B7-H3：一种新的共刺激分子

B7-H3是B7家族的最新成员，B7-H3 mRNA广泛存在于非淋巴组织，其受体在活化的T细胞表面可被诱导表达，且此受体不同于CTLA-4、ICOS和PD-1。在抗人CD3单克隆抗体存在的情况下，B7-H3可增加CD4^ 和CD8^ 细胞的生成，且是剂量依赖性的，并可选择性的增加IFN-γ的生成，参与T、B细胞的活化和机体免疫，在肿瘤治疗、器官移植和自身免疫病的治疗方面具有重要的作用。     

人4IgB7-H3-Fc融合蛋白的表达及其生物学活性的研究

为获得人4IgB7-H3-Fc融合蛋白,研究其对T细胞的共刺激作用,采用PCR技术分别从pMD18-T/4IgB7-H3和pMD18-T/hIgG1(Fc)重组载体中扩增出人4IgB7-H3胞外段基因和人IgG1重链Fc恒定区基因,通过RT-PCR技术插入逆转录病毒载体pGEZ-Term,重组逆转录病毒载体与两个辅助病毒载体经脂质体法共转染包装细胞293T,收集含有完整病毒颗粒的293T细胞的培养上清反复感染L929细胞,利用Zeocin筛选获得能稳定分泌4IgB7-H3-Fc融合蛋白的基因转染细胞。基因转染细胞经无血清培养后,收集的上清用Dot blot检测,超滤浓缩并经Protein G柱纯化,再用SDS-PAGE、Western blot鉴定。以4IgB7-H3-Fc蛋白检测活化T细胞表面未知受体的表达,通过MTT方法分析4IgB7-H3-Fc融合蛋白对T细胞的共刺激作用。结果显示,成功地构建了pEGZ-Term/4IgB7-H3-Fc重组逆转录病毒载体,经转染包装细胞293T后,筛选获得能稳定分泌4IgB7-H3-Fc蛋白的L929基因转染细胞株;纯化后的4IgB7-H3-Fc蛋白能够与活化T细胞表面结合,并对T细胞有显著的促增殖作用。为探讨人4IgB7-H3-Fc融合蛋白对T细胞的共刺激作用和寻找其未知受体奠定良好的物质基础。     

B7-H3:一种新的共刺激分子

B7 H3是B7家族的最新成员 ,B7 H3mRNA广泛存在于非淋巴组织 ,其受体在活化的T细胞表面可被诱导表达 ,且此受体不同于CTLA 4、ICOS和PD 1。在抗人CD3单克隆抗体存在的情况下 ,B7 H3可增加CD4 + 和CD8+ 细胞的生成 ,且是剂量依赖性的 ,并可选择性的增加IFN γ的生成 ,参与T、B细胞的活化和机体免疫 ,在肿瘤治疗、器官移植和自身免疫病的治疗方面具有重要的作用     

B7-1和B7-2基因转染神经母细胞瘤细胞免疫原性的研究

目的比较免疫共刺激信号B7-1和B7-2以腺病毒为载体转染神经母细胞瘤（NB）SH-SY5Y细胞株,观察其对肿瘤细胞免疫原性的影响。方法以携带绿色荧光蛋白的腺病毒质粒（Ad-GFP）转染SH—SYSY细胞,通过流式细胞仪（FCM）判断转染效率,确定合适的感染倍数（MOI）。分别以空病毒质粒（Ad）及携带B7-1或B7-2的腺病毒质粒转染SH-SYSY细胞,即对照组和B7-1或B7-2组;并以未转染的肿瘤细胞为空白对照（空白组）。采用流式细胞仪（FCM）检测B7-1分子和B7-2蛋白表达,Ficoll密度梯度离心法直接分离和纯化外周血单个核细胞,分别以效靶比5∶1和10∶1进行混合淋巴细胞培养后,测定放射性核素闪烁计数（cpm）/min,同时检测上清液中细胞因子IFN-γ及IL-2的分泌水平。结果腺病毒对SH-SY5Y细胞有较高的转染效率,转染后目的基因B7-1和B7-2得到了有效表达。B7-1组、B7-2组cpm值及上清液IFN-γ、IL-2水平明显高于Ad组、SH组（P〈0.01）;B7-1组与B7-2组比较,cpm值及细胞因子水平增高无明显差别（P〉0.05）。效靶比5∶1时,与10∶1相比,cpm值及IFN-γ、IL-2含量的增加更明显（P〈0.05）。结论 B7-1和B7-2分子可促进T淋巴细胞的增殖及活化T细胞分泌IFN-γ、IL-2,而B7-1与B7-2两组间cpm值及细胞因子水平无明显差别。     

B7-1基因转染小鼠肝癌细胞诱导的抗瘤效应研究

目的：研究共刺激分子B7-1在抗肿瘤免疫中的作用.方法：体外观察转染B7-1基因及空载体的小鼠肝癌细胞株H22与同源小鼠脾细胞混合培养后,测定淋巴细胞增殖指数、CTL,于小鼠皮下接种不同H22细胞后观察肿瘤生长情况.结果：转染B7-1基因的H22细胞体外可刺激淋巴细胞增殖,增强CTL的杀伤活性,接种小鼠后成瘤潜伏期和荷瘤鼠存活期明显延长（P＜0.05）.结论：转入B7-1基因的小鼠肝癌细胞H22能增强免疫原性,能有效诱导CTLs介导的抗肿瘤免疫反应.     

转染人CTLA-4细胞的对树突状细胞B7分子表达的影响

从PHA活化的人外周血T细胞中抽提总RNA,经RT-PCR扩增出CTLA-4的全长基因,构建逆转录病毒载体pEGZ-Term/CTLA-4,经PCR及电泳鉴定后感染包装细胞293T。收集培养上清感染L929细胞。用Zeocin选择培养。经免疫荧光及流式细胞术进行筛选,获取稳定表达CTLA-4分子的细胞株CTLA-4/L929。将CTLA-4/L929经丝裂霉素处理后与体外细胞因子诱导的树突状细胞共同孵育。分别于24、48及72h,用直接免疫荧光法和流式细胞术分析树突状细胞B7-1和B7-2分子的表达。研究结果显示,构建的重组逆转录病毒载体pEGZ-Term/CTLA-4的PCR产物长约700 bp,与人CTLA-4基因的长度一致。经Zeocin选择及多次亚克隆化培养,CTLA-4基因转染细胞CTLA-4/L929稳定表达膜型CTLA-4分子。以其为刺激细胞与树突状细胞共同培养后,可明显下调树突状细胞B7-1的表达,但对B7-2的表达没有影响。本研究获得的CTLA-4基因转染细胞株,为进一步探讨CTLA-4及其配基分子在免疫应答中的作用与机制提供了手段。     

人CXCR3B基因转染细胞株的构建、鉴定及生物学功能研究

目的:克隆人CXCR3B基因,并构建含有该目的基因的真核表达载体,获得稳定表达人CXCR3B分子的基因转染细胞株L929-huCXCR3B.方法:采用PCR方法从pMD19-T/huCXCR3A质粒中扩增人CXCR3B基因,通过双酶切装入真核表达载体pIRES2-EGFP中;脂质体法转染L929细胞,G418加压筛选阳性克隆;分别用RT-PCR方法与免疫荧光技术分析阳性克隆中人CXCR3B在mRNA和蛋白水平的表达.MTT分析基因转染细胞株 L929-huCXCR3B 在Mig( monokine induced by IFN-γ,IFN-γ诱导的单核因子)作用下的增殖能力.结果:成功克隆了人CXCR3B基因并构建了真核表达载体pIRES2-EGFP/huCXCR3B,转染该载体后获得了稳定表达人CXCR3B的基因转染细胞株L929-huCXCR3B,膜表面CX-CR3B分子的阳性表达率为93％.该基因转染细胞与其配体Mig共培养24、48及72 h,抑制率分别为41.44％、44.01％和24.80％.结论:L929-huCXCR3B细胞株的建立为研究CXCR3B信号转导及制备相应的单克隆抗体(mAb)奠定了基础.     

人B7-H4基因转染细胞的构建及其对T细胞的共刺激效应的初步研究

目的 构建含有人B7-H4基因的重组逆转录病毒载体，获得稳定表达B7-H4基因的1929细胞并初步研究其对T细胞的共信号作用及可能机制。方法从含人B7-H4基因的cDNA序列FLJ22418中，采用PCR扩增出B7-H4全长基因，双酶切装入逆转录病毒载体pEGZ-HA-Term，与辅助病毒载体脂质体法共转染包装细胞293T，用其培养上清感染1929细胞72h后，经Zeocin筛选出稳定表达B7-H4蛋白的L929细胞株；采用免疫荧光标记和流式细胞仪分析免疫分子的表达、^3H-TdR掺入检测细胞增殖以及ELISA测定细胞因子的水平。结果构建了含人B7-H4基因的重组逆转录病毒载体和获得含有B7-H4基因的重组病毒，筛选获得能稳定高表达人B7-H4蛋白的I_929转基因细胞；该转基因细胞对T细胞体外具有抑制增殖、活化和细胞因子分泌的作用。结论构建了稳定表达人B7-H4蛋白的细胞株，B7-H4分子在体外通过抑制T细胞分泌IL-2和促进其凋亡作用可显著地下调T细胞功能的效应。     

B7-H4基因对SKOV3细胞生长功能的影响

目的： 初步探讨B7-H4基因对人卵巢癌细胞株SKOV3细胞生长和致瘤性的影响。方法：RT-PCR法扩增编码基因, 构建真核表达载体PEGFP-N1/B7-H4,以脂质体为载体将重组质粒PEGFP-N1和PEGFP-N1/B7-H4分别导入SKOV3细胞中,筛选建立高表达的细胞株。MTT法绘制体外培养细胞生长曲线,将转染前后的肿瘤细胞分别接种于SCID小鼠的腹部皮下观察其致瘤性。结果：成功构建了人B7-H4真核表达载体,SKOV3/B7-H4细胞高表达B7-H4,转染后肿瘤细胞体外生长速度明显增快。SKOV3/B7-H4细胞在小鼠体内的致瘤性较SKOV3/neo细胞和野生型SKOV3细胞明显升高。结论： B7-H4基因导入细胞后在体外和体内具有明显加快肿瘤生长的作用,可作为肿瘤基因治疗的靶向基因。     

B7家族的新成员—B7-H1、B7-H2、B7-H3、B7-DC

T细胞的活化需要TCR与抗原肽-MHC的第一信号，以及共刺激因子的第二信号系统。B7家族是重要的共刺激分子，属于免疫球蛋白家族。除B7-1和B7-2外，近几年又发现了B7家族的新成员——B7-H1、B7-H2、B7-H3、B7-DC等，与T、B细胞的活化及免疫应答等有关。深入研究B7家族成员的结构和作用机制，有助于T、B细胞活化机制以及免疫耐受、肿瘤免疫研究的深入和发展。     

卵巢上皮-间质肿瘤中B7-H3、B7-H4的表达及临床病理意义

目的探讨B7-H3、B7-H4在卵巢上皮-间质肿瘤中的表达及其临床病理意义。方法用RT-PCR技术及免疫组化PV9000两步法研究86例卵巢恶性上皮-间质肿瘤(恶性组),40例卵巢交界性上皮-间质肿瘤(交界组)和40例卵巢良性上皮-间质肿瘤(良性组)B7-H3与B7-H4mRNA及蛋白表达情况,并结合临床病理参数进行分析。结果 B7-H3、B7-H4mRNA在3组卵巢肿瘤组织中均有表达,且各自的3组卵巢肿瘤组织的mRNA光密度值差异均有统计学意义(P<0.05);B7-H3与B7-H4蛋白在恶性组中均呈细胞质和(或)细胞膜表达,其中B7-H3阳性率为81.4%(70/86),明显高于交界组22.5%(9/40)和良性组5.0%(2/40)的表达,差异有统计学意义(P<0.05);B7-H4阳性率为77.9%(67/86),明显高于交界组35.0%(14/40)和良性组5.0%(2/40)的表达,差异有统计学意义(P<0.05)。恶性组的卵巢癌组织中B7-H3蛋白在非黏液性卵巢癌中较黏液性卵巢癌高表达,差异有显著性(P<0.01),与临床分期、病理分级、患者年龄、腹水细胞学和淋巴结转移差异均无统计学意义(P>0.05)。B7-H4蛋白表达与组织病理学类型、临床分期、病理分级、患者年龄、腹水细胞学和淋巴结转移差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 B7-H3与B7-H4在卵巢恶性上皮-间质肿瘤表达提示其可能与肿瘤的发生、发展有关,可为卵巢恶性肿瘤的诊断及治疗提供新的依据。     

小鼠B7-H3-Fc融合蛋白的表达及其生物学活性的研究

目的:制备B7-H3-Fc融合蛋白,研究其对T细胞的共刺激作用。方法:首先采用PCR技术分别从pMD19-T/小鼠B7-H3和pMD19-T/hIgG1(Fc)重组载体中扩增出小鼠B7-H3胞外段基因和人IgG1重链Fc恒定区基因。通过重叠PCR技术将2段基因连接成B7-H3-Fc,经EcoR I和BglII双酶切后插入真核表达载体pIRES2-EGFP构建成pIRES2-EG-FP/B7-H3-Fc重组载体。脂质体法转染CHO细胞,经G418加压筛选能稳定分泌表达小鼠B7-H3-Fc融合蛋白的基因转染细胞,并经Western blot鉴定。该转基因细胞无血清培养后,收集细胞上清、超滤浓缩后行经Protein G柱纯化,获得纯品B7-H3-Fc融合蛋白。通过CCK-8以及ELISA方法检测小鼠B7-H3-Fc融合蛋白对T细胞体外增殖及细胞因子分泌的影响。结果:成功地构建了能稳定表达B7-H3-Fc融合蛋白基因的CHO转基因细胞株,该融合蛋白能够剂量依赖性地促进T细胞体外增殖及IL-2和IFN-γ等细胞因子分泌。结论:本研究提示B7-H3作为重要的共刺激分子,在调节T细胞免疫应答中发挥了正性共刺激作用。     

B7-H1阻断对CD3AK细胞体外生物学活性的影响

目的: 探讨B7-H1阻断对CD3AK细胞增殖活化及其抗肿瘤免疫效应的影响.方法: 利用CD3单克隆抗体(mAb)刺激健康人外周血淋巴细胞诱导产生CD3AK细胞,然后利用B7-H1阻断型抗体阻断B7-H1通路,3H-TdR渗入法检测阻断后CD3AK细胞的增殖能力,ELISA法检测阻断后CD3AK细胞分泌IFN-γ、 TNF-α和IL-10的水平,同时将CD3AK细胞作用于膀胱肿瘤BIU-87细胞,MTT法检测阻断后CD3AK细胞的杀伤活性.结果: B7-H1阻断后,CD3AK细胞的增殖能力明显增强,体外存活时间明显延长;其分泌IFN-γ、 TNF-α的水平明显提高,而分泌IL-10的水平明显下降;同时CD3AK细胞对BIU-87细胞的杀伤活性亦明显升高.结论: 阻断B7-H1通路可以促进和维持CD3AK细胞的增殖和活化,并增强其抗肿瘤的免疫效应.阻断B7-H1通路将有望成为肿瘤免疫治疗的新策略.     

Characterization and application of two novel monoclonal antibodies against 2IgB7-H3: expression analysis of 2IgB7-H3 on dendritic cells and tumor cells

2IgB7-H3 has recently been identified as a new member of the B7 family. Its expression at the protein level remains largely unknown due to the lack of the specific monoclonal antibody (mAb). To characterize the expression of 2IgB7-H3, we newly generated two mouse antihuman 2IgB7-H3 mAbs (4H7 and 21D4). We found the constitutive expression of 2IgB7-H3 on a series of tumor cell lines. Furthermore, the expression was examined on monocyte-derived dendritic cells (Mo-DCs) and DCs from CD34(+) hematopoietic progenitor cells (HPC) by means of mAb staining. The results showed that 2IgB7-H3 was expressed on Mo-DCs at a high and stable level during differentiation in vitro. With the maturation of DCs from CD34(+) HPCs, the expression of the molecule was upregulated. However, the 2IgB7-H3 was not expressed on fresh isolated T and B lymphocytes, monocytes, or CD34(+) HPCs. These results suggested that 2IgB7-H3 may be a valuable surface antigen for the detection of DCs.     

协同刺激分子B7-H3在非小细胞型肺癌中的表达及其临床意义

目的:探讨非小细胞型肺癌组织中协同刺激分子B7-H3的表达及其与患者的病理参数、预后及CD3+T淋巴细胞的浸润程度的相关性。方法:收集2005年1月至2005年9月在苏州大学附属第四人民医院行手术切除术的非小细胞型肺癌患者组织标本87例,免疫组织化学的方法检测非小细胞型肺癌中协同刺激分子B7-H3的表达和CD3+T淋巴细胞的浸润程度。结果:协同刺激分子B7-H3在非小细胞型肺癌组织中高表达,该分子的表达与患者的年龄、性别、淋巴结的转移情况、肿瘤的大小、病理分型无相关性(P>0.05),但与患者的生存期呈负相关。且该分子在肺癌中的表达水平与浸润的T细胞呈负相关。结论:协同刺激分子B7-H3的表达在非小细胞型肺癌组织中诊断和预后判断中具有潜在的临床应用价值。     

B7-H 3在神经胶质瘤免疫逃逸过程中的作用机制研究

目的：通过对不同级别的神经胶质瘤（glioma）组织中的刺激分子B7‐H3的检测,进一步探讨其在神经胶质瘤免疫逃逸过程中的作用机制,为神经胶质瘤临床免疫治疗提供理论基础和实验依据。方法：采用免疫组化法,检测58例脑神经胶质瘤患者瘤组织和9例正常脑组织中B7‐H3的表达,并分析其与神经胶质瘤生物学行为及预后之间的关系。结果：58例不同级别的胶质瘤组织均表达B7‐H3,9例正常脑组织中发现很少有B7‐H3的表达,低级别（1～2级）及高级别（3～4级）胶质瘤组与正常脑组织组之间B7‐H3的表达差异均有显著意义（ P＜0．05）,低级别（1～2级）胶质瘤组与高级别（3～4级）胶质瘤组之间有明显差异性（P＜0．05）,B7‐H3的表达与患者的年龄、性别无关,与病理级别及预后有关,生存期超过2年的神经胶质瘤患者B7‐H3阳性表达率显著高于生存期短于2年的胶质瘤患者（ P＜0．01）。结论：B7‐H3的表达与神经胶质瘤之间具有相关性,且随神经胶质瘤病理级别的增高而降低,在神经胶质瘤的免疫逃逸过程中有重要作用,可以作为反映神经胶质瘤生物学行为和患者预后的一个新的指标;并为神经胶质瘤免疫逃逸机制的进一步研究提供了线索,为临床制定合理的治疗方案、预后判断及疗效评定提供客观参考依据。     

B7-H3——肿瘤免疫治疗的新热点

B7-H3是新近发现的共刺激分子B7家族的一个新成员,在T细胞介导的免疫反应中起重要的调节作用。B7-H3蛋白质在正常组织、细胞中不表达或极低表达,却高表达于多种肿瘤组织,并与肿瘤的进展、患者的生存及预后密切相关。有研究发现该分子可能是通过与髓样细胞触发受体家族成员TLT-2结合发挥作用,但确切的作用机制尚不完全清楚。目前认为B7-H3在肿瘤免疫中的作用存在争议,一方面它可以发挥共刺激作用,增加IFN-γ及TNF-α等细胞因子的分泌,增强CTL活性,提高机体抗肿瘤免疫反应。另一方面,它还能够抑制CD4+T淋巴细胞活化以及IFN-γ及IL-4等细胞因子的产生,发挥共抑制作用。进一步研究B7-H3的生物学作用将为肿瘤免疫中T细胞介导的免疫应答调控提供新的免疫治疗前景。本文就B7-H3与肿瘤关系及其在肿瘤免疫中的作用作一综述。     

B7-H3 and its role in bone cancers

Most bone cancers have a high risk of metastasis, recurrence, and poor prognosis. Although conventional treatments are still the most important therapy, disadvantages still exist. Therefore, there is an unmet need to develop effective strategies. Immunotherapy is a promising therapy. Immunotherapies targeting checkpoints have proven to be successful, but B7-H3 (CD276, clusters of differentiation protein 276), a member of the B7-family of co-stimulatory molecules, is not being widely studied in bone cancers. This review summarized the studies on B7-H3 in bone cancers. 4 studies investigated B7-H3 expression in osteosarcoma, but there is no study on B7-H3 expression in chondrosarcoma. Two studies investigated the possibility to treat Ewing`s sarcoma through targeting the B7-H3 CAR (chimeric antigen receptors) T-cells or using anti-B7-H3 antibody. A study observed the growth of myeloma in B7-H3-deficient mice and the therapeutic effect of B7-H3 antibody and a study invested B7-H3 expression in myeloma patients. One study reported B7-H3 expression in osteoclastomas and one study investigated B7-H3 expression in chordoma tumor tissues. Two clinical trials are conducting on the therapy of osteosarcoma and myeloma using B7-H3 as a target. In conclusion, B7-H3 could be a target of bone cancers.     

B7-H1 and B7-H4 expression in colorectal carcinoma: Correlation with tumor FOXP3 regulatory T-cell infiltration

B7-H1 and B7-H4 are newly discovered members of the B7-CD28 family. They can inhibit T cell activation and proliferation and regulate T cell immune response negatively. Both B7-H1 and B7-H4 are expressed in many tumors and are classified as co-inhibitors of cell-mediated immunity. FOXP3⁺ regulatory T cells (Tregs) play an important role in the maintenance of tumor immunity tolerance. However, the implication of B7-H1 and B7-H4 expression and their interaction with Tregs infiltration in colorectal cancer are unknown. The present study aimed to determine the expression of B7-H1 and B7-H4 as well as Tregs infiltration in colorectal cancer and to explore the clinical and pathological implication of suppressor immune cells and molecules. Frozen sections and immunohistochemical assay were undertaken to assess B7-H1, B7-H4 expression and Tregs infiltration in fresh specimens collected from 56 patients with colorectal carcinoma. The results showed that expression of B7-H1 and B7-H4 in colorectal carcinoma tissues was significantly higher than in adjacent normal mucosa (P < 0.001). B7-H1 expression was positively correlated to the infiltration depth, lymph node metastasis and advanced Duke's stage (P < 0.05, P < 0.05 and P < 0.05, respectively), whereas B7-H4 expression was positively related to the infiltration depth and lymph node metastasis (P < 0.01 and P < 0.05, respectively). Furthermore, Tregs infiltration was more frequent in tumor tissue than in adjacent normal mucosa and was associated with poor differentiation and positive lymph node metastasis (P < 0.01, and P < 0.01, respectively). The statistical analysis indicated a significant correlation between Tregs infiltration and B7-H1 or B7-H4 expression respectively. These results suggest that over-expression of B7-H1 and B7-H4 has stronger prognostic significance and promote tumor tolerance, and they might contribute to Tregs development in the colorectal carcinoma tolerogenic milieu.     

B7-H4与肿瘤关系的研究进展

T细胞介导的免疫应答在肿瘤免疫中起到重要作用,而T细胞的活化过程又依赖于双信号和细胞因子,其中活化的第二信号来自协同刺激分子,协同刺激分子中B7/CD28家族成员在肿瘤免疫中发挥着重要作用.B7家族新成员B7-H4是T淋巴细胞免疫应答的负性调控因子,可抑制T细胞的增殖和细胞因子的产生,其与肿瘤的发生发展有着重要的关系,可作为肿瘤诊断和治疗的新靶点.