金钗石斛遗传多样性研究的随机扩增多态DNA-PCR反应体系的建立与优化

目的 对影响金钗石斛随机扩增多态DNA(RAPD)-PCR扩增效果的一些因素进行优化,为进一步研究其遗传多样性奠定基础.方法 对金钗石斛RAPD分析中一些重要影响因素进行比较系统的构建和优化,建立金钗石斛RAPD稳定可靠的反应体系.结果 金钗石斛较适宜的RAPD-PCR反应条件为:10μl PCR反应体系中,5～20 ng模板DNA,3.0mmol·L-1Mg2+,0.34 mmol·L-1dNTPs,0.6 U Taq DNA聚合酶,1.5 μmol·L-1引物,较适宜的退火温度为36℃.结论 所建立的金钗石斛RAPD反应体系具有标记位点清晰、反应系统稳定、检测多态性能力较强等特点,可用于金钗石斛的遗传多样性研究.以该优化的RAPD条件进行重复性实验,其实验结果重复性良好.     

不同居群美花石斛种质资源的RAPD分析

目的分析不同居群美花石斛种质资源的遗传多样性、濒危现状以及亲缘关系。方法利用RAPD分子标记技术和方法对不同居群美花石斛进行检测;通过计算遗传相似系数建立其聚类分析图。结果从117个随机引物中,共筛选出8个有效引物,对8个美花石斛居群进行RAPD-PCR扩增,共扩增出287个条带,平均每个引物的扩增条带为35.88个;287个条带共占据78个位点,其中11个位点是8个居群的共有位点,67个为多态位点,多态性比率达85.95%;8个居群的相似性系数在0.149~0.517。结论美花石斛遗传多样性水平低于铁皮石斛种内遗传多样性水平;美花石斛的濒危原因与人为过度采收、种子自然萌发力弱和遗传多样性水平较低有一定的关系;美花石斛8个居群比较自然地向3个方向演化发展,并形成3个分支;美花石斛系统演化规律与其地理分布的相关性有待于进一步研究。     

不同产地美花石斛形态及多糖含量比较研究

不同产地美花石斛株高、茎粗、叶片大小和形状、侧芽数量、质地以及多糖含量等方面差异显著。贵州省兴义和安龙地区的美花石斛多糖含量较高,分别为22.62%和20.96%。建议在规模化生产中,优先选用产于贵州兴义和安龙地区的美花石斛。     

美花石斛种质资源的RAPD分子鉴定

目的采用RAPD分子标记技术对不同产地美花石斛进行分析,为美花石斛种质资源的准确鉴别提供依据。方法用RAPD分子标记技术对不同产地美花石斛基因组总DNA进行PCR扩增,根据其扩增产物分子量大小进行编码计算。结果从117种随机引物筛选出8种有效引物,S2108的PCR扩增产物中的特异性位点能够鉴别出广西玉林居群和贵州安居群。结论利用RAPD分子标记技术鉴别美花石斛种质资源是可行的,在严格控制各项条件下能够保证鉴别美花石斛种质资源的稳定性和重复性。     

美花石斛和铁皮石斛试管苗物质含量比较

目的:研究比较美花石斛试管苗和铁皮石斛试管苗物质组分差异,揭示有效物质动态累积与生长规律的关系,为石斛培养提供参数支持。方法:观测2种石斛不同时期生长发育情况,用HPLC测定糖类、氨基酸及内源激素含量,进行比较分析。结果:两者动态积累生物量趋势基本一致;多糖/总糖值均较大,美花石斛多糖含量较高,铁皮石斛单糖种类多且含量高;氨基酸总量均呈降低趋势;赤霉素及玉米素含量差异有统计学意义,生长素及脱落酸变化趋势一致。美花石斛赤霉素含量与苗高、根长及干物质积累速率呈正相关,生长素含量与分蘖数呈负相关;赤霉素/脱落酸值高利于植株生长,生长素/玉米素值低可促进分蘖发生。结论:铁皮石斛进入生物量快速增长期较美花石斛早,且持续时间长。铁皮石斛生长量高于美花石斛是由于多时期同时测到多种糖类。美花石斛氨基酸总量高于铁皮石斛,说明美花石斛营养价值更高。美花石斛赤霉素低而脱落酸高、赤霉素/脱落酸及生长素/玉米素低可能是导致生长慢、纤弱及分蘖多的重要原因。     

沉香随机扩增多态性DNA反应体系的建立

目的对影响沉香随机扩增多态性DNA（RAPD）反应的各因素进行优化,建立适用于沉香RAPD的最佳反应体系。方法采用改良的CTAB法提取基因组DNA,变化单一因素的方法对模板DNA浓度、Taq酶用量、dNTPs、引物浓度、Mg^2＋浓度、退火温度对RAPD影响进行分析。结果建立了适合沉香RAPD分析的最佳反应体系：在20μl反应体系中,模板DNA用量20ng、Taq酶1．0U、dNTPs浓度为0．3～0．4mmol·L^-1、随机引物浓度为0．6μmol·L、Mg^2＋浓度1．5—2．0mmol·L^-1、PCR反应条件：94℃,10min;94℃,1min;36℃,1min;72℃,2min;45个循环,72℃,8min。结论该反应体系具有良好的稳定性和重复性。     

基于UPLC-MS/MS代谢组学的美花石斛与流苏石斛成分分析

目的 研究美花石斛和流苏石斛的化学成分异同,明确其特征性差异代谢物,发现共性药效的物质作用基础。方法 以统一化种植管理的美花石斛和流苏石斛组培苗为试材,两种石斛的代谢物采用UPLC-MS/MS和matware数据库对二级谱图数据定性分析,从代谢组水平对石斛茎中的小分子化合物成分和变化进行分析,结合多元变量统计学分析方法,对石斛的代谢物进行主成分分析,通过最小二乘判别分析,以VIP> 1和P <0.05为条件进行筛选和鉴定,得出2种石斛的差异代谢物,并通过KEGG数据库进行代谢通路富集分析。结果 共检测出代谢物1 077个,差异代谢物594个。流苏石斛相对于美花石斛分别有172个下调、422个上调代谢物,其中被KEGG注释到的差异代谢物有176个,涉及代谢通路77条,主要分布在19条途径中,其中P <0.05的有4条,分别是精氨酸和脯氨酸代谢、色氨酸代谢、ABC转运体和硫代葡萄糖苷生物合成途径。石斛的共有代谢物483个,主要包含酚酸类、游离脂肪酸类、有机酸类、糖及醇类等化合物。结论 鉴定了流苏石斛和美花石斛的差异性代谢物和共有代谢物,并推测出相关代谢通路,有助于揭示两种...     

美花石斛茎的淀粉粒数量、多糖含量与生物碱含量的相关性研究

目的:研究美花石斛茎的淀粉粒数量、多糖含量、生物碱含量之间的相关性.方法:显微计数法统计茎的淀粉粒数量,硫酸-蒽酮比色法测定多糖含量,溴甲酚绿比色法测定生物碱含量;Pearson积差相关分析、Kendall's等级相关分析、Spearman’s和谐系数分析研究三者的相关性.结果与结论:美花石斛茎的淀粉粒数量与其多糖含量有极显著的正相关性,而淀粉粒数量及多糖含量均与生物碱含量呈显著的负相关性.     

产地和采收时间对美花石斛药材中多糖的影响

目的研究不同产地和不同采收季节对美花石斛药材多糖的影响,为确定美花石斛药材的最佳产地和采收时间提供依据。方法采用苯酚-浓硫酸比色法比较不同产地和不同采收时间美花石斛药材的多糖量,并对结果进行方差分析。结果不同产地和生长年限美花石斛多糖量差异较大,贵州则戎产的美花石斛药材多糖量最高,为14.9%;不同采收时期美花石斛药材的多糖量2年生均高于3年生,4月时多糖量最低,从4月开始量逐渐增高,其中9月量达到最高。结论以多糖量为指标来判断药材质量的好坏,贵州则戎所产的美花石斛药材质量较好,2年生药材的多糖量较高,采收期安排在9月至次年1月份期间比较合适,这一结果与传统石斛药材秋冬季节采收相符,并为美花石斛药材的采收和质量评价提供了科学依据。     

霍山石斛与美花石斛多糖柱前衍生HPLC特征图谱比较

目的 研究比较霍山石斛与美花石斛多糖柱前衍生高效液相色谱（HPLC）特征图谱的差异。方法 以盐酸水解石斛多糖,水解产物加入1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）进行衍生化,采用HPLC法分析单糖的衍生物。色谱柱为Kromasil 100-5 C18（250 mm×4.6 mm,5 μm）;流动相为乙腈-0.02 mol·L-1的乙酸铵溶液（冰乙酸调pH=6.7）,梯度洗脱;检测波长为250 nm;柱温为30 ℃;流速为1 mL·min-1。采用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2004A版）生成对照图谱。结果 10批霍山石斛多糖柱前衍生特征图谱标示出6个特征峰,主要由D-甘露糖（71.8 %）与D-葡萄糖（27.2 %）组成,D-甘露糖与D-葡萄糖峰面积比值为2.05～3.71,此外含微量的D-半乳糖醛酸、D-半乳糖、D-木糖、D-阿拉伯糖。10批美花石斛多糖柱前衍生特征图谱亦标示出6个特征峰,主要为D-甘露糖（42.9 %）与D-葡萄糖（54.0 %）组成,D-甘露糖与D-葡萄糖峰面积比值为0.67～0.98,此外含微量的D-半乳糖醛酸、D-半乳糖、D-木糖、D-阿拉伯糖。与对照图谱比较,10批霍山石斛、美花石斛的相似度分别为0.994～1.000,0.934～1.000,霍山石斛与美花石斛共有模式之间的相似度为0.871。结论 该方法准确可靠,重复性好;两种石斛多糖构成差异较大,不宜混用。     

环草石斛试管苗生长节律及分级标准研究

目的 对不同生长时期的环草石斛试管苗进行生长动态及分级标准的研究,为试管苗各生长发育时期合理调控技术措施的确定提供科学依据.方法 采用常规方法,测定不同生长时期试管苗的生长指标、多糖及蛋白质的量,确定试管苗出瓶时间及分级标准.结果 播种生长12个月的时间内,5～8个月是环草石斛试管苗苗高和茎粗增长最快的时期;7～8个月时的试管苗生物量积累速率最高.环草石斛试管苗根与茎叶之比(R/T)相对较小,比值小于1.生长8个月时的试管苗多糖的量和可溶性蛋白质的量较高,7～8个月时的试管苗生长代谢旺盛.从干物质积累动态、多糖及蛋白质的量变化、试管苗活力和生产成本等方面综合考虑,环草石斛生长8～10个月的试管苗出瓶移栽较为合适.试管苗出瓶后分级再利用能够切实保证移栽成活率.以苗高、茎粗和根数作为分级指标,环草石斛试管苗可以分为3个等级.结论 环草石斛的种子质量对试管苗的生长影响较大,生长8～10个月的环草石斛试管苗出瓶移栽较为合适,以苗高、茎粗和根数作为分级指标,试管苗可以分为3个等级加以利用.     

西双版纳地区铁皮石斛及齿瓣石斛品质的初步研究

目的 对比铁皮石斛与其常用替代品在品质方面的差异.方法 采用苯酚-硫酸法与重量法,研究对比了西双版纳地区不同来源铁皮石斛及齿瓣石斛多糖含量及折干率的差异.结果 铁皮石斛的多糖含量及折干率分别为20.29%,20.16%,齿瓣石斛为16.93%,18.92%.结论 不同栽培类型的铁皮石斛存在品质差异;齿瓣石斛的野生苗品质优于组培苗.     

霍山石斛最佳采收期研究

 目的：探索霍山石斛采收期的选优方法，确定其最佳采收期。方法：按不同治疗目的，对各种化学成分及生物量采用加权累加及指数相乘和累加平均的数学方法，对霍山石斛不同生长期的产量、质量及功效进行综合评价。结果：算得霍山石斛1年～4年茎的综合采收指数分别为3.65，4.73，5.43，4.90。结论：若兼顾不同的治疗目的和产量因素，霍山石斛的采收期以第3年秋季最佳。     

疏花石斛中石斛多糖的提取工艺

目的:建立疏花石斛多糖提取优选方案。方法:采用传统水浸提法、纤维素酶法、超声辅助法和微波辅助法4种不同处理方法对疏花石斛多糖进行提取;多糖含量的测定用苯酚-硫酸法。结果:纤维素酶法较优方案为1∶30料液比,50℃,pH 4.5,200 U·mL-1作用2 h;微波辅助法较优方案为料液比1∶30、微波功率档位为中火、作用时间8 min预处理后,80℃浸提1.5 h;超声辅助法较优方案为料液比1∶30、超声功率300 W、超声处理6 min预处理后,80℃浸提1.5 h;传统水浸提法较优方案为料液比1∶30、温度80℃浸提1.5 h。结论:纤维素酶法提取疏花石斛多糖效果最佳,是多糖提取时的首选方案,传统水浸提法宜结合超声辅助法和微波辅助法。     

钩状石斛化学成分的研究

 目的分离鉴定钩状石斛中的化学成分。方法体积分数为95%乙醇提取,硅胶柱色谱分离,用IR,MS,¹H-NMR,¹³C-NMR和HMBC等方法确定结构。结果分得9个化合物,分别为对羟基顺式肉桂酸三十烷基酯(n-triacontyl p-hydroxy-cis-cin-namate,Ⅰ),对羟基反式肉桂酸三十烷基酯(defuscin,Ⅱ),β-谷甾醇(β-sitosterol,Ⅲ)、aduncin(Ⅳ)、dengibsinin(Ⅴ)、dengibsin(Ⅵ)、chrysotoxone(Ⅶ)、4-羟基-3-甲氧基苯甲酸(4-hydroxy-3-methoxybenzoicacid,Ⅷ)和胡萝卜苷(daucosterol,Ⅸ)。结论4-羟基-3-甲氧基苯甲酸为首次从石斛属植物中分离得到,化合物Ⅰ~Ⅲ,Ⅴ~Ⅸ均为首次从该种植物分得,化合物Ⅳ和Ⅴ的碳谱数据为首次报道。     

金钗石斛培养初步研究

目的筛选金钗石斛的适宜培养基,探索金钗石斛快速繁殖的途径。方法以取材部位、基本培养基、激素比例三因素进行正交试验。结果取材部位是最敏感的因素,其次是激素比例,基本培养基的影响相对较小。结论金钗石斛的适宜培养方案为MS培养基,附加6-BA2～5mg*L-1,NAA0.1～0.5mg*L-1,2000Lx光照10h*d-1,30d左右继代一次。     

两种石斛多糖提高小鼠免疫活性的初步研究

 目的 初步评价齿瓣石斛多糖和铁皮石斛多糖对小鼠免疫功能的影响。方法 体外培养小鼠脾淋巴细胞,观察齿瓣石斛多糖和铁皮石斛多糖分别与刀豆蛋白协同作用下对脾淋巴细胞增殖和细胞中γ-干扰素及白细胞介素-2含量的影响;动物实验中,分别灌胃给予不同剂量的齿瓣石斛多糖和铁皮石斛多糖,连续给药14 d后,复制绵羊红细胞致小鼠足肿胀模型,观察两种石斛多糖对小鼠足趾肿胀度和胸腺、脾脏指数的影响。结果 齿瓣石斛多糖和铁皮石斛多糖中剂量组均能显著刺激脾淋巴细胞的增殖,中、高剂量组均能促进脾淋巴细胞中γ-干扰素和白细胞介素-2的分泌;此外,两种石斛多糖高剂量组均可明显增加小鼠足趾肿胀度和脾脏指数,但各剂量组对小鼠胸腺指数无影响。结论 齿瓣石斛多糖和铁皮石斛多糖能一定程度上提高小鼠的免疫活性。     

石斛及石斛合剂对糖尿病模型大鼠糖脂代谢的调整作用

为研究石斛及石斛合剂治疗糖尿病的机理，Wistar大鼠按体重分层随机法分为正常组和造模组，造模组按体重顺序编号，奇数鼠采用高脂高糖饲养1个月后腹腔注射低剂量的STZ造模，分别以优降糖、降糖灵治疗；偶数鼠用高脂高糖饲养1个月，先予石斛，石斛合剂低、中、高剂量分别灌胃2d后。以上法造模，再予石斛、石斛合剂治疗。1个月后测定各组动物糖脂代谢指标并行胰腺组织病理检查。结果：石斛及石斛合剂具有显著降低造模大鼠的血糖、三酰甘油、胆固醇、糖化血红蛋白，综合作用优于两西药对照组；低、中剂量石斛合剂提高胰岛素含量；石斛、高剂量石斛合剂增加外周组织胰岛素敏感性；石斛合剂各组可显著改善造模大鼠胰岛组织结构。结论：保护和修复胰岛组织结构，促进胰岛素分泌，增加外周组织对胰岛素的敏感性，可能是石斛及其制列治疗糖尿病的机理之一。