猪内皮细胞与血清作用后表达上调基因的初步鉴定

目的探讨猪内皮细胞与人血清作用后基因表达的变化。方法猪内皮细胞系PIEC被含 2 0 %人血清的培养基作用 2 .5小时作为实验组 ,对照组为含 2 0 %胎牛血清的培养基作用的PIEC。利用抑制消减杂交技术 (SSH)、DNA序列测定技术、生物信息学分析、RT PCR等进行研究。结果经过SSH和克隆 ,获得一包含约 2 0 0个克隆的消减文库。从文库中随机挑取 15个克隆进行测序 ,并在GenBank中进行同源性比较。其中 1个是猪IL 8的部分序列 ,3个序列分别与人唐氏综合征核心区基因 1(DSCRl)、人FSHD区基因I(FRGl)、牛伴侣蛋白 10cpnlo基因同源。其余序列尚无已知同源基因匹配。结论猪内皮细胞与人血清作用后有许多基因的表达上调。     

大鼠海马组织中神经元型一氧化氮合酶基因克隆

目的 :克隆胚胎大鼠海马组织中神经元型一氧化氮合酶 (nNOS)基因。方法 :采用RT -PCR法 ,从胚胎大鼠海马组织mRNA中扩增nNOS基因CDS区片段 ,克隆入T载体 ,筛选阳性克隆、酶切签定并经序列测定。结果 :RT -PCR法扩增出一特异产物与预期长度 2 4 0bp相符 ,DNA序列测序的结果与GenBank的序列 (U6 730 9)比较 ,所克隆的nNOS基因与其中的 2 4 0bp完全相同 ,与nNOS基因 10 0 %同源。结论 :采用RT -PCR和T载体技术获得了胚胎大鼠海马组织中的nNOS基因克隆     

猪脑硫氧还蛋白还原酶基因片断的序列分析

目的 :在猪脑细胞中分离并克隆硫氧还蛋白还原酶 (TR)基因片段 ,以人脑TR基因片段为参照比较分析 ,探讨选择猪作为研究TR基因功能实验动物模型的可能性。方法 :(1)进行逆转录 -聚合酶链式反应 (RT PCR) ,获得TR基因cDNA ;(2 )插入pGEM T载体 ,转化至大肠杆菌 ;(3)筛选并鉴定阳性克隆 ,纯化重组子并测序 ;(4 )将测序结果与人脑TR基因序列比较。结果 :(1)获得了一个 6 0 6bp大小的猪脑细胞TR基因片段 ,含有 196个氨基酸。(2 )猪脑TR基因片段序列与基因库中的人脑TR基因序列有 88%同源性 ;(3)猪脑TR氨基酸序列中有 18个氨基酸与人脑TR不同 ,同源性为 90 %。结论 :猪与人TR基因的同源性较大 ,选择猪作为研究TR功能的实验动物有一定的可能性。     

大鼠脑组织中SSeCKS基因克隆

目的 :克隆胚胎大鼠脑组织中SSeCKS基因。方法 :采用RT -PCR法 ,从胚胎大鼠脑组织mRNA中扩增SSeCKS基因部分CDS区片段 ,克隆入T载体 ,筛选阳性克隆、酶切鉴定并经序列测定。结果 :RT -PCR法扩增出一特异产物与预期长度 44 6bp相符 ,DNA序列测序的结果与GenBank提供的已知序列 (U 2 3 14 6)比较 ,所克隆的SSeCKS基因片段与其中的 44 6bp完全相同 ,与SSeCKS基因 10 0 %同源。 结论 :采用RT -PCR和T载体技术获得了胚胎大鼠脑组织中的SSeCKS基因克隆     

2009年新型甲型H1N1流感病毒全基因组序列重组分析

目的:分析2009年流行的新型甲型流感病毒（A/H1N1）全序列的基因重组现象。方法:从NCBI基因数据库下载2009年新型甲型流感病毒（A/H1N1）全基因组序列,采用Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 4.0（MEGA 4.0）软件对8条基因序列进行拼接和比对,分析2009年爆发株与历史流行株序列间的同源性;同时采用Simplot 3.5.1软件分析新型流感病毒A/H1N1基因重组现象。结果:2009年3月以来爆发的新型A/H1N1病毒株聚合酶B1(polymerase B1,PB1)基因来自于人H3N2,其同源性为93.7%;聚合酶B2 (polymerase B2,PB2)和聚合酶A (polymerase A,PA)与禽H5N1同源性较高,同源性分别为89.0%、89.9%;血凝素(hemagglutinin,HA)、核蛋白(nucleoprotein,NP)和非结构蛋白(non-structural protein,NS)与北美地区猪H1N1同源性较高,同源性分别为91.7%、93.1%和93.1%;神经氨酸酶(neuraminidase,NA)和基质蛋白(matrix protein,MP)与欧洲地区猪H1N1同源性较高,同源性分别为90.5%、95.5%。全基因序列同源性分析发现2009年新型A/H1N1病毒与北美地区猪H1N1病毒同源性最高,为83.9%。结论:2009年新型甲型H1N1流感病毒可能是人H3N2、北美地区猪H1N1、欧洲地区猪H1N1、禽H5N1的基因重排病毒。     

小型猪CYP3A88基因克隆与其他动物的序列比较

目的 克隆我国资源小型猪品系巴马香猪肝脏中的CYP3A88基因,并进行生物信息学分析.方法 应用RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)技术对其全长进行扩增,测序,利用Internet和GenBank数据库对其序列进行生物信息学分析.结果首次克隆并鉴定了我国资源小型猪品系巴马香猪肝脏中CYP3A88(GenBank登录号:EF625347)的编码区,获得大小为1965 bp的全长cDNA,编码区长为1512bp,编码503个氨基酸;比较核苷酸序列,与小型猪CYP3A39相似性高达94%,而与人等其它动物的CYP3A相似性则在86%以下;推导和分析氨基酸序列表明,与小型猪CYP3A其它成员(CYP3A39、CYP3A29、CYP3A22)进行对比,其相似性分别为92%,89%,80%,而将小型猪与人的CYP3A分别比对,小型猪CYP3A88与人CYP3A4相似性最高,为77%;对其二级结构预测,它可能含12个α螺旋,4个β折叠;经NCBI上的CDD程序分析可知,其39-491氨基酸区域为P450 3A亚家族保守结构区域;经聚类分析,小型猪和狗的CYP3A与人有较近的进化关系;通过同源建模法对其在线建模,人CYP3A4晶体结构作为其模建模型,得到了其经典的三维结构.结论 在猪CYP3A家族四个基因中,CYP3A88在序列和高级结构上均与人CYP3A4的最为相似.     

白细胞介素10基因转染延长移植物存活的研究

目的　克隆大鼠白细胞介素 10 (IL - 10 )的cDNA序列并研究IL - 10基因转染对移植物的保护作用。方法　一步法从脂多糖 (LPS)刺激培养的脾细胞中提取细胞总RNA ,逆转录PCR(RT -PCR)克隆出IL - 10的cDNA。将IL - 10cDNA插入pcDNA3载体进行制备、纯化。建立大鼠异位心脏移植模型 ,在脂质体介导下将pcDNA-IL10重组体通过冠状动脉灌注转染移植心脏。观察移植心脏的存活时间 ,半定量RT -PCR法检测移植心脏IL- 10的转录水平 ,ELISA法检测IL - 10的表达水平。结果　大鼠IL - 10cDNA全长序列被成功克隆 ,序列测定证实与基因库报告的结果完全一致。基因转染的移植心脏平均存活时间明显延长 (17.8天vs 8.5天 ,P <0 .0 1) ;RT-PCR法在对照组未发现IL - 10转录 ,而在基因转染组有 3只移植心脏表现高水平转录 ;基因转染后 3天IL - 10的表达明显增加 (2 70 .8ng Lvs 3 1.5ng L ,P <0 .0 1) ,且移植心脏输出静脉血IL - 10高于外周静脉血 (2 70 .8ng Lvs 163 .5ng L)。结论　通过冠状动脉灌注能够进行基因转染 ,IL - 10基因转染可以延长移植心脏的存活时间     

弓形虫缓殖子期特异抗原SAG2C基因的克隆、鉴定与生物信息学分析

目的 克隆并鉴定弓形虫PRU株表面抗原SAG2C基因序列和cDNA序列,对比不同毒力弓形虫株(PRU、RH、ME49)中SAG2C基因序列,进行生物信息学分析.方法 根据SAG2C基因已知序列设计合成一对引物,应用PCR技术从Prugniaud(PRU)株弓形虫基因组DNA和总RNA中扩增SAG2C基因,克隆入pMD19-T载体并进行序列测定.应用DNAMAN软件、NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)分析3种虫株之间SAG2C基因的同源性;利用生物信息学网站ExPASy(http://us.expasy.org/)对获得的基因及推导出的氨基酸序列进行生物信息学分析.结果 PCR扩增得到弓形虫PRU株SAG2C基因及其全长cDNA序列,酶切及PCR鉴定获得了正确的重组质粒,测序结果表明,获得SAG2C基因序列1 225 bp,全长cDNA序列1 095 bp.编码364个氨基酸.同源性分析显示,弓形虫Prugniaud株和RH株SAG2C基因同源性为97.14%:Prugniaud株与ME49株cDNA序列同源性为96.89%;编码氨基酸序列同源性为92%.N端为信号肽,C端疏水序列预测它为糖基磷脂酰肌醇固着蛋白,存在13个潜在抗原表位及多个保守功能区域.结论 成功克隆了弓形虫缓殖子期特异抗原SAG2C基因序列及其全长cDNA序列,序列分析显示其为糖基磷脂酰肌醇固着蛋白.     

人vW因子A3区基因的克隆及其序列分析

目的　克隆人血管性血友病因子 (vonWillebrandFactor,vWF)A3区基因并进行序列分析。方法　应用Trizol一步法从原代培养的人脐静脉内皮细胞中抽提总RNA ,应用RT -PCR扩增vWFA3区基因 ,并与 pUCmT载体连接构建成重组克隆载体pUCmT -vWF -A3 ,全自动测序仪测定目的基因DNA序列。结果　RT -PCR从内皮细胞中扩增出约 60 0bp的DNA片段 ,酶切鉴定插入目的基因片段的大小与理论计算一致 ,重组克隆载体pUCmT -vWF -A3经测序其结果完全正确。结论　本法可成功地克隆人vWFA3区基因片段 ,为进一步研究其生物学功能奠定了基础     

C57BL／6小鼠ZFP580C端编码基因的克隆及序列分析

【目的】克隆C57BL／6小鼠ZFP580C端编码基因cDNA序列，并进行序列测定和分析。【方法】参照GENBANK公布的C57BL／6小鼠ZFP580eDNA序列（注册号为AK005257），根据ZFP580C端编码基因eDNA序列设计1对引物，采用RT-PCR技术，从C57BL／6小鼠的肾脏组织中扩增ZFP580C端编码基因eDNA序列，回收纯化后与T载体连接，构建重组子pMD18-T-ZFP580，转化大肠杆菌DH5a。阳性克隆以限制性酶切分析与PCR法鉴定后，测定序列并分析。【结果】自C57BL／6小鼠肾脏组织获得总RNA，扩增出255bp的基因片段，成功构建阳性克隆重组子pMD-T-ZFP580，经双酶切和PCR鉴定与预期结果一致。所测定的C57BL／6小鼠ZFP580C端基因eDNA序列与13本RIKEN基因组中心于GENBANK注册（注册号为AK005257）的完全一致，与人ZNF580C端编码基因eDNA序列比较，核苷酸序列同源性为90％；该eDNA序列所编码的氨基酸序列与人ZNT580基因C端比较，同源性为100％，均编码有3个串联重复的C2H2型锌指蛋白主构域。其氨基酸序列与大鼠、犬、牛比较，同源性分别为100％、100％、98％。【结论】成功克隆C57BL／6小鼠ZFP580C端编码基因，该基因在不同种属间高度保守。     

分子克隆人血小板生成素基因

目的：克隆人血小板生成素基因，方法：采用ＲＴ一ＰＣＲ的方法。结果：从人胎肝中克隆出全长的血小板生成素（ＴＰＯ）基因，并亚克隆至ＰＵＣｌｌ８载体中。该ｃＤＮＡ全长１０６２ＢＰ，编码３５３个氨基酸，经序列测定与Ｂａｒｔｌｅｙ等人报道的完全一致［１］。结论：已获得人血小板生成素基因，此项工作为基因工程生产ＴＰＯ奠定了良好基础。     

人临床株幽门螺旋杆菌热休克蛋白A亚单位基因克隆及序列分析

目的获取人临床株幽门螺旋杆菌(Hp)热休克蛋白A(HspA)亚单位基因。方法用聚合酶链反应(PCR)技术从Hp的染色体DNA扩增HspA基因,将其定向插入pMD18-T克隆载体中进行核苷酸序列分析。结果经酶切鉴定及基因序列证实Hp HspA基因克隆成功。克隆载体pMD-HspA测序结果显示HspA DNA片段长度为357 bp。利用生物软件Om iga 2.0对临床分离的Hp和NCTC11637 HspA基因序列进行同源性比较,发现有14个核苷酸差异,基因序列同源性96.08%;对编码氨基酸进行比较,发现有1个氨基酸差异,氨基酸同源性99.15%。同时将Hp HspA序列与GenBank中公布的多株国外Hp HspA序列进行比较,结果显示基因序列同源性在95.20%~96.36%之间,氨基酸序列同源性在98.31%~100%之间。结论成功地获得人临床株Hp保守的HspA基因,为Hp HspA相关疫苗的研究奠定了实验基础。     

短尾蝮蛇毒磷脂结合抗凝蛋白β亚基的基因克隆和序列分析

目的：克隆短尾蝮蛇毒磷脂结合抗凝蛋白（PBAP）β亚基基因,并对该基因进行序列分析。方法：从短尾蝮蛇的毒腺中提取总RNA,设计引物并采用RT-PCR技术进行体外扩增PBAPβ亚基cDNA序列,将PCR扩增产物克隆至载体PMD-19T,通过PCR进行鉴定后,提取阳性克隆菌体质粒进行测序。结果：序列分析结果显示：PBAPβ亚基cDNA序列长度为441bp,编码框由146个氨基酸组成,其中包括由23个氨基酸的信号肽,以及123个氨基酸组成的成熟肽。结论：PBAPβ亚基基因及其氨基酸序列和已报道的一些蛇毒凝集素β亚基的基因以及氨基酸序列相比较,有88%～99%的同源性。     

人外周血单个核细胞与猪内皮细胞相互作用表达上调基因的鉴定

目的 探讨人外周血单个核细胞与猪内皮细胞相互作用后基因表达的变化。方法 人外周血单个核细胞（PBMC）与猪内皮细胞系PIEC共培养18h，对照组为未共培养的PBMC和PIEC。合成两组细胞的cDNA进行抑制消减杂交（SSH）。共培养中上调的cDNA用pGEM-T Easy载体进行T／A克隆，然后测序。用BLAST程序进行同源性分析。结果 经过SSH和克隆，获得一包含300克隆的消减文库。从文库中随机挑取24个克隆进行测序，并在GenBank中进行同源性比较，其中4个为已知的人的基因片段，8个为猪的表达序列标记（EST），9个片段与人的基因有高度的同源性。3个片段未检索到相匹配的同源性序列。结论 人外周血单个核细胞与猪内皮细胞相互作用的后有许多基因的表达上调。     

高原鼠兔低氧诱导因子-2α基因的克隆

目的 克隆高原鼠兔(Ochotona curzoniae低氧诱导因子-2α(Hypoxia inducible factor-2,HIF-2α)基因的cDNA部分片段,以获得HIF-2α cDNA的全长序列和进行HIF-2α的表达研究.方法 从高原鼠兔肺组织中提取总RNA,采用RT-PCR技术扩增出HIF-2α基因的c...     

杜氏盐藻14-3-3蛋白cDNA片段的克隆与分析

目的:克隆杜氏盐藻14-3-3蛋白的cDNA片段,并对其进行测序和序列分析.方法:根据衣藻、烟草、豌豆、拟南芥、西红柿等14-3-3蛋白的高度保守序列SVAYKNV、DSTLIMQ设计一对简并引物,采用RT-PCR方法扩增杜氏盐藻14-3-3蛋白的cDNA片段.PCR产物克隆至T载体后转化大肠杆菌JM109,筛选阳性菌落,测序,BLAST进行同源性比对.结果:克隆获得531 bp的cDNA片段,编码177个氨基酸(GenBank AN:AY965896).同源性比较显示,序列与其他生物具有高度的同源性,其与衣藻、烟草、豌豆、拟南芥、西红柿、人等的同源性分别为:94%,84%,84%,83%,83%和80%.结论:克隆得到了杜氏盐藻14-3-3蛋白的cDNA片段.     

猪白细胞介素12 p35、p40亚基基因的克隆和序列分析

目的:克隆猪白细胞介素(IL)-12p35、p40亚基基因,为制备猪囊尾蚴的复合基因疫苗奠定基础。方法:分别分离成年猪的外周血单个核细胞和脾细胞,培养10h后用IFN-γ(100ng/ml)刺激增殖12h,随后加入细菌脂多糖(1μg/ml)刺激培养3h,分别收集细胞并提取细胞总RNA,用RT-PCR方法扩增猪IL-12p35、p40cDNA编码基因,克隆至pMD18-T载体,经PCR和双酶切鉴定后进行序列测定。结果:猪IL-12p35、p40cDNAPCR产物电泳结果证明所克隆的基因分别为616bp和1011bp,基因测序结果与GenBank报道的基因序列各有一个碱基差异,但编码氨基酸无差异,证实分别为猪IL-12p35、p40cDNA编码基因。结论:成功克隆了猪IL-12p35、p40cDNA编码基因。