创建酿酒酵母细胞工厂发酵生产羽扇豆醇

羽扇豆醇、桦木酸等羽扇豆型三萜化合物具有抗HIV、抗肿瘤等多种生物学活性,其中羽扇豆醇为这类化合物的基本前体。为了实现羽扇豆烷型三萜的异源发酵法生产,研究首先运用高通量同源重组法在酿酒酵母中进行萜类甲羟戊酸(MVA)途径的一步法调控,以提高三萜通用前体鲨烯的供给;在进一步工作中,拟南芥来源的羽扇豆醇合成酶基因(At LUP)被整入三萜底盘菌株中实现羽扇豆醇酵母人工细胞工厂的创建。结果表明该实验能一次完成MVA途径的7个基因的整合,组装总长度达到20kb,同时多倍化MVA途径能显著提高鲨烯产量约500倍,达到354.00 mg·L~(-1);At LUP基因在染色体上整合后获得的工程菌NK2-LUP在摇瓶中发酵能生产8.23 mg·L~(-1)羽扇豆醇。该研究可为在酵母中实施大规模生物合成途径组装提供技术支持,同时为进一步获高产羽扇豆烷型三萜的人工酵母细胞提供了重要基础。     

动态调控酿酒酵母ERG20基因表达提高单萜化合物的生产北大核心CSCD

单萜类化合物被广泛应用于化妆品、食品、医药、农业等领域。随着合成生物学的发展,利用合成生物学技术创建"微生物细胞工厂"进行单萜类化合物生产被认为是一种非常有潜力的方式。然而,在酿酒酵母中牻牛儿基焦磷酸(GPP)和法尼基焦磷酸(FPP)是由一种双功能酶法尼基焦磷酸合成酶(ERG20基因编码)连续催化产生,而且ERG20更加倾向于合成酵母生长必需的FPP,因此合理控制FPP合成是在酵母细胞工厂中实现单萜高效合成的基础。为了实现酿酒酵母工程菌中生物合成GPP到FPP的动态节流,该研究应用基因编辑技术将底盘菌HP001的ERG20的启动子替换为环氧鲨烯环合酶(ERG1基因编码)启动子pERG1,获得新型单萜底盘菌HP001-pERG1-ERG20。进一步,分别利用以GPP和橙花基焦磷酸(NPP,cis-GPP)为底物的生物合成途径对底盘菌生产能力进行了验证,其中以GPP为前体的芳樟醇产量达到7.6 mg·L^(-1),提升了42.5%;以NPP为前体的橙花醇的产量达到8.3 mg·L^(-1),提升了1436.4%。该研究为微生物发酵法生产单萜化合物提供了基础。     

唐古特大黄蒽醌代谢物合成前体的研究

目的:探索唐古特大黄蒽醌代谢物可能的前体,初步判断其合成途径。方法:选用唐古特大黄种子萌发的无菌苗为材料,诱导愈伤组织,研究添加不同前体、不同饲喂时间对唐古特大黄愈伤组织和成体大黄蒽醌产量的影响。结果:乙酸对蒽醌产量的促进作用最大,在愈伤组织中达到了43.9%的增幅,在成体大黄中达到了45.8%;丙二酸其次,在愈伤组织中的增幅达到了15.8%,但在成体大黄中却只有3.6%的增长。苯甲酸和对苯醌对蒽醌产量无明显影响,莽草酸和α-酮戊二酸对蒽醌产量反而有一定的抑制作用。36 h是比较合适的饲喂时间,可将前体的饲喂效果充分发挥出来。结论:乙酸是唐古特大黄蒽醌代谢物合成的前体,它能大幅度的提高愈伤组织和成体大黄中蒽醌的产量,并由此推断出唐古特大黄蒽醌代谢物的合成途径是多酮合成途径。     

葫芦二烯醇的异源高效合成研究

葫芦二烯醇具有抑制炎症和抗癌活性,同时为罗汉果甜苷和葫芦素等重要中药有效成分生物合成途径中的基本前体。为获得高效生产葫芦二烯醇的酿酒酵母细胞工厂,该研究首先从罗汉果中克隆到葫芦二烯醇合酶(CBS)基因,通过在三萜化合物底盘菌WD-2091中异源表达和发酵后,产物经过GC-MS鉴定获得产量为27.44 mg·L~(-1)工程菌。再进一步调控工程菌中葫芦二烯醇合酶基因表达,最终成功获得葫芦二烯醇提高202.07%,产量为82.89 mg·L~(-1),高密度发酵达到1 724.10 mg·L~(-1)的酿酒酵母细胞工厂313-SL-CB。该研究为推动葫芦烷型四环三萜生物合成途径解析及高效细胞工厂创建提供了基础。     

紫杉醇前体生物合成途径及生物技术研究进展

紫杉醇因其特殊的抗肿瘤作用成为当今天然产物研究的热门方向.综述了紫杉醇前体的生物合成途径及途径上的酶和基因;利用红豆杉愈伤组织和细胞培养生产紫杉醇的方法;前体饲喂提高细胞紫杉醇产量、通过内生真菌发酵生产紫杉醇及红豆杉遗传转化获取优质药源等相关研究.最后提出代谢工程策略是可能解决紫杉醇药源缺乏的理想途径.     

岗梅转录组及其乌索烷型三萜皂苷生物合成相关酶基因的发掘

目的：发掘与岗梅乌索烷型三萜皂苷生物合成相关的酶基因。方法：利用Illumina 测序平台对岗梅根进行转录组测序,通过基因注释、同源分析、系统发生分析等生物信息学手段,发掘可能参与合成的单基因簇（Unigenes）。结果：在岗梅根转录组中发现了272 条与萜类生物合成相关的Unigenes。这其中包括72 条可能参与萜类生物合成上游途径的Unigenes,以及26 条可能与三萜合成途径下游母核合成、氧化和糖基化相关的Unigenes。对其中部分Unigenes 进行系统发生分析,进一步揭示了这些Unigenes 与同源基因间的进化关系。利用酵母表达系统,鉴定了两个香树酯醇合酶IaAS1 和IaAS2,其中IaAS1 为少数以α-香树脂醇为主要产物的香树酯醇合酶之一。结论：本文从岗梅根转录组数据库中发掘到一系列可能与岗 梅乌索烷型三萜皂苷生物合成相关的酶基因。对这些基因的进一步研究,有助于从分子水平揭示岗梅中乌索烷型三萜皂苷的生物合成途径。     

酵母提取物对颠茄毛状根氮代谢及次生代谢影响的机制探究

以颠茄毛状根为试验材料,向培养基中添加酵母提取物(yeast extract,YE),测定颠茄毛状根氮代谢关键酶的活性,各形态氮的含量,次生代谢前体物质含量,次生代谢途径中关键酶基因相对表达量以及主要托品烷类生物碱(tropane alkaloids,TAs)莨菪碱和东莨菪碱的产量,初步探究YE诱导合成颠茄毛状根次生代谢产物的机制。结果表明:较对照组而言,氮代谢关键酶硝酸还原酶(NR)和谷氨酰胺合成酶(GS)活性显著升高,谷氨酸脱氢酶(GDH)活性变化不显著。硝态氮,铵态氮含量显著下降,而可溶性蛋白,游离氨基酸,总氮含量均显著升高。此外,YE处理颠茄毛状根提高了次生代谢途径中的前体氨基酸(鸟氨酸和精氨酸)的含量以及代谢前体腐胺的含量,3个关键酶基因1,4-丁二氨-氮-甲基转移酶基因(putrescine N-methyl transferase,pmt)、托品酮还原酶-Ⅰ基因(tropinone reductase-Ⅰ,tr I)和莨菪碱6-β-羟化酶基因(hyoscyamine 6-β-hydroxylase,h6h)的相对表达量也呈现不同幅度的上升,最终导致莨菪碱和东莨菪碱产量的增多,在处理16 d后分别是对照组的3.09,1.85倍。这说明YE诱导氮代谢关键酶活性升高使氮代谢加速,为次生代谢中含氮化合物的合成提供更多原料,同时通过调控次生代谢途径中关键酶基因的表达,使莨菪碱和东莨菪碱产量提高。     

家种及野生秦艽、麻花秦艽的rRNA基因间隔区PCR产物电泳图谱的初步研究

目的：分析甘肃不同地区家种及野生中药材秦艽Gentiana macrophylla、麻花秦艽G.straminea中提取的DNA中rRNA基因内转录间隔区PCR扩增产物的电泳图谱，为秦艽、麻花秦艽等不同品种鉴别和品质评价从分子水平提供依据。方法：提取中药材家种及野生秦艽、麻花秦艽的核基因组DNA，利用合成的特异性PC及引物对所提取的DNA中rRNA基因内转录间隔序列进行nPCR扩增，扩增产物行琼脂糖凝胶电泳以得到电泳图谱并进行分析。结果：琼脂糖凝胶电泳图谱显示不同秦艽DNA中rRNA基因内转录间隔区长度均在360bp左右，已具备足够的遗传信息量进行碱基序列分析。结论：不同秦艽DNA中rRNA基因内转录间隔区PCR扩增产物可作为从分子水平进行鉴别的标记之一。     

金银花HQT基因在真核植物细胞中对绿原酸生物合成的调控

目的通过构建羟基桂皮酰辅酶A羟基桂皮酰转移酶(hydroxycinnamoyl CoA quinate hydrocycinnamoyl transferase,HQT)基因真核表达载体以及建立金银花的遗传转化系统,阐明金银花HQT基因在真核生物细胞中对绿原酸量的调控机制。方法应用通路克隆系统技术构建HQT基因真核表达载体,利用根癌农杆菌介导法,构建含金银花HQT基因的工程菌,对转染成功的外植体进行愈伤诱导,进而进行半定量RT-PCR检测转基因愈伤组织中HQT基因的相对表达量以及利用HPLC检测其绿原酸的量,并对二者相关性进行分析。结果金银花愈伤组织中绿原酸的量随HQT基因表达量的升高而升高。结论金银花HQT基因在真核生物细胞内对绿原酸的生物合成具备调控作用。     

丹参转录因子SmbHLH1基因的克隆和表达分析

目的:获得丹参转录因子SmbHLH1全长基因,分析SmbHLH1基因在丹参不同组织部位,以及不同诱导子处理后的表达差异.方法:利用RT-PCR等技术获得SmbHLH1基因全长,利用半定量RT-PCR,分析SmbHLH1基因在丹参不同部位的表达情况,及在不同处理条件下的表达情况.结果:获得的SmbHLH1基因由999个核苷酸组成,编码332个氨基酸,蛋白相对分子质量约36 kDa;半定量RT-PCR检测,该基因在丹参的根中表达量最高,其次是茎,在叶和花中有微量表达;茉莉酸甲酯,以及酵母提取物和Ag+共同诱导,会抑制该基因的表达,水杨酸和脱落酸对该基因的影响不大.结论:丹参SmbHLH1基因是bHLH家族新成员,其功能可能与油菜素内酯信号途径有关.     

五味子醇提液对糖尿病肾病小鼠氧化应激的保护作用及机制研究

目的 探讨五味子醇提液（SE）对自发型2型糖尿病C57BLKS/Jdb/db（db/db）小鼠氧化应激的保护作用及机制。方法 选取10只9周龄雄性db/m小鼠和10只同周龄同源雄性db/db小鼠随机分为对照组、SE对照组、模型组、SE治疗组,每组5只。SE对照组和治疗组分别以SE 5 mg/kg ig给药,连续给药6周。在0、3、6周记录体质量、血糖及24 h尿微量白蛋白,6周后处死小鼠,收集肾组织标本。脂质过氧化试剂盒测定氧化应激指标丙二醛（MDA）含量,过碘酸雪夫（PAS）染色观察肾组织病理变化,Western blotting法检测抗氧化因子核因子红细胞衍生2相关因子2（Nrf2）及血红素氧合酶-1（HO-1）蛋白表达,实时荧光定量PCR（qRT-PCR）法检测Nrf2及其下游靶基因的表达。结果 与对照组相比,模型组小鼠体质量、血糖和24 h尿微量白蛋白明显升高,MDA含量增加,Nrf2、HO-1及其下游靶基因表达下降（P<0.05、0.01）。SE能够降低糖尿病肾病小鼠血糖、24 h尿微量白蛋白和MDA水平,改善肾组织病理损伤,上调Nrf2、HO-1及其下游靶基因表达（P<0.05、0.01）。结论 SE对db/db小鼠氧化应激损伤有一定的保护作用,其机制可能与上调抗氧化因子Nrf2及其下游基因有关。     

龙葵愈伤组织生长特性及次生代谢产物积累研究

目的 建立龙葵Solanumnigrum愈伤组织最优培养体系，研究愈伤组织在不同培养时间下各生理指标变化和澳洲茄碱、澳洲茄边碱的积累，为工业化制备澳洲茄碱和澳洲茄边碱奠定基础。方法 研究不同外植体及培养基对龙葵愈伤组织诱导的影响，采用响应面试验设计方法优化愈伤组织诱导的激素配比，运用考马斯亮蓝G-250法测定可溶性蛋白含量，TTC还原法测定细胞活力，邻苯二酚法测定多酚氧化酶（polyphenol oxidase,PPO）活性，氮蓝四唑光化还原法测定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）活性，愈创木酚比色法测定过氧化物酶（peroxidase,POD）活性，硫代巴比妥酸显色法测定丙二醛（malondialdehyde,MDA）含量，高效液相色谱法测定澳洲茄碱及澳洲茄边碱含量。结果 愈伤组织诱导最佳外植体为龙葵茎段，最适培养基为MS+1.43 mg/L NAA+2.15 mg/L 6-BA+2.48 mg/L KT，愈伤组织增殖最适培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA。愈伤组织鲜质量增长量呈“S”型趋势，20 d时细胞活力达到最高峰...     

长春花密码子使用偏好性分析

以长春花为研究对象,分析其密码子使用偏好性,以期为相关基因的异源表达、基因的预测、物种的进化研究提供指导。该研究以长春花的30 437条蛋白质编码序列为数据来源,对长春花密码子组成和密码子偏性的各项参数进行了计算和统计分析。计算了长春花萜类吲哚生物碱(terpenoid indole alkaloids,TIAs)生物合成途径中25个关键酶基因含有大肠杆菌或酿酒酵母稀有密码子的比例。结果显示,长春花基因的平均GC量为42.47%,密码子第3位碱基平均GC量为35.89%。长春花中共有28个密码子的同义密码子相对使用度(relative synonymous codon usage,RSCU)大于1,其中26个以A或T结尾。25个关键酶基因含有大肠杆菌稀有密码子的比例明显高于酿酒酵母稀有密码子的比例。长春花主要偏爱使用以A和T结尾的密码子;相比于酿酒酵母,其密码子使用特点与大肠杆菌的差异更大,推测酿酒酵母可能是长春花基因更合适的异源表达宿主。     

苦参不同组织中生物碱类成分的LC-MS分析

目的 通过对苦参Sophora flavescens不同组织样品中生物碱类成分的LC-MS分析,探讨苦参中生物碱类成分的质谱裂解规律及其在不同样品中的异同。方法 首先利用UPLC-Q-Exactive-OrbitrapMS对5年生苦参根中的生物碱类成分进行全面的鉴定分析。再利用UPLC-QQQ-MS/MS技术,对苦参无菌幼苗不同组织部位（根、茎、叶）、苦参愈伤组织中的生物碱类成分进行定量分析,比较各样品中生物碱类成分的异同。结果 从5年生苦参根中共鉴定出47个生物碱类成分;利用UPLC-QQQ-MS/MS对其中17个主要的生物碱类成分进行了定量分析,发现不同苦参样品中生物碱类成分差异明显,其中苦参无菌幼苗各组织部位中生物碱的含量相对较高。结论 建立了一种苦参生物碱类成分快速定性定量分析方法,从5年生苦参根中快速鉴定出47种生物碱;通过对苦参不同组织样品中17个生物碱类成分的定量分析,为后续利用比较转录组测序技术,挖掘并鉴定苦参中生物碱类成分生物合成关键酶的研究奠定基础。     

基于转录组测序揭示适度干旱胁迫对丹参基因表达的调控

目的对丹参进行转录组测序,分析丹参不同组织响应适度干旱胁迫的分子机制。方法以栽培4个月的丹参为材料,设置适度干旱胁迫组(土壤相对含水量55%～60%)和对照组(土壤相对含水量75%～80%),应用IlluminaHi Seq2000分别对根和叶进行转录组测序,对测序后的结果进行基因功能注释、差异表达基因(differentiallyexpressedgenes,DEGs)筛选和共表达网络分析等。结果转录组测序共获得58085条Unigene。其中28846条被注释,根和叶中的DEGs分别有1853、1457个。GO富集结果表明,丹参根和叶中的DEGs在GO功能部位中的分布基本一致,均在代谢过程、刺激响应、细胞结构、催化活性等功能中得到显著富集。KEGG途径富集分析表明,根中DEGs显著富集在DNA复制、植物激素信号转导、植物-病原菌相互作用、胡萝卜素合成等途径,叶中DEGs则主要富集在氨基酸、生物碱、苯丙烷类生物合成等途径。适度干旱胁迫能促进丹参叶中苯丙烷类、根中萜类化合物生物合成途径关键酶基因的表达,是促进丹参有效成分累积的基础。AP2/ERF、b HLH、b ZIP、WRKY、MYB类转录因子在根和叶中差异表达均较显著,基因共表达网络分析预测了在适度干旱胁迫下可能参与调控萜类基因表达的转录因子。结论通过高通量转录组测序,揭示了适度干旱胁迫对丹参不同组织基因表达的调控特征,可为深入研究丹参药效成分的生物合成机制和在栽培中的合理灌溉提供科学依据。     

HILIC-ESI-TOF/MS测定海龙中的多种成分及其特征指纹图谱研究

目的 建立亲水色谱-电喷雾飞行时间质谱(HILIC-ESI-TOF/MS)联用技术用于海洋中药海龙多种化学成分快速鉴定及其特征指纹图谱的研究方法.方法 以海龙水提物为研究对象,采用加速溶剂萃取法(ASE)对海龙样品进行提取制备,采用HILIC法对海龙水提物进行快速分离,ESI-TOF/MS法对海龙水提物中多种化合物进行鉴别,在对已知活性成分进行定量测定的基础上,建立海龙的HILIC特征指纹图谱.结果 应用HILIC-ESI-TOF/MS鉴定出海龙水提物中的10种成分,对其中7种核苷类成分进行了定量测定;在对多批次海龙药材分析的基础上,建立了其HILIC特征指纹图谱,结合相似度分析实现了海龙的质量评价及其与不同海洋药物的正确区分.结论 本研究为海龙真伪鉴别研究提供了一种新方法.     

桑黄鲨烯环氧酶基因原核表达及过表达载体的构建

目的构建桑黄三萜生物合成途径中的关键酶——鲨烯环氧酶(squalene epoxidase,SE)基因的原核表达和过表达载体。方法将克隆到的桑黄SE基因构建到原核表达载体p ET-32a(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3),使用异丙基硫代-β-D-呋喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达2~10 h后,通过SDS-PAGE进行检测。根据Gen Bank中提交的香菇3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(gpd)启动子序列设计引物,利用PCR技术克隆获得香菇gpd启动子片段,以植物双元表达载体p CAMBIA1301为基础载体,通过酶切、连接等方法将其中的35 S启动子替换为香菇gpd启动子,再将SE基因编码区序列构建到gpd启动子下游,构建桑黄SE基因的过表达载体。结果成功构建了SE基因的原核表达载体p ET-32a-SE,SDS-PAGE结果显示该蛋白的大小约为55 000,与预测的蛋白相对分子质量基本一致。PCR检测、酶切鉴定和测序分析可知,成功构建了适宜食用菌遗传转化的中间载体p CAMBIA1301-gpd-gpd及SE基因的过表达载体p CAMBIA1301-gpd-gpd-SE。结论为后期研究SE基因在桑黄三萜生物合成方面所发挥的功能奠定基础。     

欧洲花楸糖基转移酶基因的全长克隆与表达分析

目的:研究欧洲花楸植保素糖基化修饰的相关基因,从欧洲花楸悬浮细胞中克隆糖基转移酶(glycosyltransferase,GT)基因,进行序列分析和原核表达。方法:基于欧洲花楸转录组数据设计特异性引物,克隆得到2条Sa UGTs基因的c DNA序列,构建HIS-MBP-pET28a-SaUGTs原核表达载体,诱导表达Sa UGTs重组蛋白。结果:克隆得到2条糖基转移酶基因Sa UGT1和Sa UGT2序列,完整开放阅读框为1 458 bp和1 431 bp,分别编码485和476个氨基酸,相对分子质量为54. 27 k Da和53. 49 k Da,理论等电点为5. 50和5. 63。生物信息学分析显示,无信号肽,含有糖基转移酶家族保守结构域(PSPG)。系统进化结果显示Sa UGT1和Sa UGT2蛋白与拟南芥UGT85家族亲缘关系较近。实时荧光定量PCR检测显示,欧洲花楸悬浮细胞经酵母提取物(YE)诱导后,Sa UGT1和Sa UGT2的相对表达量明显上调,分别在24 h和12 h达到最大值。通过IPTG诱导,在大肠埃希菌中成功表达Sa UGT1和Sa UGT2重组蛋白,并得到了纯化的重组蛋白。结论:该研究首次在欧洲花楸中克隆得到糖基转移酶基因,并成功构建了原核表达载体,为进一步研究该类基因的功能奠定了基础。     

2个丹参鲨烯合酶基因的克隆和鉴定

目的 克隆与鉴定丹参Salvia miltiorrhiza鲨烯合酶基因。方法 基于丹参基因组的基因预测结果设计引物,通过RT-PCR方法,克隆丹参鲨烯合酶基因。利用生物信息软件对基因序列进行了结构分析,对基因编码多肽进行了序列同源性比较和保守结构域分析,利用实时定量RT-PCR方法对基因进行表达模式研究。结果 通过RT-PCR方法扩增得到2个丹参鲨烯合酶基因（SmSQS1和SmSQS2）,它们编码的多肽具有鲨烯合酶相关结构域和保守基序。这2个基因具有不同的外显子/内含子结构特征,具有不同的组织特异性表达模式和时间表达模式。结论 丹参基因组中存在2个鲨烯合酶基因,它们具有不同的基因结构特征和表达模式,可能在丹参甾体类和三萜类化合物生物合成中起不同作用。     

西南委陵菜质量标志物初步研究及指纹图谱结合多元统计综合评价其质量

目的建立基于UPLC-Q-Exactive-MS/MS法初步筛选彝药材西南委陵菜Potentilla fulgens质量标志物、指纹图谱结合多元统计分析综合评价其药材质量的研究方法,为西南委陵菜质量评价和质量控制提供依据。方法采用UPLC-Q-Exactive-MS/MS法定性分析西南委陵菜化学成分组成,筛选质量标志物;HPLC法建立27批次西南委陵菜药材指纹图谱,定量分析质量标志物的含量;采用主成分分析和TOPSIS分析综合评价西南委陵菜药材质量。结果 UPLC-Q-Exactive-MS/MS法从西南委陵菜中指认了48个化合物,包括原花青素类34个、黄酮类12个、酚类1个、鞣质类1个,筛选出含量较高、可准确测定的表儿茶素作为质量标志物,西南委陵菜指纹图谱中确定了10个共有峰,含量测定结果表明不同产地药材中表儿茶素的含量有较大差异,表儿茶素含量与海拔高度呈正相关,综合主成分分析结合TOPSIS分析,结果表明样品S11的质量最佳,S9的质量最次。结论指纹图谱结合多元统计分析的药材质量综合评价方法,可较客观评价西南委陵菜药材质量,为其药材的质量控制提供科学依据。