与 FQ-PCR 方法比较,都能特异地检测 HBV DNA,但 LAMP 方法具有更高的灵敏性,操作更为简单、方便,而且不需要昂贵的仪器,更适合基层检测机构的推广使用。     

阿米洛利通过自噬溶酶体途径保护PC12细胞

目的: 研究酸敏感离子通道阻断剂阿米洛利对大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞株的保护作用及其对自噬溶酶体通路的影响。方法: 在PC12细胞模型上,观察甲基苯基吡啶（methy-phenylpyridi,MPP+）处理对细胞存活率（MTT检测）、乳酸脱氢酶（LDH）漏出率、细胞凋亡率的影响,并观察阿米洛利对MPP+所致细胞死亡的影响;蛋白质印迹法检测大自噬通路标志蛋白LC3和分子伴侣介导的自噬通路标志蛋白LAMP2a表达水平的变化。结果：MPP+导致细胞存活率明显降低,上清液中LDH漏出率明显升高,细胞凋亡率升高,抑制大自噬通路标志蛋白LC3-Ⅱ的表达,同时上调了分子伴侣介导的自噬通路标志性蛋白LAMP2a的表达水平;而阿米洛利可提高细胞存活率,减少上清液中LDH漏出率,降低细胞凋亡率,并能在激活大自噬通路的同时下调分子伴侣介导的自噬通路的活性。结论：阿米洛利可能通过抑制酸敏感离子通道的作用拮抗MPP+诱导的PC12细胞自噬性死亡。     

单纯疱疹病毒1型糖蛋白B基因疫苗的构建

目的：构建用于治疗和预防单纯疱疹病毒性角膜炎的核酸疫苗,探讨单纯疱疹病毒1型糖蛋白B(HSV-1gpB)基因作为基因疫苗的可能性。方法：利用PCR技术从HSV-1 SM44毒株基因组中扩增出编码HSV-1gpB去除N端部分信号肽序列(39 bp)的基因片断（2 673 bp）,定向插入真核表达质粒pcDNA3载体中,构建出重组真核表达质粒pcDNA-gpB,并对其进行酶切分析、PCR鉴定及测序鉴定。 结果：双酶切重组质粒pcDNA-gpB,电泳可见两条带,分别为目的基因（2 700 bp）和线性质粒pcDNA3（5 400 bp）; 以重组质粒pcDNA-gpB为模板进行PCR扩增,在2 700 bp位置扩增出特异的产物;测序结果表明,克隆基因插入方向正确,与GenBank中登录的HSV-1 F株gpB基因序列比较,同源性达99.5%。 结论：利用PCR技术从HSV-1 SM44株基因组中扩增出编码HSV-1gpB去除N端部分信号肽序列（39 bp）的基因片断（2 673 bp）, 成功地构建了HSV-1基因疫苗pcDNA-gpB。     

猴疱疹病毒(B病毒)抗体检测方法的比较研究

目的 对HSV-1作抗原的玻片酶免疫法（EIA）用于B病毒抗体检测的可靠性进行研究。方法 用HSV-1为抗原的玻片酶免疫法（EIA）和酶联免疫吸附法（ELISA）与B病毒为抗原的斑点酶免疫法（DIA）、免疫荧光法（IFA）及酶联免疫吸附法（ELISA）对猕猴血清进行B病毒抗体检测的比较分析。结果 HSV-1为抗原的EIA与B病毒为抗原的DIA、IFA和ELISA检测结果的符合率分别为100％、95．6％和97．4％；HSV-1为抗原的EIA检测确定的阴性血清样本，经B病毒抗原的IFA检测均为阴性；在HSV-1为抗原的EIA确定的779份阴性血清中，经B病毒抗原的ELISA检测，有2．6％（20份）为阳性；HSV-1抗原的EIA和HSV-1为抗原的ELISA检测均为阴性的20份血清样本，经B病毒抗原的ELISA检测，18份仍为检出阴性，2份为阳性。结论 HSV-1为抗原的EIA的检测结果与B病毒抗原的DIA、IFA和ELISA的检测结果一致性较好。同时，用HSV-1抗原进行B病毒抗体检测，存在极少数阳性动物漏检的可能。