红花DHDPS基因全长cDNA的克隆及植物表达载体构建

目的克隆红花赖氨酸生物合成途径关键酶二氢吡啶二羧酸合酶(dihydrodipicolinate synthase DHDPS)基因的全长c DNA序列,构建植物超表达载体。方法根据红花转录组文库注释信息获得红花DHDPS(CtDHDPS)基因的中间序列,通过RT-PCR与RACE技术从红花种子中克隆CtDHDPS基因全长c DNA序列。采用DNA重组技术构建p BASTA-CtDHDPS植物超表达载体。结果分离CtDHDPS基因全长1 309 bp,开放阅读框954 bp,编码317个氨基酸,编码蛋白理论等电点为5.93,相对分子质量约为34 750.79。通过DNA重组技术成功构建了植物超表达载体p BASTA-CtDHDPS。结论获得CtDHDPS基因全长c DNA序列并成功构建植物超表达载体,为阐明CtDHDPS基因的生物学功能及其在红花赖氨酸生物合成途径中作用机制提供科学依据。     

金荞麦黄酮醇合酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的 克隆金荞麦黄酮醇合酶(FdFLS)基因的编码序列,并对该基因进行序列分析、原核表达及其活性研究.方法 采用同源克隆技术获得FdFLS基因cDNA序列,并对其进行生物信息学分析;构建FdFLS原核表达载体pET-30b(+)-FdFLS,在大肠杆菌BL21 (DE3)中诱导表达,并测定目标蛋白的酶学活性.结果 FdFLS基因开放阅读框(ORF)全长1008 bp,编码334个氨基酸;FdFLS基因在大肠杆菌中可表达出相对分子量约4×104的蛋白,并具有将二氢槲皮素和二氢山柰酚转化为槲皮素和山柰酚的催化活性.结论 首次克隆到FdFLS基因,并实现该基因在大肠杆菌中有活性的表达.     

红花bZIP20转录因子基因的克隆、表达分析及植物表达载体构建

目的克隆红花花瓣中b ZIP20(Basic region/leucine zipper motif)基因,研究其在不同组织中的表达量并构建其植物表达载体。方法根据红花转录组测序结果挑选b ZIP基因的设计引物,以红花花瓣总RNA为模板,采用RT-PCR法扩增b ZIP20基因开放阅读框(ORF)片段,利用RT-PCR法分析在红花不同组织以及尖孢镰刀菌侵染后红花根部b ZIP20基因的表达量,同时构建植物表达载体p BASTA-b ZIP20。结果 b ZIP20基因ORF长981 bp,编码326个氨基酸(Gen Bank登录号为KT692605)。红花b ZIP20与其他物种氨基酸具有一定的同源性,其与芝麻、野茶树的氨基酸序列相似性高达85.41%和83.99%。实时荧光定量PCR分析表明,b ZIP20基因在不同组织中的表达水平具有显著差异,在花中呈现高表达,而在其他组织中低表达。接种尖孢镰刀菌的红花根部组织中b ZIP20基因的表达显著上调。结论成功地对b ZIP20基因进行克隆及表达分析,并构建植物表达载体p BASTA-b ZIP20。     

布渣叶查耳酮合酶基因全长cDNA克隆及其表达模式分析

目的克隆布渣叶查耳酮合酶基因(Mp CHS)全长c DNA,并对其在不同部位和不同生长阶段叶片中的表达模式进行分析。方法以布渣叶叶片总RNA逆转录合成c DNA为模板,根据其转录组数据设计特异引物序列,PCR扩增Mp CHS基因全长c DNA,经质粒连接、转化、扩培,挑选阳性克隆测序、分析并构建原核表达载体。同时,采用实时荧光定量PCR(RT-q PCR)对Mp CHS基因的表达模式进行分析。结果成功克隆得到Mp CHS基因全长c DNA(Gen Bank:KY472608)。生物信息学分析表明其开放阅读框为1 176 bp,编码含391个氨基酸的蛋白,其相对分子质量为42 700,理论等电点6.11,具有CHS家族蛋白3个保守的功能活性位点(165 C、304 H和337 N)和特征多肽标签序列RLMMYQQGCFAGGTVLR和GVLFGFGPGL。系统进化树分析发现Mp CHS与可可、陆地棉等木本植物的亲缘关系比较近。RT-q PCR结果表明,Mp CHS基因在不同部位均有表达,在叶片中的表达量随着生长过程逐步降低。结论首次克隆得到Mp CHS基因,并分析了Mp CHS基因在布渣叶不同部位和不同生长阶段叶片中的表达模式,为Mp CHS基因的原核表达和功能验证奠定了基础,也为进一步解析布渣叶黄酮类生物合成途径提供了参考。     

红花单功能反馈抑制敏感型CtAK1基因克隆、序列分析及表达载体构建

目的分离红花天冬氨酸代谢途径关键酶天冬氨酸激酶(AK)基因的全长cDNA序列,进行植物超表达载体构建。方法根据红花种了转录组文库注释和qRT-PCR鉴定的AK基因核心片段及表达分析数据,采用RACE技术获得红花AK(CtAK)基因的全长cDNA,利用DNA重组技术构建植物超表达载体。结果生物信息学分析表明,CtAK基因全长1 703bp,ORF区为1 626 bp,编码541个氨基酸残基,功能结构域分析推测,该基因可能为单功能反馈抑制敏感植物AK1。通过DNA重组技术成功构建以35 S为启动子和Bar抗性基因并含有叶绿体转运肽的pCAMBIA3301-CTP-AK1植物超表达载体。结论获得CtAK1基因的编码序列并构建植物超表达载体,为进一步研究其生物学功能及其在红花氨基酸代谢调控中的作用机制奠定基础。     

红花栝楼鲨烯合酶基因的克隆及其序列分析

目的克隆红花栝楼鲨烯合酶(squalene synthase,SS)的基因并进行序列分析,为进一步研究葫芦科植物三萜合成通路关键酶SS的正选择位点与功能的关联性分析奠定基础。方法根据绞股蓝与罗汉果SS基因c DNA比对分析的结果,设计SS的5’端简并引物,采用3’RACE扩增红花栝楼SS全长c DNA基因。结果获得红花栝楼SS c DNA全长共1 466个核苷酸,其中包括一个含有1 254个核苷酸的开放读码框,编码417个氨基酸残基。通过NCBI的Blast比对,发现红花栝楼SS基因编码的氨基酸序列与已知植物SS基因编码的氨基酸序列同源性为78%~94%,核苷酸的同源性为74%~93%。结论成功克隆了红花栝楼SS的全长c DNA,为进一步研究红花栝楼SS基因结构、基因表达、基因突变提供了基础,并为葫芦科植物三萜合成通路关键酶SS的正选择位点与功能的关联性分析提供了数据支持。     

红花黄酮醇合成酶基因片段的克隆及表达分析

目的克隆红花花瓣中的黄酮醇合成酶(flavonol synthase,FLS)基因并研究其在不同开花时期的表达量。方法根据红花花瓣转录组测序结果挑选FLS基因的设计引物,以红花花瓣总RNA为模板,采用RT-PCR的方法扩增FLS基因片段并连接到PEASY-T1载体上,阳性克隆经PCR检测后进行测序。结果获得了224 bp的序列,将获得的序列在NCBI上进行Blast比对,该基因与其他物种的FLS基因具有较高的同源性。结论克隆了红花FLS基因中间片段,根据FLS基因片段设计引物,对红花不同品种不同开花时期进行荧光定量PCR分析,红花FLS基因在吉红油姊妹系的盛花期表达量最高。     

雷公藤单萜合酶基因TwMS的克隆及蛋白表达分析

该研究克隆得到1条雷公藤单萜合酶基因TwMS。其完整开放阅读框为1797bp,编码579个氨基酸,相对分子质量为69.75kDa、理论等电点为5.37。生物信息学分析表明,TwMS具有单萜合酶的特征结构域,属于萜类合酶TPSb亚家族。实时荧光定量PCR检测显示,经茉莉酸甲酯(MeJA)诱导后,TwMS的相对表达量显著上调,并在24 h达到最高。此外,该研究在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达TwMS蛋白,为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

红花ERF1转录因子的克隆及植物表达载体的构建

目的克隆1条红花AP2/ERF家族转录因子编码区序列,并构建植物表达载体。方法在红花转录组测序基础上,利用RT-PCR方法克隆1条红花AP2/ERF家族转录因子编码区序列(Ct ERF1)并进行生物信息学分析,利用ClustalW 1.83软件构建系统进化树,在Ct ERF1基因序列两端引入SpeI和XbaI酶切位点,构建含有35S启动子的植物超表达载体p BASTA-Ct ERF1。结果 CtERF1基因编码297个氨基酸,且具有典型的AP2/ERF基因的功能结构域,含有1个AP2区域,为ERF亚族蛋白,亚细胞定位分析推测其定位在细胞质和细胞核上。系统进化分析表明,Ct ERF1基因编码氨基酸与其他物种氨基酸具有一定的同源性,其中与杨树和人参的亲缘关系最近。通过分子生物学方法,成功构建p BASTA-CtERF1植物表达载体。结论成功克隆了1条红花AP2/ERF家族转录因子编码区基因Ct ERF1,并构建了植物表达载体p BASTA-Ct ERF1。     

雷公藤牻牛儿基焦磷酸合酶基因TwGPPS克隆与表达分析

根据雷公藤悬浮细胞转录组数据设计特异引物,采用cDNA末端快速扩增技术克隆雷公藤牻牛儿基焦磷酸合酶基因TwGPPS1,TwGPPS2全长cDNA,并进行生物信息学分析和蛋白表达研究。首次克隆得到TwGPPS1核苷酸的完整开放阅读框长度为1 278 bp,编码425个氨基酸蛋白,预测蛋白等电点为6.68,相对分子质量为47.189 kDa;TwGPPS2核苷酸的完整开放阅读框长度为1 269 bp,编码422个氨基酸蛋白,预测蛋白等电点为6.71,相对分子质量为46.774 kDa;进一步构建了原核重组表达载体pET-32a-TwGPPS1,pET-32a-TwGPPS2,并成功诱导出TwGPPS1,TwGPPS2重组蛋白,为深入研究此关键酶基因功能和雷公藤萜类生物合成途径奠定基础。     

红花查尔酮合成酶基因的克隆、生物信息学分析及表达

目的克隆红花查尔酮合成酶基因(chalcone synthase,CHS),运用生物信息学分析CHS,比较花期中每天CHS的表达,为红花有效成分合成及调控机制研究提供基础。方法从新鲜红花花冠中提取RNA,反转录为cDNA,设计特异性引物,克隆获得CHS。通过生物信息学对该基因蛋白的特征进行分析,使用MEGA5.1构建CHS与相关物种CHS的系统进化树,利用real-time PCR分析花期中每天红花CHS的表达量,并进行分析和比较。结果克隆获得的红花CHS,序列全长为1 149 bp,具有1 041 bp的完整开放阅读框,编码346个氨基酸。将该蛋白通过NCBI上的Blastp比对发现,该蛋白属于CHS家族,比对结果显示红花CHS与100余种NCBI上登录的植物有相似性,其中与水飞蓟、翠菊、菊花、红凤菜的相似性分别达95%、95%、94%、94%。将相似性在90%以上的物种用MEGA5.1构建进化树,结果显示红花CHS与水飞蓟CHS亲缘关系最近。通过ProtParam预测红花CHS蛋白分子式为C1678H2693N451O493S20,相对分子质量为37 700,等电点为6.10,负电荷的氨基酸残基数(Asp+Glu)为42,正电荷的氨基酸残基数(Arg+Lys)为38。基因表达分析结果表明红花CHS在花期第3天的相对表达量最高,远远高于花期其余时间。结论成功克隆、分析并表达了红花CHS,为红花有效成分合成及调控机制研究提供基础。     

红花黄酮类成分累积量与功能基因表达水平的关联分析

记录并计算红花开花1~7 d的平均产量,采用HPLC检测红花中羟基红花黄色素A(HYSA)、槲皮素、柚皮素和山柰酚的含量,使用Real-time PCR检测chs,chi的相对表达量,并进行相关性分析。红花平均产量、HYSA和柚皮素的含量及基因表达量之间呈现相似的变化趋势。平均产量于开花第3天达到最大值,与HYSA含量存在较高正相关性(r=0.756,P0.05),与chi的相对表达量存在极高正相关性(r=0.892,P0.01);柚皮素含量与chs的相对表达量存在较高正相关性(r=0.766,P0.05)。该研究为红花中黄酮类成分合成及调控机制研究提供理论依据,为研究红花品质差异形成的分子机制奠定基础。     

红花转录因子CtMYB1基因的克隆及原核表达

目的 从红花Carthamus tinctorius 花瓣中克隆转录因子基因CtMYB1,并进行序列分析和原核表达载体的构建。方法 根据红花转录组测序结果中得到的高表达的Unigene123933序列,利用RT-PCR和RACE技术从红花花瓣中扩增得到CtMYB1基因的全长cDNA序列,并进行生物信息学分析;以CtMYB1基因的全长cDNA序列为模板,PCR扩增得到CtMYB1基因的开放阅读框(ORF)序列,构建原核表达载体pEASY-E1-CtMYB1。转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达。结果 成功从红花中克隆1个MYB基因,命名为CtMYB1,GenBank登录号为KJ524853。CtMYB1基因全长893 bp,ORF为750 bp,编码249个氨基酸。同时,成功构建了该基因的原核表达载体。SDS-PAGE结果显示该蛋白的大小约30 000,与预测的蛋白相对分子质量一致。结论 成功克隆了CtMYB1基因,构建了原核表达载体,初步证明该基因在大肠杆菌中成功表达。     

HPLC-DAD同时测定红花中4种亚精胺成分

采用高效液相色谱(HPLC)的方法,以Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5μm)为色谱分离柱,流动相为47%甲醇/水等度洗脱,洗脱流速为1.0 m L·min-1,柱温30℃,检测波长为270,280,290,300 nm多波长检测的色谱条件同时测定红花中4种亚精胺成分N1,N5,N10-(Z)-tri-p-coumaroylspermidine(1),N1,N5-(Z)-N10-(E)-tri-p-coumaroylspermidine(2),N1(E)-N5-(Z)-N10-(E)-tri-p-coumaroylspermidine(3),和N1,N5,N10-(E)-tri-p-coumaroyl-spermidine(4)的含量,进样体积为10μL。各成分之间分离度良好,4种亚精胺成分的质量浓度分别在0.002 1~0.041 6(r=0.999 5),0.002 6~0.051 2(r=0.999 7),0.002 7~0.054 0(r=0.999 8),0.005 0~0.100 4(r=0.999 8)g·L~(-1)内与峰面积呈良好的线性关系,加样回收率为98.61%~100.9%,RSD为2.3%~3.0%。表明所建立的方法快速简便、具有较好的重复性和稳定性,可用于红花中4种亚精胺成分的含量测定。     

红花种子不同发育时期内参基因表达稳定性分析

目的通过qRT-PCR分析对比红花开花后不同发育时期的种子中内参基因的表达稳定性,筛选出红花种子成熟过程中最稳定的内参基因。方法应用实时荧光定量PCR技术,分析6个传统内参基因ACT、EF1α、GAPDH、UBI、TUA、TUB在红花种子不同发育时期的mRNA表达差异情况;利用GeNorm和Normfinder软件评价上述内参基因在红花开花后不同发育阶段的种子中的表达稳定性。结果荧光定量及GeNorm软件分析结果显示,6种内参基因的表达性各异,但表达最为稳定的内参基因是EF1α,表达最稳定的内参组合是EF1α和TUB。为了数据的真实可靠又选用了Normfinder软件分析,结果显示UBI基因表达不太稳定,EF1α、ACT、TUB、TUA和GAPDH内参的表达稳定性都小于0.15,相对比较稳定。结论为红花开花后不同发育时期种子的荧光定量PCR分析提供了详尽的内参基因参考。     

红花光调控信号途径关键基因CtHY5的克隆及表达分析

目的 以药用植物红花Carthamus tinctorius为研究对象,克隆光信号途径关键转录因子HY5基因,并对其进行生物信息学和表达模式分析,为红花HY5基因的功能研究提供参考。方法 以红花转录数据为参考,设计引物,采用PCR扩增方法从红花中克隆得到HY5的全长cDNA和DNA序列。运用生物信息学方法对该基因进行分析,预测编码蛋白的结构与功能,并通过荧光定量PCR方法检测CtHY5基因在红花不同组织及花发育不同时期的表达情况。结果 CtHY5基因的cDNA全长为462 bp,编码153个氨基酸,DNA全长为1941 bp,包含4个外显子和3个内含子。生物信息学分析表明,CtHY5为亲水性蛋白,定位于细胞核中。系统进化树及模体结构分析结果表明CtHY5与来自菊科的刺菜蓟、黄花蒿、薇甘菊、向日葵、莴苣中的HY5进化关系较近。定量分析表明,在白色红花和红色红花中,CtHY5基因均在花中表达量最高,其次为茎和苞片,在根中表达量最低。此外,除了根外,CtHY5基因在白色红花各组织中的表达量要明显高于红色红花。结论 首次从红花中克隆得到了光信号途径关键转录因子CtHY5基因,并研究了该基因在不同花色红花品系中的表达模式,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。