采用DOE试验方法优化重组人干扰素α2a纯化工艺

目的 采用DOE试验方法对重组人干扰素α2a纯化工艺参数进行优化,并寻找各参数的操作空间,为实际的产品生产提供指导.方法 利用DOE中的中心符合表面设计(CCF)模型,设置两个响应值目标蛋白纯度和得率,对重组人干扰素α2a纯化工艺的疏水层析精纯进行优化并找出操作空间.选取两个工艺参数,即洗脱液B的(NH4)2SO4浓度(0.60M·L-1~0.70M·L-1)和洗脱液C的(NH4)2SO4浓度(0.30M·L-1~0.40M·L-1).结果 从模型的线性、正确性、有效性和重复性判断,所建立的模型拟合度高,可较为准确的预测实验结果.其中,洗脱液B的(NH4)2SO4浓度、洗脱液C的(NH4)2SO4浓度以及各自的平方对响应值有显著影响.同时,利用sweet spot找出关键层析步骤的操作空间.     

SP-sephadex C25离子交换层析纯化细胞色素C的工艺研究

目的 :研究SP sephadexC2 5离子交换层析纯化细胞色素C的工艺。 方法 :用SP sephadexC2 5树脂取代AmberliteIRC 5 0树脂对细胞色素C进行纯化。结果 :SP sephadexC2 5离子交换纯化细胞色素C一次层析收率达 85 %以上 ,纯度达 98%左右。结论 :SP sephadexC2 5树脂用于细胞色素C的纯化 ,与用AmberliteIRC 5 0树脂相比 ,大大提高了层析得率和产品的纯度 ,提高了产品合格率。     

高质量重组人干扰素α2b的分离纯化研究

重组人干扰素2b作为一种上市药物,被广泛用于治疗慢性丙型肝炎、慢性乙型肝炎、恶性黑色素瘤等多种疾病的治疗,产生了良好的临床疗效和经济效益。目前国内厂家生产的重组人干扰素以大肠杆菌基因工程表达为主。大肠杆菌表达的人干扰素2b以包涵体的形式表达,包涵体产物需通过变性复性以及其后的纯化才能获得生物活性。干扰素复性得率低,纯化时需要经过四步色谱处理,工艺繁琐,成本高,而且无法去除未完全复性的中间产物,从而影响产品质量和疗效。建立可溶性重组人干扰素α2b的高密度发酵工艺,并在此基础上,建立其高效、快速和稳定的纯化工艺。通过发酵工艺优化获得可溶性重组人干扰素α2b的高密度发酵,收集菌体后,通过高压破菌、硫酸铵分级沉淀、phenyl Sepharose Fast Flow疏水层析、Q Sepharose Fast Flow阴离子交换层析、SP Sepharose Fast Flow阳离子交换层析、Octyl Sepharose Fast Flow疏水层析进行分离纯化,并对纯化产物进行生物活性分析。重组人干扰素α2b工程菌的发酵密度A₆₀₀达到38.5,可溶性重组人干扰素α2b占...     

用微孔玻璃层析和乙醇分离的纯化方法制备人白细胞干扰素

制备人白细胞干扰素包括(1)从人血中分离得白细胞组分;(2)用氯化铵水溶液进行溶血以去除红细胞;(3)在含人血清的营养培养基中悬浮白细胞,使其浓度达500万～1500万/ml;(4)用干扰素预处理悬液;(5)用诱导剂处理悬液;(6)从细胞中分离得到的干扰素溶液;(7)用一定直径的微孔玻璃层析,乙醇分离和最适膜分离的结合方法纯化干扰素溶液.     

重组人干扰素α-2b原液的制备

目的 优化重组人干扰素α-2b原液的发酵纯化方法,降低生产成本,提高产品的安全性。方法 构建重组大肠杆菌,通过逐级扩大培养、发酵、纯化,收集菌体;菌体裂解后,进行变性、复性,通过不同的纯化方法,得到符合质量标准的重组人干扰素α-2b原液;通过对各步工艺的考察,优化重组人干扰素α-2b的发酵、纯化方法。结果 制得的重组人干扰素α-2b菌种表达量高,原液纯度可达95.0 %以上,生物学比活性高于1×108 U·mg^-1,符合《中华人民共和国药典》的质量要求,安全性强。结论 此法可应用于重组人干扰素α-2b原液的生产。     

HPLC法在干扰素α-2b的纯化和蛋白纯度测定中的应用研究

目的:为开发干扰素α-2b新剂型提供纯化和质控的技术指标.方法:用反相离子对色谱法对千扰素α-2b的粗品进行分离纯化;用分子排阻色谱法测定其蛋白纯度.结果:反相离子对色谱法可使纯度为85%粗品提高到95%以上:分子排阻色谱法可通过峰面积比,快速、客观地确定表达蛋白的百分比,对主峰、次峰的分离度大于1.5.结论:反相离子对HPLC法可作为干扰素α-2b的纯化方法;分子排阻色谱法是鉴定基因工程干扰素的不可缺少的指标之一,它可对提纯工艺起到有效的监控作用.     

内皮抑素融合蛋白的发酵与纯化

目的对内皮抑素融合蛋白的发酵和纯化工艺进行研究。方法利用 5L发酵罐 ,设定了溶氧、搅拌速度、补液量、补液时机和补液速度等发酵条件 ;用硫酸铵分级沉淀、凝胶过滤、离子交换色谱等方法纯化目的蛋白质。结果工程菌目的蛋白质表达量占菌体总蛋白质的 2 0 % ;纯化后纯度达 95 %以上。结论研讨了大肠杆菌高效表达内皮抑素融合蛋白发酵及纯化工艺 ,为实际应用奠定了基础。     

重组人突变型TNF-α在大肠杆菌中的诱导表达及高效纯化

建立重组人突变型ＴＮＦ－α的纯化工艺,获得ＴＮＦ－α纯品,为下游规模生产打基础。方法：诱导表达重组 ＴＮＦ－α突变体蛋白,用 ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、ＣＭ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ两步层析结合小范围线性梯度洗脱法纯化。结果：所得重组蛋白的纯度达９８％以上,比活达１．７×１０９ｕ／ｍｇ蛋白,无热原。结论：此纯化方法可对重组ＴＮＦ－α突变体蛋白进行高效快速纯化,易于实现规模化生产。     

重组人干扰素α-2b两步柱色谱分离纯化工艺研究

通过改进柱色谱条件,两步柱色谱分离纯化重组人干扰素α-2b,简化了工艺,缩短了生产流程,纯化倍率达到5.6倍,纯度98%.蛋白比活性1.43×108IU/mg蛋白,活性回收率58%.     

重组人促红细胞生成素生产工艺研究

采用Bellco公司转瓶机,用无血清培养基培养分泌RhEPO的工程细胞株CHOEPO-2.所收集的上清液预处理后经染料亲和层析-离子交换层析-分子筛层析纯化后,所得EPO纯度达99%以上,比活性大于1.5×105IU/mg,整个纯化全过程的EPO体内活性回收率为45%.所纯化的EPO分子量为37kD.分析表明,所纯化的EPO可与抗EPO的单克隆抗体特异性结合.该工艺纯化路线简单,重复性好,生产成本低,产品活性高,适合大规模生产重组人促红细胞生成素.     

重组人IL-2的纯化和初步质量监测

从重组IL-2菌株发酵后包含体中,采用增溶分离、分子筛层析、超滤和反相HPLC等工艺,纯化出具备临床质量要求的IL-2.全套工艺在10d内完成,每周期可获IL-2达200mg(8×10~8CU),产品比活为4×1O~6CU/mg蛋白,回收率为37.5%,产品纯度为99%.产品经家兔热原试验、小鼠安全试验和内毒素测定符合临床要求.根据本实验室规模每周期具备放大5～10倍的能力.     

基于中国仓鼠卵巢细胞表达的Fc融合蛋白制备工艺的优化

目的 优化基于中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞表达的Fc融合蛋白制备工艺.方法 对于上游细胞培养工艺,先在摇瓶中分别对培养基配比和流加培养方案进行优化,再将优化工艺放大到生物反应器规模并确认其可行性.对于下游蛋白纯化工艺,分别对A蛋白亲和层析的洗脱条件和阴离子交换层析的平衡条件进行优化.结果 对于上游细胞培养工艺,以种子培养基∶基础培养基(CD OptiCHO)∶基础培养基(CDM4Mab)为2∶1∶1的配比配制培养基,并以3、6和9d补料的流加培养方案进行细胞培养,可获得理想的细胞密度和活率,且成本较低.对于下游蛋白纯化工艺,以pH3.3的洗脱液进行A蛋白亲和层析纯化时,Fc融合蛋白的回收率为94.7％,纯度为98.64％;以pH5.0～pH5.5的平衡液进行阴离子交换层析纯化时,Fc融合蛋白的回收率达到98％以上、纯度达到99％.结论 基于CHO细胞表达的Fc融合蛋白制备工艺的上游细胞培养和下游蛋白纯化工艺得到成功优化,这为此类抗体药物制备工艺的优化提供了思路.     

重组毕赤酵母生产干扰素α-2b的研究

目的为探求生产干扰素-α2b的方法。方法采用重组毕赤酵母发酵,纯化生产干扰素-α2b。结果重组毕赤酵母生产干扰素α-2b,产量高达70mg/L(发酵液),目标蛋白干扰素α-2b不需要复性,在纯化过程中,不需要价格昂贵的单抗柱,即可从发酵液中提取获得纯度达96%以上的目标蛋白,蛋白质比活性大于1.0×109IU/mg。结论PichiaPastoris高效酵母分泌表达系统取代大肠杆菌表达系统生产干扰素-α2b。结论采用重组毕赤酵母生产干扰素-α2b,能提高蛋白质比活性,简化生产工艺,降低生产成本。     

一种减少包涵体变复性过程中产生的蛋白多聚体的方法

目的  优化蛋白制备工艺,减少原核表达包涵体变复性产生的多聚体。方法  根据原始工艺进行菌体培养、破壁以及包涵体收集和变复性。然后在包涵体复性液中直接添加硫酸铵固体（优化工艺）。离心去沉淀,收集上清液制备蛋白粗制品。对原始工艺和优化工艺制备的蛋白粗制品进行凝胶蛋白结合量、蛋白回收率、纯化蛋白量以及细胞杀伤活性比较。结果  与原始工艺相比,增加30%饱和度硫酸铵沉淀步骤的优化工艺可使1 ml层析凝胶的蛋白结合量由1 mg提高至20 mg,单位体积发酵液蛋白回收率由10%增加至90%,400 ml发酵液所得的纯化蛋白量由3 mg提升至15 mg。蛋白粗制品的平均半数抑制浓度从0.077 99 µg/ml降至0.045 69 µg/ml。结论  在包涵体复性液中添加硫酸铵可有效减少多聚体。     

单克隆抗体亲和层析法纯化Namalva细胞干扰素

采用自行研制的α干扰素单克隆抗体亲和层析胶3D9进行了Namalva细胞干扰素纯化的初步研究.结果表明α干扰素纯化活性回收率达96%,比活性达1×108IU/mg,一次亲和层析纯化倍数4.4×104.电泳及Westem blot结果显示相对分子质量在2.1×103.     

静注人免疫球蛋白层析纯化条件的优化

目的  利用响应面法对Fractogel EMD TMAE介质在静注人免疫球蛋白层析纯化中的应用条件进行优化,确立最佳层析参数。方法  采用双因素三水平响应面法设计层析参数pH值和电导率,用双缩脲法和高效液相色谱法分别测定蛋白浓度和分子大小分布,以蛋白回收率、单体＋二聚体含量评价纯化效果,获得最优层析参数并进行验证。结果  优化的层析纯化平衡和上样条件为pH 5.40,电导率1.05 mS/cm。在该条件下以血浆组分Ⅱ为原料,层析后蛋白回收率为（96.6±3.1）%,IgG单体＋二聚体比例为（99.98±0.02）%,IgA含量为（2.6±1.1）mg/L,IgM含量为（4.5±1.4）mg/L。结论  采用经响应面法优化后的Fractogel EMD TMAE层析条件,可用于纯化血浆组分Ⅱ制备静注人免疫球蛋白制品。     

重组人干扰素α-2b原液的制备

目的优化重组人干扰素α-2b原液的发酵纯化方法,降低生产成本,提高产品的安全性。方法构建重组大肠杆菌,通过逐级扩大培养、发酵、纯化,收集菌体;菌体裂解后,进行变性、复性,通过不同的纯化方法,得到符合质量标准的重组人干扰素α-2b原液;通过对各步工艺的考察,优化重组人干扰素α-2b的发酵、纯化方法。结果制得的重组人干扰素α-2b菌种表达量高,原液纯度可达95.0%以上,生物学比活性高于1×108U.mg-1,符合《中华人民共和国药典》的质量要求,安全性强。结论此法可应用于重组人干扰素α-2b原液的生产。     

重组人源白介素-1β发酵条件的优化及其产品的纯化

目的初步建立重组人源IL-1β巴斯德毕赤酵母的培养体系;进一步优化大规模培养重组人源IL-1β巴斯德毕赤酵母的条件;探讨大规模纯化重组人源IL-1β巴斯德毕赤酵母表达产物的条件;鉴定酵母表达产物及纯化样品。方法在菌体湿重达190g.L-1左右时开始甲醇诱导表达;选用了SP Sepharose XL阳离子交换层析和反相疏水柱层析进行纯化。结果在pH4.5的含0.5%蛋白胨的FM21培养基中发酵时,放罐时间在30h较为适宜;经过纯化蛋白纯度即可达95%以上。结论最终经过鉴定,表达和纯化的样品就是我们想要得到的IL-1β。     

纯化的甲型肝炎灭活疫苗的纯度评价

在培养基灌流生物反应器中用 MRC- 5细胞培养甲型肝炎病毒 (HAV) ,然后用层析和沉淀法进行病毒纯化 ,最后 ,用甲醛灭活病毒并将其吸附于氢氧化铝佐剂上 ,制成 HAV疫苗 (VAQTATM)。　　经十二烷基硫酸钠 -聚丙烯酰胺凝胶电泳后 ,用考马斯亮蓝或银染色及光密度测定法分析纯化的 HAV,发现 95 %以上的蛋白是病毒核壳蛋白 ,形成与 VP0、VP1、VP2和VP3相对应的 4条带 ,未发现其他杂带。用抗 MRC- 5抗体进行的蛋白印迹法也未测到来源于宿主细胞的成分。高效分子筛层析、免疫印迹等方法均未检测出纯化过程中的残留物。用高 p H阴离子交…     

重组人β淀粉样蛋白1-42小规模发酵及小量纯化工艺的摸索

目的研究重组人β淀粉样蛋白1-42(rh Aβ1-42)在5 L摇瓶中的高密度发酵实验,以及小量纯化工艺的方法。方法分别从甲醇浓度、p H、诱导时间等方面对毕赤酵母重组菌株产生rh Aβ1-42的发酵过程进行了优化;通过硫酸铵沉淀目的蛋白、透析、脱盐和阴离子交换层析,对rh Aβ1-42小量精确的纯化方法进行了研究。结果确定rh Aβ1-42在毕赤酵母中分泌表达的最佳条件为:在p H 6.0的条件下,以0.5%甲醇诱导72 h,经过硫酸铵沉淀目的蛋白、透析、脱盐和阴离子交换层析,rh Aβ1-42纯度可达94%以上。结论确定了rh Aβ1-42在毕赤酵母中分泌表达的最佳条件,建立了小量纯化rh Aβ1-42的新方法。