低氧环境对骨髓间充质干细胞诱导分化的影响☆

目的：目前公认肾上腺素能β1受体含量和环磷酸腺苷水平在心肌细胞处于低氧状态时会发生改变，然而诱导分化的骨髓间充质干细胞经慢性低氧作用后能否表现与心肌细胞相同的特性还未知，故检测其β1受体mRNA表达及第二信使环磷酸腺苷活性变化。 方法：实验于2006-02/2007-04在华中科技大学同济医学院附属协和医院心研所实验室完成。①动物：清洁级成年昆明小鼠10只，新生1 d龄昆明小鼠40只，均购自华中科技大学同济医学院实验动物中心，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。②实验方法：成年小鼠麻醉后于肱骨及胫骨骨折处吸取适量骨髓，加入含15%胎牛血清、100 U/mL青霉素G、80 U/mL链霉素的IMDM培养基，贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞。将新生鼠处死迅速取心脏，用Ⅱ型胶原酶消化离心，将生长较好的第1、2代心肌细胞制成1×109 L-1细胞裂解液，体外模拟心肌微环境诱导分化骨髓间充质干细胞。设立2组，空白对照组仅加入IMDM培养基，实验组加入IMDM培养基和心肌细胞裂解液，隔天换液，继续培养1周后又分为4个亚组：常氧组，常氧不加药物作用72 h；低氧组，用1%氧浓度作用72 h；异丙肾上腺素组，用1×10-5 mmol/L异丙肾上腺素作用72 h；低氧+异丙肾上腺素组，用1%低氧和1×10-5 mmol/L异丙肾上腺素联合作用72 h。③实验评估：RT-PCR法检测骨髓间充质干细胞β1受体mRNA水平，放射免疫法测定骨髓间充质干细胞环磷酸腺苷的活性。 结果：①骨髓间充质干细胞β1受体mRNA水平的表达：空白对照组不表达β1受体mRNA。作用72ｈ后，常氧组表达β1受体mRNA，低氧组β1受体mRNA水平升高100%，异丙肾上腺素组、低氧+异丙肾上腺素组β1受体mRNA水平均降低40%。②骨髓间充质干细胞环磷酸腺苷活性检测：与常氧组比较，低氧组环磷酸腺苷活性无明显变化（P > 0.05）；异丙肾上腺素组环磷酸腺苷活性下降35%（P < 0.05）；低氧+异丙肾上腺素组与异丙肾上腺素组水平相当（P > 0.05）。 结论：①采用心肌细胞裂解液体外模拟心肌微环境诱导分化的骨髓间充质干细胞表达β1受体。②单纯低氧作用可明显升高骨髓间充质干细胞β1受体mRNA水平，环磷酸腺苷活性无变化。经异丙肾上腺素作用后，低氧环境无法显著改变β1受体mRNA水平和环磷酸腺苷活性。     

β2-肾上腺素能受体过表达后成年犬心肌细胞收缩功能的改变及机制

背景：在转基因小鼠、大鼠等小动物实验中发现，心肌细胞特异性过表达β -肾上腺素受体可以改善其收缩功能，但目前尚缺乏在大型哺乳动物进行的有关实验报道。 目的：探讨犬心肌细胞过表达β2-肾上腺素受体后心肌细胞收缩功能的改变及其可能机制。 方法：采用胶原酶消化法分离培养犬心肌细胞，用携带β2-肾上腺素受体目的基因的重组腺病毒转染心肌细胞。转染48 h后观察心肌细胞β2-肾上腺素受体蛋白表达及在基础状态和最大收缩状态下(以异丙肾上腺素10-6 mol/L刺激)心肌细胞cAMP水平及收缩功能的变化。 结果与结论：转染β2-肾上腺素受体的心肌细胞β2-肾上腺素受体蛋白表达及胞内cAMP水平明显增多(P < 0.05)，基础状态下收缩功能明显增强，但不改变最大收缩幅度百分比。说明β2-肾上腺素受体的过表达可能通过增加心肌细胞内cAMP水平改善心肌细胞的收缩功能。     

老龄心房颤动犬模型肺静脉肌袖细胞起搏电流在异丙肾上腺素作用下的变化*

背景：心房颤动是老年人常见的心律失常疾病,有研究表明肺静脉肌袖细胞起搏电流能增加快速心律失常特别是心房颤动发生的风险。 目的：观察异丙肾上腺素对老龄犬肺静脉肌袖细胞起搏电流的作用。 方法：选择14只老龄健康犬,7只快速起搏10周制备心房颤动模型,其余未经快速起搏处理的犬作对照。分离各组肺静脉肌袖细胞,利用全细胞膜片钳在电压钳模式下记录起搏电流。 结果与结论：在0.1~10.0 μmol/L的浓度范围内异丙肾上腺素均使细胞膜起搏电流电流升高,且作用呈现出浓度依赖性,半数有效量为1.7 μmol/L (95%可信区间为1.2~2.6 μmol/L)。房颤组肺静脉肌袖细胞给予1.0 μmol/L异丙肾上腺素时,起搏电流显著增加,在-120 mV的测试电位时,使其电流密度升高(P < 0.01)。1.0 μmol/L异丙肾上腺素使房颤组肺静脉肌袖细胞起搏电流的稳态激活曲线向正方向移动,使半激活电压下降,更接近静息电位,同时也使激活曲线斜率(P < 0.01)。结果证实,异丙肾上腺素可能通过升高肺静脉肌袖细胞起搏电流促进心房颤动的发生。     

阿仑磷酸钠对人成骨细胞增殖和护骨素/核因子κB受体活化因子配体mRNA表达的影响

背景：阿仑磷酸钠是新一代的二磷酸盐,属第2代骨质疏松药,临床上广泛用于治疗骨吸收增加类疾病。 目的：观察阿仑磷酸钠对人成骨细胞增殖和核因子κB受体活化因子配体(RANKL)及护骨素(OPG) mRNA表达的影响。 设计、时间及地点：单一样本观察,于2007-11/2008-03在重庆医科大学基础研究所完成。 材料：成骨细胞来源于手术中取得的松质骨骨块;阿仑磷酸钠为杭州默沙东制药有限公司生产,批号：06130。 方法：在含1×10-9,1×10-8,1×10-7,1×10-6,1×10-5,1×10-4 mol/L不同浓度的阿仑磷酸钠培养液中培养成骨细胞,以不加阿仑磷酸钠培养为对照。 主要观察指标：①成骨细胞观察。②以四甲基偶氮唑盐检测阿仑磷酸钠对成骨细胞的增殖的影响。③以半定量反转录-聚合酶链反应方法观察不同浓度阿仑磷酸钠对成骨细胞表达OPG/RANKL mRNA的影响。 结果：1×10-5,1×10-4 mol/L的阿仑磷酸钠抑制成骨细胞增殖,1×10-9~10-6 mol/L的阿仑磷酸钠促进成骨细胞增殖,其中1×10-8 mol/L的阿仑磷酸钠对成骨细胞的增殖作用最强。阿仑磷酸钠呈浓度依赖性降低RANKL mRNA表达,干预72 h,1×10-5 mol/L抑制作用最大(P < 0.01)。阿仑磷酸钠呈浓度依赖性增加护骨素 mRNA表达,干预72 h,1×10-6 mol/L增加作用最明显(P < 0.01),而1×10-5 mol/L时又减低。 结论：阿仑磷酸钠能使成骨细胞增殖,1×10-8 mol/L浓度增殖作用最强,其可能通过调节OPG/RANKL mRNA表达而影响骨代谢。     

不同浓度硝酸银负载珊瑚羟基磷灰石的细胞毒性实验***☆

背景：硝酸银负载珊瑚羟基磷灰石是一种具有抗菌性能的新型植骨材料,在国外已有大量的研究报道,但国内对其研究仅处于起步阶段。 目的：制备载银珊瑚羟基磷灰石人工骨材料并观察其对L929细胞的毒性特征。 设计、时间及地点：细胞学体外对比观察实验,于2008-10/11在解放军广州军区广州总医院中心实验室完成。 材料：将自制的珊瑚羟基磷灰石浸泡于1×10-2,1×10-3,5×10-4,1×10-4,5×10-5,1×10-5 mol/L硝酸银溶液中制得不同浓度的载银人工骨材料。按1.25 cm2材料表面积/1 mL培养基比例加入培养基,37 ℃下浸提24 h。 方法：将材料浸提培养基与L929细胞共培养48 h,运用MTT法测得细胞相对增殖度,用倒置相差显微镜观察细胞形态,结合中华人民共和国国家标准：GB/T16175-2008中的相关标准进行分析。 主要观察指标：L929细胞在不同材料上的增殖情况及细胞的形态学变化。 结果：MTT法检测结果表明硝酸银浓度≤5×10-5 mol/L时,材料对L929细胞生长无明显抑制作用;材料浸提液即使在高浸提比100%下,浸提产物也无细胞毒性作用。镜下观察发现5×10-5 mol/L组及1×10-5 mol/L组细胞形态正常,贴壁生长良好。 结论：低浓度的载银珊瑚羟基磷灰石对体外培养的L929细胞的增殖、生长无明显毒性作用。 关键词：珊瑚羟基磷灰石;细胞毒性;MTT比色法;抗感染骨替代材料;银离子     

维生素C体外诱导多能干细胞向心肌细胞的分化

背景：诱导多能干细胞治疗缺血性心脏病被认为是极具前景的方法，但目前仍未找到一种理想的诱导方式。 目的：观察维生素C作为诱导剂对多能干细胞体外分化为心肌细胞的影响。 方法：复苏小鼠诱导多能干细胞，传代培养后，采用直接悬浮培养法使小鼠诱导多能干细胞形成拟胚体，用含10-3，10-4，10-5，10-6 mol/L 4种不同浓度维生素C的分化培养基对其进行诱导分化，以不添加任何诱导剂作为对照组，观察各组出现搏动拟胚体的数量，计算分化比率。 结果与结论：维生素C诱导小鼠诱导多能干细胞分化为心肌细胞的最佳浓度为10-4 mol/L，有(57.00±3.20)%的拟胚体出现搏动，显著高于不添加任何诱导剂的对照组(5.13%±0.55)%(P < 0.01)。诱导而来的心肌细胞表达心肌特异性蛋白cTnT以及α-actin。提示最佳的维生素C诱导分化条件能够促进小鼠诱导多能干细胞向心肌细胞分化，提高其分化效率。     

异欧前胡素对大鼠成骨细胞增殖与分化的影响

背景：植物雌激素有防治绝经后妇女骨质疏松的作用已得到公认,其作用机制之一是促进了成骨细胞的增殖与分化。 目的：观察香豆素类植物雌激素异欧前胡素体外对大鼠成骨细胞增殖与分化的影响。 设计、时间及地点：对比观察实验,于2006-09/2007-12在河北医科大学药学院完成。 材料：出生24 h内SD大鼠,异欧前胡素为中国药品生物制品检定所产品。 方法：采用改良组织块法分离培养新生大鼠颅骨成骨细胞,将异欧前胡素以1×10-5~ 1×10-9 mol/L浓度加入细胞培养体系,以未加入药物为空白对照组。作用24,48,72 h后,以MTT法检测成骨细胞的增殖情况,以对硝基苯二钠基质动力学法测定细胞内碱性磷酸酶的活性,以改良Lowry法测总蛋白水平。 主要观察指标：成骨细胞的增殖率和碱性磷酸酶活性。 结果：大鼠成骨细胞在不同浓度异欧前胡素中培养24 h,未观察到促增殖作用。培养48 h后,开始出现促增殖作用增强,有效浓度为1×10-9~1×10-8 mol/L。培养72 h后,继续有促增殖作用,有效浓度为1×10-8~1×10-7mol/L。大鼠成骨细胞在不同浓度异欧前胡素存在下培养48 h,未观察到促分化作用,培养72 h后,开始出现促分化作用,有效浓度为1×10-6~1× 10-5 mol/L,其他浓度作用不明显。 结论：异欧前胡素体外能促进大鼠成骨细胞的增殖与分化。     

5-氮胞苷体外诱导大鼠骨髓基质干细胞向心肌样细胞的分化

背景：骨髓基质干细胞具有扩增迅速、分化潜能广泛等特点,因此建立骨髓基质干细胞的体外定向诱导模型有利于组织工程学研究。 目的：探讨应用5-氮胞苷体外诱导大鼠骨髓基质干细胞向心肌样细胞分化的可能性。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2005-06/2008-06在辽宁医学院附属第一医院中心实验室完成。 材料：SD大鼠20只,由辽宁医学院实验动物中心提供。5-氮胞苷为Sigma公司产品。 方法：大鼠麻醉后,分离股骨和胫骨,全骨髓法+贴壁法分离培养骨髓基质干细胞,待细胞生长融合至90%后传代扩增。取P3代骨髓基质干细胞,以2×104/孔密度接种于24孔培养板,分别加入5,10,15,20 μmol/L 5-氮胞苷诱导培养,同时设立不加诱导剂的空白对照,诱导24 h后更换为正常培养液继续培养至3周。 主要观察指标：细胞形态及生长曲线,诱导后细胞形态变化,诱导后细胞连接蛋白43和α-横纹肌肌动蛋白的表达。 结果：①培养的骨髓基质干细胞大多呈梭形,有时可见细胞融合,P3代细胞接种后第1,2天为静止生长期,从第3天开始进入对数生长期,第9天达高峰,以后进入平台期,第12天细胞数量开始减少。②5 μmol/L 5-氮胞苷诱导后,骨髓基质干细胞形态无明显变化;10 μmol/L 5-氮胞苷诱导后骨髓基质干细胞变长,宽大,并朝一个方向延伸,具有肌管形成细胞的形态特点;15 μmol/L 5-氮胞苷诱导后,24孔板周边区有少量细胞存活;20 μmol/L 5-氮胞苷诱导后细胞死亡。③经10 μmol/L 5-氮胞苷诱导3周后,骨髓基质干细胞胞浆内可见连接蛋白43和α-横纹肌肌动蛋白的表达;空白对照组均呈阴性表达。 结论：骨髓基质干细胞自身无法向心肌细胞方向转化,体外经5-氮胞苷诱导后具有向心肌细胞分化的潜能。5-氮胞苷浓度过低不能起到诱导分化作用,浓度过高则会造成细胞大量死亡,10 μmol/L为较适宜的诱导浓度。     

不同浓度5-氮胞苷体外诱导人脐带间充质干细胞向心肌样细胞的分化

背景：在体外将人脐带间充质干细胞诱导为心肌样细胞的5-氮胞苷合适浓度的研究较少,且无明确结论。 目的：对比不同浓度5-氮胞苷诱导人脐带间充质干细胞转化为心肌细胞的效果,以确定一种合适的诱导浓度。 方法：第2代人脐带间充质干细胞中分别加入浓度为2.5,5,10,20,40,80 μmol/L的5-氮胞苷,作用24 h后除去,继续培养4周。于诱导后第2周行免疫组化染色检测肌钙蛋白Ⅰ阳性细胞率。 结果与结论：5-氮胞苷诱导后7 d,细胞形态发生变化,细胞多紧密平行排列生长,细胞体积变大,梭形细胞比例下降,40,80 μmol/L组细胞形态变化明显。4周时,40,80 μmol/L组细胞的折光性减低,细胞活性减弱,继续出现死亡的细胞。诱导后2周,2.5 μmol/L组肌钙蛋白Ⅰ染色为阴性,10,20,40,80 μmol/L组细胞肌钙蛋白Ⅰ阳性率均明显高于5 μmol/L组(P < 0.05)。提示5-氮胞苷可诱导人脐带间充质干细胞向心肌样细胞转化,10 μmol/L是较佳的诱导浓度。     

L6细胞胰岛素抵抗的骨骼肌细胞模型

背景：在胰岛素抵抗的细胞模型中,以游离脂肪酸诱导3T3-L1脂肪细胞和高胰岛素诱导的HepG2肝癌细胞最为常见,对分布最为广泛靶组织骨骼肌的胰岛素抵抗模型报道较少。 目的：拟使用L6细胞株建立胰岛素抵抗的骨骼肌细胞模型。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2007-06/2008-05在辽宁医学院生物化学与分子生物学教研室完成。 材料：L6细胞株由中国协和医科大学细胞中心提供。α-MEM培养基为美国Gibco公司产品。 方法：复苏后的L6细胞置于α-MEM培养基中诱导培养14 d,以考马斯亮蓝染色观察肌管出现来确定L6成肌细胞株分化完成。将分化后的细胞建立胰岛素抵抗模型,按1×106/孔接种于24孔板内,用含体积分数为0.02胎牛血清的α-MEM培养,以L6细胞贴满24孔板的板底为宜。换液后,向各孔内分别加入含体积分数为0.02牛血清白蛋白的α-MEM无血清培养基饥饿培养5 h。设立2组,实验组的板孔内加入含1×10-7 mol/L胰岛素的HEPES缓冲液（136 mmol/L NaCl,4.7 mmol/L KCl,1.25 mmol/L MgSO4,1.2 mmol/L CaCl2,0.2%牛血清白蛋白,20 mmol/L HEPES,pH 7.4）孵育1 h;对照组的板孔内加入不含胰岛素的HEPES缓冲液孵育1 h。弃上清后用HBS缓冲液冲洗,每孔内分别加入含0.1 mol/L葡萄糖的HBS缓冲液100 μL,孵育10 min后取出置于冰板上快速回收上清。 主要观察指标：考马斯亮蓝染色观察L6细胞出现肌管结构情况,葡萄糖氧化酶法检测上清中葡萄糖浓度。 结果：诱导前L6细胞未见肌性结构出现,诱导分化后L6细胞内出现肌管结构。使用α-MEM无血清培养基饥饿培养1,3 h,两组上清中葡萄糖浓度基本相似（P > 0.05）;使用α-MEM无血清培养基饥饿培养5 h后,实验组上清中葡萄糖浓度明显高于对照组（P < 0.05）。 结论：诱导分化成肌后的L6骨骼肌细胞经α-MEM无血清培养基饥饿培养5 h,在胰岛素浓度为1×10-7mol/L的刺激下可形成胰岛素抵抗的骨骼肌细胞模型。     

人肝癌细胞胰岛素抵抗模型建立及有效中药成分的筛选

背景：目前,复方中药、单味中药在体内降糖作用及其降糖机制研究较多,但体外尤其是中药单体成分对胰岛素抵抗细胞有何影响尚不清楚。 目的：体外建立人肝癌细胞(HepG2)胰岛素抵抗模型,并初步筛选可有效改善胰岛素抵抗的中药有效成分。 方法：用不同浓度的胰岛素对HepG2细胞进行不同时间的诱导,通过MTT法对细胞活性评价及葡萄糖氧化酶法对HepG2细胞葡萄糖消耗量测定,明确建立稳定的HepG2胰岛素抵抗模型的胰岛素诱导浓度及诱导时间。模型建立后,应用不同浓度的齐墩果酸、药根碱、阿魏酸、大黄酸、马钱苷、葛根素、大豆苷分别作用于胰岛素抵抗细胞24 h,用葡萄糖氧化酶法分别观察不同浓度的上述中药成分对胰岛素抵抗模型HepG2细胞葡萄糖消耗的影响,MTT法对各组细胞活性进行评价。 结果与结论：HepG2细胞在10-6 mol/L浓度的胰岛素中作用24 h,葡萄糖消耗量明显减少(P < 0.01),说明实验成功诱导出稳定人肝癌细胞胰岛素抵抗模型。10-5 mol/L浓度胰岛素组的胰岛素抵抗更明显(P < 0.01)。各时间点10-5 mol/L浓度胰岛素作用的细胞成活率逐渐降低,死亡细胞增多(P < 0.05)。齐墩果酸、药根碱、阿魏酸、大黄酸、马钱苷、葛根素、大豆苷均有改善细胞胰岛素抵抗的作用。其中,质量浓度2×10-1 g/L药根碱、大黄酸、葛根素和齐墩果酸,2×10-5 g/L马钱苷和阿魏酸对改善人肝癌细胞胰岛素抵抗效果较好(P < 0.01)。     

人巨细胞病毒感染对脐血红系祖细胞发育过程中Hoxb2，Hoxb4基因表达的影响

人巨细胞病毒感染可损害造血系统，甚至造成骨髓衰竭。人巨细胞病毒感染抑制红系祖细胞增殖和分化，是否与受染红系祖细胞增殖的基因异常表达有关？ 目的：观察人巨细胞病毒和/或全反式维甲酸对人脐血造血干细胞向红系祖细胞定向增殖分化过程进行干预后Hoxb2、Hoxb4基因表达的变化。 方法：取12例正常足月顺产新生儿断脐后的胎盘段脐血，采用造血干细胞体外培养技术及实时荧光定量聚合酶链反应方法，以人巨细胞病毒-AD169和(或)6×10-8 mol/L的全反式维甲酸持续干预人脐血造血干细胞向红系定向增殖分化过程，检测空白组、全反式维甲酸组、人巨细胞病毒组、全反式维甲酸+人巨细胞病毒组在培养第3，7，10天红系祖细胞Hoxb2、Hoxb4基因的表达情况。 结果与结论：各组Hoxb2、Hoxb4基因均在增殖分化的第3天已有表达，第7天表达明显增加，第10天表达最强烈。与空白组相比，人巨细胞病毒组明显下降；与人巨细胞病毒组相比，全反式维甲酸+人巨细胞病毒组的Hoxb2、Hoxb4基因表达量明显增加(P < 0.05)。提示人巨细胞病毒可能通过调控Hoxb2、Hoxb4基因异常表达而引起造血功能异常；Hoxb2、Hoxb4均与红系造血有相关性；6×10-8 mol/L全反式维甲酸能显著上调正常红系祖细胞Hoxb2、Hoxb4基因的表达，也能上调经人巨细胞病毒感染的红系祖细胞Hoxb2、Hoxb4基因的表达。     

Effects of glutamate receptor antagonists on posthypxic myoclonus in rats

Male Sprague-Dawley rats developed posthypoxic myoclonus following 10-min cardiac arrest and resuscitation. In current studies, roles of N-methyl-d-asparate (NMDA), non-NMDA (a-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionate, AMPA, and kainate), and metabotropic glutamate receptors in the pathophysiology of posthypoxic myoclonus were investigated. Treatments with the competitive or noncompetitive NMDA receptor antagonist, D(−)-2-amino-5-phosphonopentanoic acid (D[−]-AP-5) (ED₅₀: 12.5 mg/kg, IP) or MK-801 maleate (ED₅₀: 0.034 mg/kg, IP), and competitive or noncompetitive non-NMDA (AMPA/kainate) receptor antagonist, 6,7-dinitroquinoxaline-2,3-dione (DNQX) (ED₅₀: 9.25 nM/5 μl, ICV) or 1-(4-ami - nophenyl) - 4 - methyl -7, 8 -methylenedioxy -5H -2, 3-benzodiazepine hydrochloride (GYKI 52466) (ED₅₀: 0.67 mg/kg, IP), significantly decreased myoclonus episodes in rats. On the other hand, treatment with the metabotropic glutamate receptor antagonist, L(+)-2-amino-3-phosphonopropionic acid (L[+]-AP-3) (50 or 500 nM/5 μl, ICV), exerted no significant effects on myoclonus scores in posthypoxic rats. These results indicate that activation of NMDA and non-NMDA receptors receptors may mediate posthypoxic myoclonus in rats, whereas, involvement of metabotropic glutamate receptors needs to be studied further.     

不同大剂量环磷酰胺联合移植或不移植自体外周造血干细胞治疗重型系统性红斑狼疮23例

选择2004-10/2009-01桂林医学院附属医院风湿免疫科住院的23例重型系统性红斑狼疮患者,男3例,女20例,中位年龄(28±11)岁。分为4组：环磷酰胺10 mg/(kg•d)组12例,环磷酰胺20 mg/(kg•d)组5例,环磷酰胺30 mg/(kg•d)组4例,环磷酰胺40 mg/(kg•d)组2例。对每组患者实施不同预处理剂量的环磷酰胺,×3 d,在预处理前均采集自体外周血造血干细胞,保存细胞数为(1.7~3.8)×108/kg。所有受试者在任何时间点若白细胞低于0.5×109 L-1,血小板低于10×109 L-1即进行干细胞颈内静脉移植,回输细胞量为(2.1~3.4)×108/kg。结果显示：环磷酰胺10 mg/(kg•d)组9例血小板和白细胞无下降,3例血小板和白细胞第7~9天下降,但能自行恢复。环磷酰胺20 mg/(kg•d)组1例血小板和白细胞无下降,4例血小板和白细胞第5~9天下降,但能自行恢复,均无需自体外周造血干细胞移植支持。环磷酰胺30 mg/(kg•d)组4例血小板和白细胞第3~7天下降,其中1例于第5天回输干细胞,白细胞在移植后10,14 d 最低值分别为2.47× 109 L-1,18.8×109 L-1;移植后30 d血小板为134×109 L-1。环磷酰胺40 mg/(kg•d)组2例血小板和白细胞第3,5天下降,其中1例于第4天回输干细胞,白细胞在移植后10,14 d最低值分别为1.67×109 L-1,9.8×109 L-1;移植后30 d血小板为215×109 L-1。1例于第6天回输自体外周造血干细胞,白细胞在移植后10,14 d最低值分别为2.18×109 L-1,16.5×109 L-1;移植后30 d血小板为96×109 L-1。所有移植病例均无移植物抗宿主病、肝静脉闭塞病、出血性膀胱炎和感染的发生。与环磷酰胺10 mg/(kg•d)组比较,环磷酰胺20,30,40 mg/(kg•d)组完全的临床缓解率明显升高。提示以自体外周血干细胞移植为后盾,采用移植或不移植干细胞的方法,将很可能使重型系统性红斑狼疮达到长期的完全临床缓解。     

Inhibition by CCK of ascending contraction elicited by mucosal stimulation in the duodenum of the rat

CCK released by intraluminal stimuli modifies duodenal activity contributing to a decrease in gastric emptying. However, the neural mechanisms by which CCK controls motility are not well known. The aim of this study was to investigate the interaction between CCK and the enteric nervous system through the study of the effects of CCK‐8 on ascending excitation. Anaesthetized Sprague‐Dawley rats were prepared with a strain‐gauge sutured to the duodenum wall. An electrode holder was placed in the duodenum lumen to elicit ascending contraction. Electrical field stimulation of the duodenal mucosa (4 Hz, 0.6 ms, 30 V) induced an ascending excitation which was blocked by hexamethonium (10 mg kg^–1; n=5) and atropine (0.3 mg kg^–1; n=5), but enlarged by L ‐NNA (10^–5 mol kg^–1; n=5). CCK‐8 (3 × 10^–9 mol kg^–1 10 min^–1) blocked ascending excitation and an inhibition of the induced phasic activity was observed instead (n=18). Individually, none of the CCK receptor antagonists (L‐364 718 and L‐365 260) (3 × 10^–7 mol kg^–1; n=6 each) blocked the inhibition of ascending excitation induced by CCK‐8. However, simultaneous infusion of both antagonists abolished CCK‐8 effect on electrical stimulation (n=5). Similarly, none of the CCK‐8 agonists (A‐71623, A‐71378, gastrin) modified the ascending excitation. In contrast, the simultaneous infusion of A‐71623 and CCK‐4 (n=4) induced an effect similar to CCK‐8. In conclusion, CCK‐8 blocked ascending contraction elicited by electrical field stimulation of duodenal mucosa by means of simultaneous activation of CCK‐A and CCK‐B receptors.     

Mechanism of butyrate-induced hyperpolarization of cultured rat myenteric neurones

Short-chain fatty acids produced by the bacterial fermentation of carbohydrates are present in high concentrations within the colonic lumen and have been shown to alter the excitability of enteric neurones. The present study was designed to investigate the mechanisms of butyrate-induced changes in membrane potential of myenteric neurones. Myenteric neurones from 4-10-day-old rats were isolated from the small and large intestine by an enzymatic digestion with collagenase and kept in culture. Membrane potential was measured with the whole-cell patch-clamp technique and the intracellular Ca2+ concentration was measured with the fura-2 method. The short-chain fatty acid butyrate (10-100 mmol L(-1)) induced a reversible and concentration-dependent hyperpolarization of the membrane with a half-maximal effect at 30 mmol L(-1). The hyperpolarization evoked by butyrate (50 mmol L(-1)) was strongly inhibited by charybdotoxin (10(-7) mol L(-1)), a specific blocker of Ca2+ -dependent K+ channels. The butyrate-induced hyperpolarization was resistant against blockade of phospholipase C by U-73122 (10(-5) mol L(-1)), and resistant against inclusion of heparin (6 x 10(-6) mol L(-1)), an inositol-1,4,5-trisphosphate receptor antagonist, in the patch-pipette. In contrast, ruthenium red (3 x 10(-5) mol L(-1)), an inhibitor of ryanodine receptors, significantly reduced both the hyperpolarization of the membrane as well as the increase in the intracellular Ca2+ concentration evoked by butyrate. Even in neurones permeabilized with saponin (10 mg L(-1)), butyrate was able to stimulate a release of stored intracellular Ca2+ suggesting a direct action of the short-chain fatty acid at the stores without mediation of a soluble intracellular second messenger.     

Effect of isoflurane on the beta-adrenergic and endothelium-dependent relaxation of pig cerebral microvessels after cardiopulmonary bypass.

We examined the direct vasomotor effect of isoflurane as well as its effect on endothelium-dependent and beta-adrenergic vasodilation of cerebral microcirculation following either normothermic cardiopulmonary bypass (CPB) or profoundly hypothermic CPB with circulatory arrest. Pigs were placed on CPB; the systemic temperature was either maintained at 37 degrees C or lowered to 15 degrees C with 60 minutes of circulatory arrest. After 2 hours of CPB, the animals were separated from CPB; 15 minutes later the brain was quickly harvested in cold Krebs solution. Control animals were not instrumented and their brains were similarly harvested. Arteries of approximately 100 mum were dissected and changes in diameter monitored by in vitro videomicroscopy. Following preconstriction with the thromboxane analogue U46619 1 mumol/L, percent relaxation to the endothelium-dependent dilator adenosine diphosphate (ADP) 10(-9) to 10(-4) mol/L, the endothelium-independent dilator sodium nitroprusside (SNP) 10(-9) to 10(-4) mol/L, or the beta-adrenergic agonist isoproterenol 10(-12) to 10(-4) mol/L was measured either in the presence or absence of isoflurane 2%. Additionally, with or without preconstriction with U46619 1 mumol/L, vessel diameter changes were monitored with increasing concentrations of isoflurane 0-3%. Dose-response curves were compared by two-way analysis of variance. Vasodilation to ADP or isoproterenol, but not SNP, was attenuated after normothermic CPB (N-CPB) or profoundly hypothermic CPB (PH-CPB). Although isoflurane attenuated vasodilation of control vessels to ADP or isoproterenol, isoflurane did not further attenuate vasodilation to ADP or isoproterenol after N-CPB or PH-CPB. The direct vasomotor effect of isoflurane depended on the preexisting tone of the vessels, constricting vessels without preconstriction and dilating them after preconstriction. These findings may have implications on the incidence of neuropsychological dysfunction after CPB and use of isoflurane.     

Effect of the stable thromboxane derivative, carbocyclic thromboxane A2, on membrane potential of rat myenteric neurones in culture

The effects of carbocyclic thromboxane A(2) (cTXA(2); 10(-6) mol L(-1)) on membrane potential and cytosolic Ca(2+) concentration were measured with the whole-cell patch-clamp or the fura-2 method, respectively, at rat myenteric ganglia. cTXA(2) caused a hyperpolarization of myenteric neurones from -19.3 +/- 2.5 to -29.3 +/- 2.3 mV. In addition, the eicosanoid potentiated the carbachol-induced depolarization from 4.2 +/- 1.0 mV under control conditions to 11.1 +/- 1.1 mV in the presence of the cTXA(2) (n = 9). The hyperpolarization was abolished by internal application of CsCl (140 mmol L(-1)), a non-selective blocker of K(+) channels, or EGTA (11 mmol L(-1)in the pipette solution), a chelator of intracellular Ca(2+). A similar inhibition was observed in the presence of charybdotoxin (10(-7) mol L(-1)). Fura-2 imaging experiments revealed a cTXA(2)-evoked increase in the intracellular Ca(2+) concentration as indicated by a rise in the fura-2 ratio signal. This response was mediated by a release of Ca(2+) from intracellular stores as sarcoplasmic-endoplasmic reticulum Ca(2+)-ATPase blockade with cyclopiazonic acid (5 x 10(-5) mol L(-1)) completely abolished the response to cTXA(2). A similar inhibition was observed after blockade of phospholipase C with U-73122 (10(-5) mol L(-1)). These results suggest an activation of Ca(2+)-activated K(+) channels by cTXA(2) after stimulation of phospholipase C.     

4-羟基他莫昔芬对泌乳素腺瘤GH3细胞增殖和分泌的影响

目的探讨雌激素受体拮抗剂4-羟基他莫昔芬（OHTam）对泌乳素腺瘤GH3细胞增殖和分泌泌乳素的影响。方法用逆转录多聚酶链反应（RT—PCR）的方法测定泌乳素腺瘤GH3细胞中雌激素受体-mRNA（ER—mRNA）的表达,并观察在去激素培养条件下以及不同浓度的OHTam和雌二醇（E2）对GH3细胞生长速度、生长抑制率、雌激素受体-mRNA（ER—mRNA）及泌乳素分泌水平的影响。结果在E2（10^-8mol／L）组细胞吸光度为0．561±0．018,抑制率为-0．06,细胞计数、生长抑制率、ER—mRNA及泌乳素分泌水平与去激素培养组差异显著（P〈0．05）;E2（10^-6mol／L）＋OHTam（10^-6mol／L）组吸光度为0．504±0．014,抑制率为0．08,细胞计数、ER—mRNA及泌乳素分泌水平与E2（10^-8mol／L）组差异显著（P〈0．05）。结论泌乳素腺瘤GH3细胞有雌激素受体表达,E2可以促进GH3细胞的增殖和泌乳素的分泌,而雌激素受体拮抗剂OHTam能够有效抑制雌激素的作用。     

Muscarinic--but not nicotinic--acetylcholine receptors mediate a nitric oxide-dependent dilation in brain cortical arterioles: a possible role for the M5 receptor subtype.

Increases in cortical cerebral blood flow are induced by stimulation of basal forebrain cholinergic neurons. This response is mediated in part by nitric oxide (NO) and reportedly involves both nicotinic and muscarinic receptors, some of which are possibly located in the vessel wall. In the present study, the vasomotor response(s) elicited by acetylcholine (ACh) on isolated and pressurized bovine and/or human intracortical penetrating arterioles were investigated, and pharmacological characterization of the receptor involved in this response was carried out. Acetylcholine (10(-11) to 10(-4) mol/L) dose dependently dilated bovine and human intracortical arterioles at spontaneous tone (respective pD2 values of 6.4+/-0.3 and 7.2+/-0.3 and E(Amax) of 65.0+/-26.8 and 43.2+/-30.1% of the maximal dilation obtained with papaverine) and bovine arterioles after preconstriction with serotonin (pD2 = 6.3+/-0.1, E(Amax) = 80.0+/-17.9% of induced tone). In contrast, nicotine (10(-8) to 10(-4) mol/L) failed to induce any vasomotor response in bovine vessels whether at spontaneous or at pharmacologically induced tone. Application of the nitric oxide synthase (NOS) inhibitor Nomega-nitro-L-arginine (L-NNA; 10(-5) mol/L) elicited a gradual constriction (approximately 20%) of the arterioles, indicating the presence of constitutive NO release in these vessels. Nomega-Nitro-L-argigine (10(-5) to 10(-4) mol/L) also significantly blocked the dilation induced by ACh. The muscarinic ACh receptor (mAChR) antagonists pirenzepine, 4-DAMP, and AF-DX 384 dose dependently inhibited the dilatation induced by ACh (10(-5) mol/L) with the following rank order of potency: 4-DAMP (pIC50 = 9.2+/-0.3) > pirenzepine (pIC50 = 6.7+/-0.4) > AF-DX 384 (pIC50 = 5.9+/-0.2). These results suggest that ACh can induce a potent, dose-dependent, and NO-mediated dilation of bovine and/or human intracortical arterioles via interaction with an mAChR that best corresponds to the M5 subtype.