PCR-RSSO基础上HLA-Ⅰ、Ⅱ基因分型的研究

目的通过对PCR-DNA技术的分析,探讨人类白细胞抗原(HLA)基因分型方法。方法采用PCR反向序列特异性寡核苷酸(polymerase chain reaction-reverse sequence specific oligonucleotide,PCR-RSSO)杂交技术,建立改良半量扩增体系全自动HLA-I、Ⅱ等位基因分型方法,进行了635份血液标本HLA-A、B、C、DR、DQ等位基因分型,其中166份DNA同时采用序列特异性引物技术(PCR-SSP)和手工全量扩增体系PCR-RSSO技术。对全自动半量PCR-RSSO、PCR-SSP、手工PCR-RSSO 3种方法做两两比较。结果全自动半量PCR-RSSO的分型成功率为98.4%(3 124/3 175),PCR-SSP为98.8%(656/664),手工PCR-RSSO为88.3%(733/830)。经χ2检验,全自动半量PCR-RSSO与PCR-SSP的分型成功率无统计学差异,与手工PCR-RSSO有显著差异(P<0.05)。结论PCR-RSSO可识别HLA-Ⅰ,Ⅱ共706个等位基因,覆盖WHO命名委员会2000年公布的936个等位基因的75.43%;对706个HLA等位基因的分型均为中~高分辨率,有分辨纯合子等位基因的能力;易长期保存书面的实验原始资料,即杂交条;具有成本低、劳动强度低、省时和DNA消耗量少等优点。PCR-RSSO适合于造血干细胞移植和建立造血干细胞及脐带血干细胞库的组织配型。     

HLA—Ⅱ血清学分型与微量SSP法基因分型的比较分析

目的 验证微量序列特异性引物（SSP）技术进行HLA－Ⅱ类移植配型的准确性并探讨血清学分型错误发生的原因。方法 采用聚合酶链反应结合微量SSP技术（简称微量PCR－SSP法）以及单克隆抗体血清学分型技术对血清样品进行HLA分型并比较其结果。结果 （1）微量PCR－SSP法检测的110例样本中，99例检出HLA－DR的396个等位基因、11例检出HLA－DQ的22个等位基因，检出10％的单倍型个体；（2）两种方法对比研究发现单克隆抗体血清学分型检出错误和漏检率较高，其误差在DR和DQ分别为38．81％和50．75％；（3）错误发生和易混淆的抗原为：DR15／16、11／12、13／14、8、12和DQ5／6、8／9。结论 微量SSP法可以准确检定血清学易漏检和发生错误的抗原等位基因。     

脐血HLA—I类抗原PCR—SSP分型的研究

目的 探讨PCR－SSP（聚合酶链反应－序列特异性引物）分型方法在脐血HLA－I类抗原分型中的应用价值。方法 53例脐血用免疫磁珠分离T淋巴细胞，单克隆抗体配型板作血清学分型，其中38例脐血用DNA快速抽提技术提取DNA后进行PCR－SSP基因分型，对两种方法分型结果进行对比研究。结果 38例脐血中，HLA－A位点PCR－SSP方法与血清学分型方法结果符合率100％，HLA－B位点血清学方法分型误差率为13．2％，其中1个抗原错误（占1．3％），9个抗原漏检（占11．8％）。脐血采集后24小时内作血清学分型较理想，超过24小时则半数以上不能进行血清学分型。抽提脐血DNA一次成功率100％，不受时间限制。结论 在脐血HLA－I类抗原分型中，PCR－SSP方法准确、省血、标本限制少，明显优于血清学方法，适用于脐血库。     

重庆地区人群HLA-A、B、DRB1基因多态性研究

目的了解重庆分库HLA—A、B、DRB1基因多态性，分析重庆地区人群HLA—A、B、DRB1基因频率分布特征，为重庆地区建立造血干细胞捐献者资料库提供依据。方法采用PCR—SSP方法对来自中国造血干细胞捐献者资料库重庆分库的3957名无血缘关系的捐献者．进行基因分型，计算HLA—A、B、DRB1基因频率，并与其他人群进行比较。结果在重庆地区人群中检出了75种HLA基因特异型。其中HLA—A位点19个，HLA—B位点41个，HLA—DR位点15个。A＊02（29．37％），A＊11（29．1％）和A＊24（17．3％）为重庆分库捐献者HLA—A座位的主要等位基因；HLA—B座位中，B＊46（14．98％），B＊4001（13．19％）和B＊13（9．39％）为主；HLA—DRB1座位以DRB1＊09，DRB1＊15，DRB1＊12，DRB1＊04出现频率高。结论重庆地区人群的HLA基因多态性与南方汉族接近，并有其特点。HLA基因分布具有民族和地域特征，为了能最大限度地募集到带有不同HLA分型的造血干细胞供者，有必要在我国多个地区筛选造血干细胞捐献者。     

造血干细胞移植中HLA—A、B、C基因分型影响因素的探讨

目的：为提高造血干细胞移植供—受体HLA-I类配型的准确度、特异性和分辨率，对HLA—A、B、C位点基因分型的影响因素进行探讨。方法：分别采用2％EDTA钠盐、钾盐和肝素抗凝血标本，提取200例造血干细胞移植供—受体的外周血DNA，采用美国PEL—FREEZ微量SSP^TM HLA—1类分型试剂盒对该200例标本进行基因分型，并对其影响因素进行分析。结果：2％EDTA钠盐抗凝血标本扩增效果好于2?TA钾盐抗凝和肝素抗凝。DNA浓度范围为25-200ng／μl，最佳浓度为100ng／μ1，A260／A280比例在1．65—1．80之间。溴化己锭(EtBr)浓度为0．2—0．5μg／ml，EtBr量不足将导致无反应带或反应带变弱，EtBr量过多使凝胶本底偏高，影响阳性带的判定。DNA Tag酶的最终反应浓度为0．05U／μl，其活性的高低将直接影响反应结果。结论：确立了HLA——A、B、C位点基出分型PCR—SSP的最佳实验条件，必将提高临床造血干细胞移植供—受体HLA—1类配型的准确度、特异性和分辨率。     

MicroSSP法用于器官移植病人HLA—DR／DQB1等位基因分型的研究

目的：通过快速、准确的微量序列特异性引物聚合酶链法对器官移植病人HLA－DR／DQB1等位基因分型。方法：MicroSSP法^[1]是在PCR－SSP法的基础上建立起来的。可用于低或高分辨的HLA分型；此法有理想的引物和布局；引物和对照物事先包被在干板上；应用微量SSP凝胶系统电泳仅用2－4分钟；配有视窗系统分析软件，确保了分析结果的准确性。结果：选择了76例肝、肾移植病人进行HLA－DR／DQB1分型，共检出14种DRB1、7种DQB1等位基因。频率最高的为DRB1＊1501－1502、DRB1＊1401、1404、1405、DRB1＊0701－0702、DRB1＊1201、1202。DQB1＊05、DQB1＊06、DQB1＊07。符合东方人基因频率的分布。分型全部成功。结论：MicroSSP法具有快速（整个实验仅用2小时）、需血量少、分辨率高、方法稳定、结果判断准确等优点。特别适用于尸体器官的供体配型。     

HLA-DRB1基因多态性与儿童急性淋巴细胞白血病易感性的关联

目的 探讨儿童急性淋巴细胞白血病（儿童－ALL）易感笥与HLA－DRB1基因多态性的关联性，找出儿童急性淋巴细胞白血病的易感基因。方法 采用序列特异性引物聚合酶链反应（PCR－SSP）DNA分型技术对30例儿童－ALL患者及53便健康对照进行了HLA－DRB1基因分型。结果 儿童－ALL患者与HLA－DRB1＊15基因关联，基因频率为25．0％，RR＝3．08，x^2＝5．56，P＜0．025。其他等位基因频率与对照组之间无显著性差异。结论 提示在华北汉族人群中，HLA－DRB1＊15与儿童急性淋巴细胞白血病有关联。     

HLA—B^＊27高分辨等位基因在1606例疑似强直性脊柱炎患者中的表达

目的：探讨HLA—B^＊27高分辨等位基因分析对强直性脊柱炎（AS）诊断和鉴别诊断的临床应用价值。方法：采用PCR—SSP和PCR．SBT技术对2004年1月-2008年3月本院收治的广东地区1606例骨和关节疾病（OAP）患者（其中确诊AS患者1022例）进行了HLA-B^＊27低分辨和HLA-B^＊27高分辨的基因频率调查和分析。结果：OAP患者中B^＊27高分辨基因频率（70．50％，141／200）高于B^＊27低分辨基因频率（41．82％，588／14061（P〈0．001）；1022例AS患者中高分辨的B^＊27基因频率（84．21％，121／133）也高于B^＊27低分辨基因频率（44．77％，398／889）（P〈0．001）。HLA—B^＊27阳性患者表达出的HLA—B^＊27等位基因为B^＊2704占88．44％（459／519），B^＊2705占9．83％（51／519），B^＊2702占1．73％（9／519）。结论：高分辨技术能够准确检测HLA—B^＊27阳性患者，AS患者在不同地区或人群所表现出的HLA—B^＊27易感基因不同；应用高分辨技术进行HLA—B^＊27等位基因分型，将有益于提高AS早期诊断和鉴别诊断，发挥对AS预后预测和治疗选择的临床应用价值。     

PCR—SSP法检测HLA—Cw位点等位基因在中国北方汉族人群中的分布

目的：了解HLA－Cw位点等位基因在中国北方汉族人群中的频率分布，为该位点相关研究奠定基础。方法：应用PCR－SSP法（多聚酶链－序列特异性引物扩增法）。结果：本研究合成的45条特异性引物和两条内质控引物，检测出HLA－Cw位点上的20个等位基因，检出47种基因型，首次在中国人群中检测到HLA－Cw0704，1502和1505。结论：应用PCR－SSP法进行HLA－Cw位点分型，实验快速、准确、可靠。我们不仅了解了HLA－Cw位点等位基因在中国北方汉族人群中的频率分布特征，并进一步分析、证实了HLA－Cw位点在不同种族、地域间的基因多态性，为今后HLA－Cw位点相关的研究提供依据。     

序列特异性PCR在HLA-DRB1基因分型中的应用

参照HLAⅡ型基因序列设计8条序列特异性引物，应用分别代表HLA－DR1－18血清学特异性的11株DNA标准品建立序列特异性PCR（PCR-SSP）和套式PCR方法，并对64例IDDM病人和72例健康对照者进行HLA－DRB1基因分型。结果：（1）方法学鉴定示各序列特异性引物均能从11株DNA标准品中扩增出相应的等位基因，并能检出来合子。除HLA－DR3组特异引物对DR1发生交叉外，其余序列特异性引物扩增中均未出现交叉现象，且重复性好；（2）样本测定显示IDDM组与对照组HLA－DR1、DR2、DR4、DR7、DR8和DR10各等位基因频率无显著差异。结果表明，PCR-SSP不仅具有较好的敏感性、特异性和重复性，而且显得简便、快速经济，有较好的应用前景。     

PCR-SSP法HLA-A、B基因分型与血清学分型的比较

目的 比较聚合酶链反应-序列特异性引物(PCR-SSP)进行HLA-Ⅰ类A、B抗原位点分型的准确性，并探讨血清学分型错误发生的原因。方法 用PCR-SSP以及单克隆抗体血清学分型技术对HLA-A、B分型并比较。结果 34例样本PCR-SSP基因分型无假阳性和假阴性出现。PCR-SSP法与血清学比较，血清学检出错误或漏检率分别为HLA-A位点23.5％，B位点26．5％。血清学发生错误或易混淆的抗原有：A2和A68、A32和A33，B5、B60和61。结论 PCR-SSP法进行HLA-A、B抗原等位基因分型具有分辨率高、特异性强、重复性好、实验过程简捷快速、分型结果较血清学更加准确可靠的优点。     

人类白细胞抗原—I类抗原的DNA分型与临床应用

目的 采用顺序特异引物聚合酶链反应技术（ＰＣＲ－ＳＳＰ）建立汉族人群白细胞抗原－Ｉ（ＨＬＡ－Ｉ）类抗原Ａ、Ｂ位点ＤＮＡ分型方法。方法 设计合成８１个特异性引物和１对阳性对照引物,组成２０个ＰＣＲ反应用于Ａ位点分型、４１个ＰＣＲ反应用于Ｂ位点分型。结果 所有样本ＰＣＲ－ＳＳＰ基因分型均获得成功,无假阳性和假阴性出现,４０份样本的重复率１００％,总耗时５小时。分型结果经双盲验证完全符合。可准确分辨出Ａ     

人类白细胞Ⅰ、Ⅱ类抗原的中分辨度基因芯片分型技术研究

目的 应用基因芯片技术进行北方汉族人群人类白细胞抗原（HLA）Ⅰ、Ⅱ类中分辨度分型研究.方法 根据中国北方汉族人群HLA-Ⅰ、Ⅱ类常见的基因位点以及临床应用中对分型分辨度的实际需要,设计特异性寡核苷酸中分辨度分型探针,制成基因分型芯片.采用带荧光标记的引物,用合适的PCR方法扩增HLA-Ⅰ、Ⅱ类抗原上的多态性区域,产物与芯片上探针杂交.杂交结果经荧光扫描并用特定软件分析判断阳性探针,以此确定样品基因型.共检测30份临床样本.结果 所有样本的HLA-Ⅰ、Ⅱ类抗原基因分型均获成功.此中分辨度探针可分辨出598个Ⅰ类抗原等位基因,511个Ⅱ类抗原等位基因,可捡出Ⅰ抗原特异性57个,Ⅱ抗原特异性30个.结论 基因芯片用于HLA-Ⅰ、Ⅱ类抗原分型可行.     

参照链介导的构象分析策略在人类白细胞抗原-A基因位点分型中的临床应用

目的 建立并稳定人类白细胞抗原(HLA)分型新策略-参照链介导的构象分析(RSCA)系统;以HLA—A位点为靶标,鉴定RSCA分型策略的优劣。方法 采用国际RSCA协作组提供的20例标准分型DNA首先确定RSCA系统的稳定性、准确性及可复性。然后分别提取84例拟进行造血干细胞移植病人及家系成员的外周血DNA,采用RSCA和序列特异性引物体外基因扩增(PCR—SSP)法平行对照对HLA-A基因位点进行分型。结果 对20例标准分型：DNA的分型结果显示,所获分型结果与国际RSCA协作组的完全一致,准确性及重复率均为100％。在全部84例移植病人及家系成员标本中,有82／84例(97．6％)标本可明确判定结果,其中有33／84例(39％)可直接指定等位基因型别;此外,还有2／84例(2．4％)标本因PCR扩增结果太弱,致使RSCA法未能获得分型结果。随机选择20例移植标本进行RSCA重复性实验表明,前后结果完全一致,然而在PCR-SSP分型中,约有10％的标本需要重复1—3次方能判定结果。结论 RSCA与PCR—SSP分型结果相比,具有灵敏、特异、分辨率高、重复性好、可发现变异基因及新的等位基因、高通量和低成本的优点,非常适合于对拟进行非血缘异基因造血干细胞移植供-受体进行HLA分型。缺点则是对于单个分型标本而言所花时间较长,对DNA标本纯度要求较高,数据库尚需进一步完善。     

DMD患者脐带血干细胞移植中的HLA配型

[目的]了解假肥大型肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy,DMD)患者接受脐血干细胞移植中HLA-A B DR不相合几率.[方法]用PCR反向序列特异性寡核苷酸(polymerase chain reaction-reverse sequence specific oligonucleotide,PCR-RSSO)杂交技术,在对30例DMD患者进行HLA-A B OR基因分开的基础上,将其与广东脐血库中的668份脐血干细胞HLA配型分析比较.[结果]13%(4/30)例患者找到HLA抗原全相合并满足移植细胞数要求的脐血干细胞;50%(15/30)例患者找到HLA抗原1个不相合并满足细胞数要求的剂血干细胞;20%(6/30)例患者找到HLA抗原0～1个不相合且细胞数达要求的2倍以上脐血干细胞.[结论]DMD患者寻找到合适的脐带血干细胞的几率较高,有利于对此病进行临床脐血干细胞移植.     

PCR-SSP对潜在输血需要住院患者ABO基因分型的检测效果与意义

【目的】 调查潜在输血需要住院患者的ABO血型基因,分析ABO表型相同输血中ABO基因型的错配输血几率。【方法】 对502例潜在输血需要的住院患者,采用血清学方法和聚合酶链反应-序列特异性扩增技术(PCR-SSP)检测ABO血型的表型及基因型。比较两种方法学对ABO血型表型的一致率;统计各ABO等位基因及各ABO基因型的频率;并分析潜在输血需要的住院患者在接受ABO血型表型相同的输血时,ABO基因错配输血几率。 【结果】 血清学与PCR-SSP对502例潜在输血需要的住院患者的ABO表型识别的一致率为100%。PCR-SSP技术检测出患者中常见ABO基因5个(O1、O2、A1、B1及A2)以及ABO基因型16个(O1O2、O1O1、B1O1、A1O1、A1O2、B1O2、O2O2、A1B1、A1A1、B1B1、A2O1、A2O2、A2B1和A1A2),而血清学仅能识别ABO表型。潜在输血需要住院的患者在接受ABO血型表型相同的随机输血中,与供者之间ABO基因型的错配率分别为:A型65.98%,B型57.39%,O型56.95%,AB型22.55%。 【结论】 PCR-SSP能识别ABO基因型,不仅可以作为血清学的有力补充,而且可能揭示输血治疗中不明原因的输血不良反应的临床原因,具有重要临床意义。     

广东汉族人群HLA-DRB1基因多态性分布

目的 调查HLA-DRB1基因位点遗传多态性在广东汉族人群中的分布.方法 应用聚合酶链反应-序列特异性引物方法和反向聚合酶链反应-序列特异性寡核苷酸探针杂交的方法对1058名广东汉族人进行低分辨率HLA-DRB1基因分型.结果 共检出HLA-DRB1位点的15种等位基因,其中以HLA-DRB1* 12频率最高(14.60％),其次为HLA-DRB1* 09、*15和HLA-DRB1*04,基因频率分别为14.13％、13.33％和10.16％.等位基因分布结果符合Hardy-Weinberg平衡.该人群与北方汉族、日本、白人和黑人分别进行x2检验差异有统计学意义(P＜0.05).结论 广东汉族人群HLA-DRB1基因分布有自身特点.     

HLA—Ⅰ类等位基因与中国汉族人白癜风的相关性

①目的探讨HLA-I类等位基因与中国汉族人白癜风的相关性。②方法采用聚合酶链反应-序列特异性引物(PCR-SSP)方法,检测187例汉族人白癜风患者和252例正常对照组进行HLA-I类等位基因频率。③结果白癜风患者HLA-A*2501、-A*30,-B*13、-B*27与-Cw*0602等位基因频率较对照组显著升高,HLA-A*66等位基因频率则较对照组显著降低;HLA-A*2501、-A*30、-B*13、-B*27与-Cw*0602等位基因频率在泛发型白癜风患者中显著升高。④结论HLA-A*2501、-A*30、-B*13、-B*27与-Cw*0602等位基因可能是白癜风易感基因或与易感基因相连锁;HLA-A*66等位基因可能具有保护作用;局限性、泛发型白癜风在其遗传背景上可能存在差异。     

用顺序特异引物聚合酶链反应技术行HLA—A抗原DNA分型

作者采用顺序特异引物聚合酶链反应技术（ＰＣＲ－ＳＳＰ）建立了汉族人群ＨＬＡ－Ａ,位点ＤＮＡ分型方法。研究采用ＰＣＲ－ＳＳＰ对３４５例肾移植供受者样本ＤＮＡ行ＨＬＡ－Ａ位点基因分型均获得成功,共检出Ａ位点等位基因总数６３５个,其中纯合子５５例,杂合子２９０例,可准确分辨ＨＬＡ－Ａ位点等基因２０个,无假阳性和假阴性出现,重复率１００％,总耗时５小时分型结果经标准ＤＮＡ验证和美国加州大学配型中心双盲验证