日本血吸虫腺嘌呤磷酸核糖转移酶基因的克隆、表达及虫期表达差异分析

目的克隆和表达日本血吸虫腺嘌呤磷酸核糖转移酶基因1(SjAPRT1),并研究该基因在日本血吸虫不同发育阶段的转录和蛋白表达情况。方法根据SjAPRT1基因序列(GenBank登录号为AAW24796)设计引物,RT-PCR扩增目的基因,分析其在日本血吸虫各发育阶段转录本差异。将目的基因亚克隆至载体pET28a(+),转化至大肠埃希菌BL21(DE3)菌株,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,组氨酸亲和层析法纯化表达产物,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析纯化结果。纯化的蛋白SjAPRT1免疫新西兰白兔制备免疫兔血清,蛋白质印迹(West-ern blotting)分析其免疫反应性及其在日本血吸虫不同发育阶段表达的差异。结果在虫卵、尾蚴、童虫和成虫期均检测到SjAPRT1转录本(561 bp),获得了重组SjAPRT1蛋白。Western blotting分析表明,纯化的重组蛋白SjAPRT1可被日本血吸虫感染兔血清识别,虫卵、童虫和成虫粗抗原可被SjAPRT1免疫兔血清识别,在Mr 25 000处有特异性条带。结论日本血吸虫SjAPRT1蛋白在虫卵、童虫和成虫各期均有表达...     

日本血吸虫果糖二磷酸醛缩酶的重组表达及其在血吸虫生活史各阶段的表达分析

目的 目的 在大肠杆菌中原核表达、 纯化日本血吸虫果糖二磷酸醛缩酶 （rSjFBPA）, 观察其在血吸虫生活史各阶段 的表达。方法 方法 以日本血吸虫成虫cDNA为模板扩增rSjFBPA基因, 克隆至pET28a （+） 质粒后, 再转化入E. coli BL21。 含重组质粒的菌株经IPTG诱导后, 采用SDS?PAGE和Western blotting分析鉴定重组蛋白rSjFBPA是否表达, 用层析法纯 化rSjFBPA并用SDS?PAGE鉴定其纯度。同时, 用RT?PCR方法分析SjFBPA在血吸虫尾蚴、 童虫、 成虫和虫卵各阶段的表 达情况。结果 结果 经PCR扩增出目的基因, 含目的基因的TA克隆质粒经双酶切和测序鉴定, 证明插入片段与预期目的基 因序列相符。Western blotting结果显示, 表达后的重组蛋白可与His?tag单克隆抗体发生特异性反应。经镍亲和层析法 制备了纯化的重组SjFBPA蛋白, 纯化重组蛋白浓度达4 mg/ml。RT?PCR结果显示, SjFBPA在日本血吸虫尾蚴、 童虫、 成 虫和虫卵阶段均有表达。 结论 结论 SjFBPA基因被成功克隆和表达, 其在日本血吸虫尾蚴、 童虫、 成虫和虫卵各阶段均有表 达。     

日本血吸虫Toll样受体相互作用蛋白 基因的克隆 表达及鉴定

目的克隆、表达日本血吸虫Toll样受体相互作用蛋白（SjTollip）基因,并研究该基因在日本血吸虫各虫期的转录表达情况。方法从日本血吸虫cDNA文库中挑出Toll样受体相互作用蛋白基因进行体外扩增,并克隆入原核表达载体pET-28a,转化大肠埃希菌BL21（DE3）,异丙基-β-D硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,用组氨酸标签亲和层析法纯化表达产物。制备日本血吸虫各虫期阶段总RNA和重组SjTollip蛋白免疫新西兰白兔的免疫兔血清,利用RT-PCR和蛋白质免疫印迹分析SjTollip基因在日本血吸虫各期转录表达的差异及重组SjTollip蛋白的免疫原性。结果构建了重组原核表达载体SjTollip/pET-28a,诱导获得以包涵体形式表达的不可溶重组蛋白,相对分子质量约为24000,与预测的融合蛋白相对分子质量相符。纯化后的重组蛋白rSjTollip可被日本血吸虫感染兔血清识别。虫期转录特异性分析显示,该基因在尾蚴和雄虫中转录水平较低。免疫印迹分析结果显示,在虫卵、尾蚴、童虫、雄虫、雌虫各发育阶段都检测到该蛋白,但童虫和雌虫中表达水平明显升高。结论 SjTollip基因在日本血吸虫各发育阶段转录表达水平有较大差异,其有可能成为潜在的日本血吸虫病疫苗候选抗原和药物及诊断靶点。     

日本血吸虫TOM34基因的克隆和表达分析

目的 克隆、表达日本血吸虫线粒体外膜转运酶34基因(SjTOM34),并对其生物特性进行初步研究。方法 应用RT-PCR方法从42 d日本血吸虫成虫cDNA中扩增SjTOM34基因,并进行生物信息学分析。应用实时定量RT-PCR方法分析了SjTOM34基因在日本血吸虫不同发育阶段虫体中的表达状况。构建了SjTOM34基因重组原核表达质粒,并在大肠杆菌中进行表达,Western blotting分析了重组抗原的免疫原性及该蛋白在不同发育阶段虫体中的表达情况,利用免疫组化方法观察了该蛋白在虫体内的分布情况。结果 获得了SjTOM34的基因序列,其开放阅读框(ORF)为1 083 bp。该基因在所检测的不同发育阶段童虫和成虫中均有表达,其中在35 d虫体中的表达量略高于其他时期的虫体。成功构建了重组的原核表达质粒并且在大肠杆菌中获得表达,重组蛋白在上清和沉淀中都有存在,并且具有较好的免疫原性,在所检测的各时期虫体中均可检测到该蛋白的存在,并且主要分布在虫体的实质组织中。结论 获得了日本血吸虫SjTOM34基因,初步明确了该基因在日本血吸虫童虫和成虫中的表达情况,及在成虫中的分布。     

几种日本血吸虫新基因的表达特性分析

目的　对从日本血吸虫尾蚴cDNA文库中筛选出的 3种新基因 ,腺苷酸激酶 (AK)、蛋白酶体激活因子PA2 8β亚单位 (PA2 8)、8kDa钙结合蛋白 (CBP)基因进行表达特性研究。方法　分别提取雌雄成虫、尾蚴、断尾童虫的总RNA ,利用RT-PCR酶混合物试剂盒 ,一步法对总RNA进行反转录及PCR扩增。结果　AK及PA2 8蛋白基因可以在雌雄成虫、尾蚴、断尾童虫体内表达 ,CBP只在尾蚴及断尾童虫中表达。结论　所筛到的AK、PA2 8、CBP基因均是日本血吸虫特异基因 ,AK及PA2 8基因可以在雌雄成虫、尾蚴、断尾童虫体内表达 ,CBP可能是日本血吸虫尾蚴、童虫的期特异性基因     

日本血吸虫VCP基因的克隆表达及其在不同生活史期的mRNA表达水平

目的 目的 从原核表达日本血吸虫含缬酪肽蛋白 （VCP） 基因, 并分析其在不同生活史期的mRNA表达水平。方法 方法 提取日本血吸虫虫卵RNA, 逆转录为cDNA, PCR扩增日本血吸虫VCP基因, 亚克隆至原核表达载体pET15b; 重组质粒转 化入E. coli BL21, 异丙基硫代半乳糖苷 （IPTG） 诱导目的基因表达, 并采用包涵体纯化方法获取重组蛋白, 产物行十二烷基 硫酸钠?聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS?PAGE） 进行分析鉴定。提取日本血吸虫尾蚴、 童虫、 雌虫、 雄虫、 虫卵RNA, DNase消化, 纯化后逆转录为cDNA, 采用荧光实时定量PCR分析VCP基因在上述生活史期的表达水平。结果 结果 PCR扩增获得日本血 吸虫VCP基因, 经重组质粒表达和包涵体纯化成功获得重组蛋白。荧光实时定量PCR检测发现, 日本血吸虫VCP基因在 尾蚴中的mRNA表达水平最高, 在童虫、 虫卵、 雄虫、 雌虫中表达水平较低。结论 结论 获得日本血吸虫VCP基因编码的重组 蛋白; 日本血吸虫VCP基因mRNA在尾蚴阶段表达水平最高, 在童虫、 虫卵、 雄虫、 雌虫中表达水平较低。。     

日本血吸虫弹性蛋白酶基因的克隆、表达及虫期特异性转录

目的 克隆和表达日本血吸虫弹性蛋白酶基因（SjCE-2b），纯化表达重组蛋白，并研究该基因在各虫期的转录情况。 方法 预测SjCE-2b基因的编码序列。绘制血吸虫尾蚴弹性蛋白酶家族成员系统进化树。用RT-PCR和蛋白质印迹（Western blotting）分析SjCE-2b基因在日本血吸虫各期转录的差异。将RT-PCR扩增得到的SjCE-2b基因亚克隆至载体pET28b，在大肠埃希菌中诱导表达得到重组蛋白rSjCE-2b，用组氨酸标签亲和层析法纯化表达产物，Western blotting分析其免疫原性。 结果 在虫卵、子胞蚴和成虫检测到SjCE-2b基因转录本（714 bp），表达的重组蛋白rSjCE-2b，相对分子质量约为Mr 31 000，与预测的融合蛋白相对分子质量相符。构建了重组原核表达载体SjCE-2b/pET28b，并在大肠埃希菌中表达。纯化后的重组蛋白rSjCE-2b可被日本血吸虫感染的兔血清识别。 结论 在日本血吸虫虫卵、子胞蚴和成虫发现SjCE-2b基因转录本。SjCE-2b基因有可能成为潜在的日本血吸虫病疫苗候选抗原和药物及诊断靶点。     

重组日本血吸虫铁蛋白的表达纯化及诱导小鼠保护性免疫研究

目的　表达、纯化重组日本血吸虫铁蛋白 ,观察其免疫小鼠后抗日本血吸虫的免疫保护作用。方法　用基因重组技术 ,将日本血吸虫铁蛋白基因亚克隆至表达载体 pGMC上 ;在IPTG诱导下 ,重组日本血吸虫铁蛋白得到高效表达 ;用电泳层析法分离纯化日本血吸虫铁蛋白 ;用SDS -PAGE和Western -blot鉴定表达纯化产物 ;用纯化的重组铁蛋白免疫小鼠三次 ,分别在 0、2、4周进行。第 6周每鼠经腹部感染 4 0± 1条日本血吸虫尾蚴。 4 2天后剖杀冲虫 ,计数虫数及肝卵数。结果　纯化的重组铁蛋白分子量为 4 0kD ,具有较好的免疫原性 ,能被日本血吸虫感染兔血清识别。与对照组相比 ,纯化重组铁蛋白免疫小鼠组的减虫率为 2 4 5 % ,减卵率为 4 5 8%。结论　重组日本血吸虫铁蛋白不仅在大肠杆菌中得到高效表达 ,而且纯化的铁蛋白分子能诱导抗日本血吸虫病的保护性免疫。     

日本血吸虫促凋亡基因SjBAD的初步研究

目的了解日本血吸虫促凋亡基因Sj BAD的生物学、免疫学和转录表达特征,评估Sj BAD重组蛋白作为日本血吸虫病疫苗候选分子的潜力。方法根据Sj BAD的参考序列设计引物,应用PCR技术扩增Sj BAD基因,构建重组表达质粒p ET-28a(+)-Sj BAD。采用实时定量PCR检测Sj BAD基因在日本血吸虫不同发育期及42 d雌、雄虫体内的转录水平;应用Western blotting和间接ELISA法分析Sj BAD重组蛋白的抗原性和免疫原性。用重组抗原Sj BAD免疫BALB/c小鼠,通过计算减虫率及肝脏减卵率,评估重组抗原作为血吸虫病候选疫苗分子的潜力。结果成功克隆了日本血吸虫Sj BAD基因,构建了重组表达质粒p ET-28a(+)-Sj BAD,并在大肠杆菌中成功表达,重组蛋白分子量约为22 k Da。Western blotting表明Sj BAD具有较好的抗原性和免疫原性,间接ELISA法检测表明重组蛋白免疫小鼠产生了高水平的特异性抗体Ig G。实时定量PCR检测发现Sj BAD基因在日本血吸虫的各个发育阶段均有转录,以14 d表达量最高,且在雄虫体内的表达量高于雌虫。两次动物免疫试验表明,重组蛋白Sj BAD在BALB/c小鼠体内诱导了30.82%和27.87%的减虫率,及42.52%和45.84%的肝脏虫卵减少率,均显著高于PBS对照组(P均0.05)。结论成功克隆、表达了日本血吸虫促凋亡相关基因Sj BAD,该基因在日本血吸虫不同发育期虫体内均有表达。纯化的重组Sj BAD蛋白在小鼠体内能诱导产生部分抗血吸虫感染的免疫保护效果。     

日本血吸虫嗜肌素样蛋白编码基因的克隆表达及其免疫原性研究

目的克隆和表达日本血吸虫嗜肌素样蛋白(SjcMLP)编码基因,并研究其重组抗原的免疫原性。方法PCR扩增SjcMLP编码基因,并亚克隆人表达载体pQE30。将重组表达质粒pQE 30-SjcMLP转入宿主菌E. coli M15,异丙基-βD-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,用金属Ni螯合物亲和层析柱(Ni-NTA)纯化SjcMLP重组蛋白(reSjcMLP)。纯化的reSjcMLP采用十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹试验(Western blot)作进一步分析。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定用reSjcMLP免疫C57BL/6小鼠血清中的抗体水平。结果 SDS-PAGE分析表明获得的重组抗原的大小约24.8 kDa,与预的融合蛋白大小相符。Western blot昱示该重组抗原能被日本血吸虫尾蚴感染兔血清识别。用该重组抗原包被进行ELISA检测,免疫血清滴度高达1：12 800。但动物免疫试验结果减虫效果不明显。结论SjcMLP编码基因以可溶性融合蛋白的形式得到表达,动物免疫试验未诱导出明显的保护力     

日本血吸虫P7抗原的克隆表达、虫期特异性分析以及早期诊断价值的研究

目的克隆表达日本血吸虫(Schistosoma japonicum)P7抗原片段(GenBank登录号为EU121231),研究各虫期中该目的片段的转录和表达情况,初步评价其作为早期诊断抗原的潜力。方法将日本血吸虫童虫cDNA文库中免疫筛选出的阳性克隆P7进行体外扩增,将目的基因亚克隆至原核表达载体pET28a中。用双酶切的方法鉴定重组质粒,将阳性重组质粒转化至大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3)感受态细胞中,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达并纯化。用蛋白质印迹(Western blotting)分析初步鉴定表达产物的免疫诊断价值。利用逆转录PCR和Westernblotting分析检测P7片段在日本血吸虫各个虫期中的转录和表达情况。以P7重组蛋白为抗原用间接ELISA检测感染日本血吸虫后14 d的兔血清(18份),日本血吸虫病(28份)、华支睾吸虫病(30份)和卫氏并殖吸虫病(20份)患者血清,以及健康人血清(30份),计算特异性和敏感性。结果成功构建了重组表达载体P7/pET28a,并在E.coli中表达。Western blotting分析结果显示P7重组蛋白能被感染日本血吸虫后...     

日本血吸虫SjIM基因克隆表达及动物免疫保护评估

目的 克隆并表达日本血吸虫肌醇单磷酸酶(SjIM)编码基因cDNA,评估该重组抗原抗血吸虫感染的免疫保护效果.方法 以日本血吸虫42d虫体cDNA为模板,经PCR扩增编码SjIM蛋白的开放阅读框(ORF)基因片段.采用荧光实时定量PCR分析该基因在童虫和成虫的表达情况.以pET28a(+)为载体构建重组表达质粒,经异丙基- β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导,制备重组SjIM蛋白.Western blotting检测重组蛋白的抗原性与免疫原性,利用重组SjIM抗原免疫小鼠评估其免疫保护效果.结果 获得了编码SjIM基因ORF的cDNA片段,ORF长度为834 bp,编码278个氨基酸.荧光实时定量PCR显示该基因在35 d虫体中表达量最高.获得了SjIM重组蛋白,其具有良好的免疫原性.免疫组小鼠获得48.76％的减虫率和41.29％的肝脏减卵率.结论 获得了日本血吸虫SjIM基因ORF的cDNA序列,并制备了重组SjIM蛋白,该重组抗原在小鼠体内能诱导产生部分抗血吸虫感染的免疫保护效果.     

日本血吸虫凋亡诱导因子SjAIF功能区片段的克隆及表达分析

目的 克隆表达日本血吸虫凋亡诱导因子(SjAIF)功能区片段,并对其生物学特性进行初步分析。方法 应用PCR技术扩增日本血吸虫凋亡诱导因子的功能区片段,构建原核重组表达质粒并诱导其表达,实时定量PCR分析其在不同发育时期童虫和成虫的转录水平,通过Western-blot和间接ELISA法分析重组蛋白的抗原性和免疫原性,应用免疫组化分析该蛋白在虫体内的分布情况。结果 克隆了SjAIF功能区片段,大小为831 bp。成功构建了原核重组表达质粒pET-28a(+)-SjAIF,并在大肠杆菌中获得表达,重组蛋白分子量35 kD。实时定量PCR分析表明SjAIF基因在童虫和成虫的各个发育阶段均有转录,其中7 d~21 d虫体表达量较低,42 d和28 d虫体表达量较高,雌虫表达量高于雄虫。重组蛋白具有较好的抗原性和免疫原性,免疫小鼠后诱导产生了较高水平的特异性IgG抗体。该蛋白主要存在于日本血吸虫体被,少部分分布于实质组织中。结论 成功表达了SjAIF基因的功能区片段,对其生物学特性进行了初步分析,为进一步研究该基因生物学功能和作用提供了基础。     

日本血吸虫高速泳动家族B1蛋白基因的克隆 表达与功能分析

目的 目的 克隆、 表达日本血吸虫高速泳动家族B1蛋白 （SjHMGB1）, 并研究其功能特性。方法 方法 利用逆转录PCR （RT?PCR） 技术从日本血吸虫成虫mRNA中反转录扩增出编码SjHMGB1的完整开放阅读框DNA片段, 然后将其亚克隆至 原核表达载体质粒pET28a （+） 中, 构建重组表达质粒SjHMGB1?pET28a。将重组表达质粒转化大肠埃希菌BL21 （DE3）, 含 重组质粒的转化子细菌经异丙基硫代半乳糖苷 （IPTG） 诱导以表达重组SjHMGB1蛋白。通过镍螯合琼脂糖亲和胶亲和层 析法制备纯化的重组SjHMGB1蛋白。通过DNA迟滞实验和动物免疫鉴定重组SjHMGB1的DNA结合和免疫学特性。通 过免疫印迹试验 （Western blotting） 和RT?PCR确定SjHMGB1分子在日本血吸虫不同发育阶段的表达情况。以重组SjH? MGB1为抗原免疫小鼠, 3次免疫后每只小鼠感染45±2条血吸虫尾蚴, 42 d后剖杀, 计算减虫率与减卵率, 观察其诱导抗血 吸虫感染的免疫保护性作用。 结果 结果 采用RT?PCR法从日本血吸虫成虫mRNA中反转录扩增到长度约为530 bp的特异性 DNA条带, 序列分析证实为编码SjHMGB1蛋白的开放阅读框序列。将此片段亚克隆至表达质粒pET28a （+） 中, 成功构建 了重组表达质粒SjHMGB1?pET28a。含重组表达质粒SjHMGB1?pET28a的转化子细菌经IPTG诱导能表达分子量约28 kDa 的可溶性SjHMGB1蛋白。采用镍螯合亲和层法制备了纯化的重组SjHMGB1蛋白。DNA迟滞试验显示纯化的Sj HMGB1 蛋白可同超螺旋及线性DNA结合, 重组SjHMGB1免疫小鼠能产生高效价的抗体IgG, Western blotting分析证实重组SjH? MGB1蛋白能被重感染小鼠血清所识别, 表明重组表达的SjHMGB1分子具有天然蛋白的功能活性与免疫学特性。RT?PCR 和Western blotting分析显示SjHMGB1分子在血吸虫成虫和虫卵期大量表达, 而在尾蚴阶段表达量极低。免疫保护性试验 结果表明, 重组SjHMGB1分子免疫不能诱导有效的抗血吸虫感染免疫保护性作用。结论 结论 获得了编码SjHMGB1基因和 纯化的具有天然功能活性的重组SjHMGB1蛋白; 重组SjHMGB1蛋白具有强烈的免疫原性, 但不能诱导有效的抗血吸虫感 染免疫保护性作用。     

日本血吸虫凝溶胶蛋白的克隆、表达及转录时相分析

目的 构建日本血吸虫凝溶胶蛋白(Sjgelsolin)的原核表达载体,获得其表达产物并分析其在不同发育阶段的转录水平.方法 根据序列AY814387设计引物,体外扩增Sjgelsolin的蛋白质编码序列,将其插入pET28a(+)质粒,转化至大肠埃希菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达.提取日本血吸虫虫卵,尾蚴,7-d童虫,42-d雌、雄成虫的总RNA,用半定量RT-PCR分析Sj gelsolin在每个样本中的转录水平.结果 成功构建了pET28a(+)-Sjgelsolin重组质粒,并获得高水平的表达.Sjgelsolin转录子在尾蚴和雌虫成虫中未被检测到,而在7-d童虫和42-d雄虫成虫中被检测到.结论 Sjgelsolin在体外获得表达,且其转录是受发育调控的.     

日本血吸虫硫氧还蛋白编码基因的克隆和表达

目的克隆和表达日本血吸虫大陆株硫氧还蛋白(SjcTrx)的编码基因。方法根据日本血吸虫菲律宾株硫氧还蛋白基因序列设计一对引物,上游引物引入BamHI酶切位点和起始密码子ATG,下游引物引入SalI酶切位点和终止密码子TAA。以日本血吸虫大陆株成虫总RNA为模板,经反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增SjcTrx基因。经双酶切并纯化的PCR产物与同样双酶切并纯化的pET28a质粒DNA片段用T4 DNA连接酶连接,构建重组质粒pET28a-SjcTrx,转化BL21感受态菌并大量扩增。重组质粒DNA经限制性内切酶双酶切、PCR、琼脂糖凝胶电泳和核苷酸序列测定进行鉴定。pET28a-SjcTrx/BL21用IPTG诱导表达。结果SjcTrx编码基因RT-PCR产物约334 bp,构建的重组pET28a-SjcTrx表达质粒DNA经限制性内切酶双酶切和PCR扩增产物于琼脂糖凝胶电泳均观察到相同大小基因片段。根据核苷酸序列测序结果推导的氨基酸序列与日本血吸虫菲律宾株和曼氏血吸虫Trx分别有97%和43%的同源性。表达的重组蛋白经SDS-PAGE分析,约14kDa。Western blotting显示该重组蛋白可被日本血吸虫感染兔血清和重组抗原免疫小鼠血清所识别。结论SjcTrx基因的表达获得成功,并获得纯化蛋白,为开展动物保护性免疫试验创造了条件。     

日本血吸虫腺苷酸激酶基因的表达及其重组蛋白免疫反应性的评价

目的　将亚克隆入 pET3 2a( +)质粒的日本血吸虫腺苷酸激酶 (adenylatekinase ,AK )基因进行表达及蛋白纯化 ,并对表达产物的免疫反应性进行评价。　方法　将重组表达质粒 pET3 2a( +) AK转入宿主菌大肠埃希菌BL2 1,异丙基 β D 硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导表达后超声裂菌 ,离心 ,取上清进行十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE) ;将SDS PAGE后的蛋白转移至聚偏二氟乙烯 (PVDF)膜上 ,分别用 6 组氨酸 ( 6 His)抗体、日本血吸虫尾蚴感染6wk的兔血清及紫外照射减毒尾蚴免疫的兔血清为一抗进行蛋白质印迹试验 (Westernblotting) ;用金属Ni螯合物亲和层析树脂 (Ni NTA)层析柱纯化目标蛋白 ;以纯化后的融合蛋白为包被抗原 ,酶联免疫吸附测定 (ELISA)检测正常兔血清和血吸虫感染兔血清。　结果　重组菌用IPTG诱导表达后进行SDS PAGE ,于相对分子质量 (Mr) 40 0 0 0处见一特异表达带 ,与预期表达的融合蛋白大小相符 ;Western印迹分析显示该重组的融合蛋白带有预期的 6 His基团 ,且能与尾蚴感染兔血清及紫外照射减毒尾蚴免疫的兔血清发生特异性反应 ;ELISA结果显示纯化的重组AK蛋白可以特异识别血吸虫感染兔血清。　结论　AK基因在工程菌中以可溶性融合蛋白的形式得到表达 ,该重组蛋白与血吸虫感染兔血清及紫外照射减毒尾蚴免疫的兔血清具有特异的免疫反应性。     

日本血吸虫超氧化物歧化酶的表达与免疫活性鉴定

目的表达日本血吸虫胞浆内超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD),并研究其免疫原性。方法采用反转录PCR方法从血吸虫成虫mRNA中扩增出SOD基因序列,再亚克隆到表达载体pGEX-4T-3中构建重组表达质粒并转化到E.coli BL21(DE3)中。用IPTG对含有重组质粒的转化子细菌进行诱导表达重组的GST-SOD蛋白。用重组GST-SOD蛋白免疫小鼠制备免疫血清,并用免疫印迹试验观察重组GST-SOD融合蛋白的免疫原性。结果 日本血吸虫胞浆内SOD基因被成功地扩增,并构建成功含此基因的重组表达质粒Sj SOD-pGEX-4T-3。含重组质粒的E. coli在IPTG的诱导下能表达一大小约43 kDa的GST-SOD重组蛋白。用此蛋白免疫小鼠产生的特异性抗体水平最高能达1: 12 800,该萤组蛋白可以被血吸虫重感染兔血清所识别。结论 日本血吸虫中国大陆株胞浆内SOD表达成功,并具有良好的免疫原性。     

日本血吸虫信号通路相关基因SjWD101的生物信息学分析及其克隆与表达

目的利用生物信息学方法分析日本血吸虫SjWD101的结构和功能特征,并利用基因工程技术进行克隆和表达,获得相应的重组蛋白。方法从日本血吸虫GenBank数据库中筛选WD家族蛋白中全长基因,用相关软件进行生物信息学预测。通过RT-PCR扩增出全长编码区序列,克隆到表达载体pET-28a(+)中,在大肠杆菌BL21中经IPTG诱导表达,表达产物用镍离子金属螯合剂亲和层析柱纯化并经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白印迹(Western blotting)鉴定。结果SjWD101是一个全长1085bp的基因,编码区为66～950,编码294个氨基酸,软件分析表明其理论分子量和等电点分别是31819.7Da和6.44.亚细胞定位分析表明该蛋白是胞浆蛋白,理化性质较稳定。二级结构以反向平行的β折叠为主。含有6个WD40结构域,属于WD蛋白家族中的一员,具有GTP结合蛋白的结构特征。经PCR、双酶切和测序证实pET-28a(+)-SjWD101构建成功。SDS-PAGE和Western blotting证实重组菌成功表达出融合蛋白,经His亲和层析柱获得了纯化的重组蛋白,Western blotting证实WD101重组蛋白能被感染日本血吸虫的兔血清识别。结论日本血吸虫WD101经生物信息学预测为WD家族蛋白,可能在血吸虫信号转导通路方面有其一定作用,本研究获得了纯化的重组蛋白,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

筛选和鉴定与东方田鼠抗性基因ILKAP表达蛋白相互结合的日本血吸虫童虫蛋白

目的筛选和鉴定与东方田鼠抗性基因整合素连接激酶相关丝氨酸/苏氨酸磷酸酶(ILKAP)表达蛋白相互结合的日本血吸虫童虫蛋白。方法提取东方田鼠骨髓细胞蛋白和日本血吸虫童虫蛋白,进行免疫共沉淀,实验组为东方田鼠骨髓蛋白+日本血吸虫童虫蛋白+ILKAP抗体+磁性珠子,阴性对照组以兔IgG抗体代替ILKAP抗体,阳性对照组为东方田鼠骨髓蛋白或日本血吸虫童虫蛋白。十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对免疫沉淀复合物进行分离,切取差异性蛋白条带通过基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪(MALDITOF-MS)鉴定,获得的混合物肽片段利用Mascot软件进行分析检索。分别以东方田鼠骨髓cDNA和日本血吸虫童虫c DNA为模板, RT-PCR扩增东方田鼠ILKAP (Mf ILKAP)基因和日本血吸虫表膜抗原(Sj TA)基因。将Mf ILKAP和Sj TA基因分别克隆至真核表达载体Flag-pCMV-2b和Myc-pcDNA3.1/(-) b中,构建的重组质粒FlagILKAP-pCMV-2b和Myc-TA-pcDNA3.1/(-) b共转染至HEK293T细胞中作为实验组,设阴性对照组Myc-TApcDNA3.1/(-) b或Flag-ILKAP-pCMV-2b和空白对照组Myc-pcDNA3.1/(-) b或Flag-pCMV-2b。用抗体Myc、 Flag以及ILKAP分别与转染后的HEK293T细胞总蛋白进行免疫共沉淀和蛋白质印迹(Western blotting)分析。结果东方田鼠骨髓细胞蛋白和日本血吸虫童虫蛋白经过免疫共沉淀实验,结果显示,实验组与阴性对照组、阳性对照组相比,有差异条带。经MAIDI-TOF-MS鉴定,利用Mascot软件中的串级质谱数据搜索功能进行搜索鉴定,鉴定出与东方田鼠ILKAP抗体相互作用的日本血吸虫童虫蛋白8种。RT-PCR结果显示, ILKAP和TA在东方田鼠骨髓和日本血吸虫童虫中均有表达,东方田鼠骨髓ILKAP的扩增产物为1 100～1 200 bp,理论值为1 147 bp,日本血吸虫童虫TA基因的扩增产物大小为500～600 bp,理论值为561 bp。质粒pCMV-Tag 2b、 pcDNA3.1/myc-His (-) b经酶切后,均有单一条带,分别约为4 300、 5 500 bp;重组质粒Flag-ILKAP-pCMV-2b经酶切鉴定后,其大小分别为4 300和1 147 bp, Myc-TA-pcDNA3.1/(-) b经酶切鉴定后,其大小分别为5 500和561 bp。Western blotting分析结果显示,两种重组真核表达载体共转染实验组的PVDF膜分别与Myc、 Flag以及ILKAP抗体孵育后有条带出现,而其他对照组无条带出现。结论鉴定出与Mf ILKAP抗体相互作用的日本血吸虫童虫蛋白8种,在HEK293T细胞中共表达了与Mf ILKAP结合的Sj TA基因, Mf ILKAP与Sj TA之间存在直接相互作用。