抗寨卡病毒非结构蛋白1单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备抗寨卡病毒非结构蛋白1的小鼠杂交瘤单克隆抗体,并对筛选获得的单抗进行抗体亚型鉴定以及免疫结合特性鉴定。方法将真核表达纯化获得的寨卡病毒非结构蛋白1按50μg/只的量免疫3只SPF级BABL/c小鼠,经过3次皮下多点免疫及1次腹腔加强免疫后测定小鼠血清抗体效价,取抗体滴度高的免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合,使用有限稀释法进行亚克隆,采用间接ELISA筛选分泌高滴度单抗的杂交瘤细胞株,使用小鼠单克隆抗体分型试剂盒对筛选的单抗进行亚型鉴定,分别使用免疫印迹与间接免疫荧光法检测单抗与寨卡病毒非结构蛋白1以及寨卡病毒的免疫结合特性。结果寨卡病毒非结构蛋白1免疫刺激小鼠产生高滴度的抗体,ELISA滴度为1∶64000。通过筛选获得2株能高效分泌抗寨卡病毒非结构蛋白1单抗的杂交瘤细胞株(命名为1C9-F12,4B2-F3),分泌的单抗的亚型均为重链γ1和轻链Kappa;Western blot及IFA法检测2株单抗均能与寨卡病毒非结构蛋白1及寨卡病毒发生特异性结合。结论成功筛选到2个抗寨卡病毒非结构蛋白1的小鼠单克隆抗体,该两个单抗均具有寨卡病毒非结构蛋白1及寨卡病毒结合特性,为建立检测寨卡病毒感染的ELISA方法及治疗性抗体研究奠定了基础。     

1型登革病毒感染病人血清中非结构蛋白1B细胞线性表位鉴定

目的 鉴定1型登革病毒感染病人血清中1型登革病毒非结构蛋白1(nonstructural Protein 1 of Dengue virus type 1,DENV-1 NS1)B细胞线性表位。方法 以重组DENV-1 NS1为抗原,免疫印迹法筛选NS1阳性病人血清。一组重叠DENV-1 NS1的重叠多肽同这些NS1阳性血清反应鉴定NS1蛋白线性B细胞表位。采用梯度稀释的1-4型重组DENVNS1竞争抑制阳性多肽同病人血清反应鉴定其反应特异性和交叉反应性。结果 12份DENV-1核酸阳性病人中筛选得到5份抗DENV-1 NS1阳性病人血清。重叠多肽法、竞争抑制法和生物信息学方法筛选出3条阳性NS1多肽(氨基酸残基序列第1-15,131-145,271-285),其中aa1-15在已报道的DENV-1分离株高度保守,提示这个区域可能存在DENV-1血清型特异性表位。aa131-145和aa271-285对应的蛋白序列比对分析表明以上区域中的133-FI/LIDGP-138和271-GKLEL/M/IDF-277在已报道的4种血清型DENV分离株中高度保守,提示这2个区域存在4种血清型DE...     

Ⅱ型登革病毒NS1基因的克隆及其在昆虫细胞中的表达

目的获得II型登革热病毒NS1基因并在昆虫细胞中表达,为进一步研发登革热血清学检测试剂盒提供抗原。方法RT-PCR扩增II型登革热病毒NS1基因并测序列,并定向克隆入杆状病毒转移载体pFastBac-HTA,获得重组转移载体pFastBac-NS1。并将pFastBac-NS1转化到DH10Bac感受态细胞中,筛选到重组转座子rBacmid-NS1。在脂质体介导下将rBacmid-NS1转染Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒rBV-NS1。rBV-NS1感染Sf9细胞后,通过SDS-PAG和Western blot检测NS1重组蛋白。结果成功克隆II型登革病毒NS1基因,SDS-PAGE、间接免疫荧光和Western blot检测表明NS1基因在昆虫细胞得到表达,能与登革患者血清发生特异性免疫反应,具有免疫原性。结论II型登革病毒非结构蛋白NS1在昆虫中表达,为进一步研究NS1的生物学特性和血清学检测奠定基础。     

登革2型病毒NS3蛋白具有抑制病毒复制的作用

目的 构建登革2型病毒非结构蛋白NS3及其结构域基因的真核表达载体, 并鉴定重组蛋白在BHK-21细胞内对登革病毒复制的抑制作用。方法 以登革2型病毒新几内亚毒株(NGC DENV-2)基因组RNA为模板, 设计引物扩增获得编码NS3及其蛋白酶NS3P和解旋酶NS3H的基因, 通过基因重组的方法分别将3段基因片段克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+), 获得重组表达载体pcDNA3.1-NS3、pcDNA3.1-NS3P和pcDNA3.1-NS3H;经脂质体法分别转染BHK-21细胞后, 用RT-PCR、间接免疫荧光和Western印迹鉴定表达的蛋白。结果 成功构建pcNS3、pcNS3P和pcNS3H重组质粒, 转染进BHK-21细胞48 h后, 分别检测出相对分子量约为69 kDa、50 kDa及18 kDa的特异蛋白;且转染pcNS3、pcNS3H组均与空白对照组及未转染组间的病毒载量存在着差异(P<0.05);转染pcNS3P组与未转染组及空白对照组的病毒载量无统计学差异(P>0.05)。结论 DENV-2的非结构蛋白NS3能够抑制病毒的复制。     

寨卡病毒NS1蛋白的原核表达和单克隆抗体的制备

目的 高效表达和纯化重组的寨卡病毒NS1蛋白,制备抗NS1蛋白的单克隆抗体。方法 构建含有寨卡病毒NS1基因的原核表达质粒,利用大肠杆菌大量表达重组NS1蛋白,纯化蛋白后免疫小鼠并进行细胞融合,筛选制备高纯度的单克隆抗体。结果 在大肠杆菌中高效表达了重组NS1蛋白,重组NS1蛋白具有良好的免疫原性,筛选出3株分泌针对寨卡病毒NS1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为6B8、7D11和3E2,纯化的单克隆抗体与重组NS1蛋白有良好的特异性反应。结论 利用重组NS1蛋白免疫制备了抗NS1的单克隆抗体,为后续建立针对NS1蛋白的ELISA检测方法及相关研究提供了基础。     

II型登革病毒NS1基因的克隆及其在昆虫细胞中的表达

目的获得II型登革热病毒NS1基因并在昆虫细胞中表达,为进一步研发登革热血清学检测试剂盒提供抗原。方法RT-PCR扩增II型登革热病毒NS1基因并测序列,并定向克隆入杆状病毒转移载体pFastBac-HTA,获得重组转移载体pFastBac-NS1。并将pFastBac-NS1转化到DH10Bac感受态细胞中,筛选到重组转座子rBacmid-NS1。在脂质体介导下将rBacmid-NS1转染Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒rBV-NS1。rBV-NS1感染Sf9细胞后,通过SDS-PAG和Western blot检测NS1重组蛋白。结果成功克隆II型登革病毒NS1基因,SDS-PAGE、间接免疫荧光和Western blot检测表明NS1基因在昆虫细胞得到表达,能与登革患者血清发生特异性免疫反应,具有免疫原性。结论II型登革病毒非结构蛋白NS1在昆虫中表达,为进一步研究NS1的生物学特性和血清学检测奠定基础。     

黄热病毒NS1蛋白的制备及免疫原性鉴定

目的 原核系统克隆表达黄热病毒(yellow fever virus, YFV)非结构蛋白1(nonstructural protein 1,NS1),鉴定其免疫原性。方法 以YFV-17D疫苗株为模板,常规分子生物学方法构建pQE30-YFV NS1表达载体,原核表达纯化YFVNS1重组蛋白;免疫印记、免疫荧光和酶联免疫吸附实验验证其免疫原性。结果 成功构建重组质粒pQE30-YFV NS1,制备纯化可溶性YFV NS1蛋白;该重组YFV NS1蛋白与登革病毒、黄热病毒、乙脑病毒、西尼罗河病毒免疫小鼠腹水及寨卡病毒NS1、YFV NS1蛋白免疫小鼠血清均发生反应,重组YFV NS1蛋白免疫小鼠血清与YFV感染细胞超声上清也发生反应。结论 获得高纯度YFV NS1重组蛋白,且具有较好的免疫原性,含天然NS1蛋白表位,为基于NS1黄热病毒早期抗原诊断方法和蛋白功能研究奠定基础。     

O型口蹄疫病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备与生物学特性鉴定

目的为了获得针对O型口蹄疫病毒的单克隆抗体,本研究采用差速离心、半饱和硫酸铵沉淀和蔗糖密度梯度离心法提纯O型口蹄疫病毒液,免疫BALB/c小鼠,取脾细胞和SP2/0细胞融合,经ELISA方法筛选和3次亚克隆后获得2株稳定分泌表达的杂交瘤细胞株2C8和5G10,腹水抗体效价分别达到1∶6 400和1∶25 600。经亚类鉴定确定两株单抗均为IgM型,Western-blot、间接ELISA和IFA确定这2株单克隆抗体分别针对O型口蹄疫病毒VP1蛋白不同表位,从而,为研究FMDV的生物学特性和建立快速诊断方法的建立奠定了基础。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3反式激活研究进展

丙型肝炎病毒非结构区3（HCVNS3）基因位于HCV基因组非结构区3420—5312核苷酸区段。HCVNS3具有多种潜在生物学功能,如蛋白酶、解旋酶活性,介导细胞免疫反应、反式激活端粒酶、调节p53活性及参与蛋白激酶A和STAT信号转导等,从而影响宿主细胞功能,导致细胞增生、凋亡,甚至癌变。对于NS3蛋白反式激活作用研究,可为进一步研究HCV致病（癌）的分子生物学机制和探索新的丙型肝炎治疗技术提供帮助。     

登革病毒1型和2型国内分离株NSI基因的扩增和克隆

登革病毒为单链正股ＲＮＡ病毒，其非结构蛋白ＮＳ１在病毒免疫反应中起重要作用。我们在ＮＳ１基因序列设计了一对通用引物，扩增序列长度的４１３ｂｐ。应用逆转录－－聚全酶链反应成功地扩增了ＤＶ１－４型部分基因长段，采用该引物增国内分离株ＤＶ１和ＤＶ２同样出现一条特异扩增带，回收该ＤＮＡ片段，并将ＤＶ１和ＤＶ２ＮＳ１基因部分片段分别克隆到ＰＵＣ１９质粒载体中。     

抗狂犬病病毒N蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备抗狂犬病病毒N蛋白单克隆抗体,为建立快速准确的狂犬病病毒抗原检测方法奠定基础。方法将狂犬病病毒Flury LEP株N基因克隆至pGEX-6P-1表达载体中,将纯化后的pGEX-6P-1-RV-N蛋白免疫BALB/c小鼠3次。取小鼠脾脏细胞和SP2/0细胞融合后,用pET-32a-RV-N重组蛋白作为筛选抗原,经3次亚克隆筛选后得到1D9、2B6、3C5、6B5及5F2 5株单克隆抗体细胞株。亚类鉴定结果表明,其中1D9、2B6、6B5 3株亚类为IgG1,3C5、5F2的亚类为IgM。间接ELISA方法检测2B6单抗细胞腹水效价可达1∶106。经Protein G亲和层析柱纯化和脱盐后可得到浓度为2.5mg/mL的高纯度的单克隆抗体。其免疫荧光试验结果表明5株单克隆抗体均能特异地与狂犬病病毒结合。结论制备的单抗具有良好的特异性和敏感性,为后期诊断方法的建立奠定了基础。     

Ⅰ型登革病毒ns1基因克隆及其表达产物的免疫原性研究

目的克隆并表达Ⅰ型登革病毒非结构蛋白1(NS1)基因,初步鉴定其免疫原性。方法登革热Ⅰ型病毒标准株感染C6/36细胞后,抽提病毒RNA,经RT-PCR方法扩增出NS1全长基因片段,经T-A克隆后,在QIA表达系统中表达,表达产物用Ni柱亲和层析纯化后,用兔抗Ⅰ型登革病毒免疫血清及登革热患者血清对重组蛋白进行Western Blot及ELISA鉴定。结果构建的重组质粒pQE-30/DV1NS1经IPTG诱导,重组蛋白NS1高效表达并纯化成功,经Western Blot及ELISA证实重组蛋白NS1可以被免疫血清和病人血清特异识别。结论Ⅰ型登革病毒非结构蛋白NS1表达载体在大肠杆菌M15中高效表达。纯化产物具有较强的免疫原性,为进一步研究NS1的生物学特性和血清学检测奠定了基础。     

登革热病毒(DENV)包膜蛋白特异性人源抗体筛选与鉴定

目的 建立自外周血快速筛选识别登革热病毒衣壳的人源抗体的方法,从病毒感染者外周血记忆B细胞中筛选出特异性抗体并进行性质分析。方法 通过流式细胞术分选得到外周血中登革热病毒包膜蛋白特异性的单个记忆B细胞,结合高效单细胞PCR技术获得抗体基因序列,对重组表达的单克隆抗体进行结合活性及中和活性检测。结果 成功筛选到识别DENV-1包膜蛋白的6株人源单克隆抗体,其中4株抗体均具有很强的结合活性以及中和活性。结论 成功的通过流式细胞术对DENV特异性记忆B细胞进行分选,并结合单细胞PCR技术,实现了对DENV特异性人源单克隆抗体的高效筛选。通过该平台有希望筛选得到DENV的广谱中和抗体,用于登革热的预防和治疗。     

The human antibody response to dengue virus infection

Dengue viruses (DENV) are the causative agents of dengue fever (DF) and dengue hemorrhagic fever (DHF). Here we review the current state of knowledge about the human antibody response to dengue and identify important knowledge gaps. A large body of work has demonstrated that antibodies can neutralize or enhance DENV infection. Investigators have mainly used mouse monoclonal antibodies (MAbs) to study interactions between DENV and antibodies. These studies indicate that antibody neutralization of DENVs is a "multi-hit" phenomenon that requires the binding of multiple antibodies to neutralize a virion. The most potently neutralizing mouse MAbs bind to surface exposed epitopes on domain III of the dengue envelope (E) protein. One challenge facing the dengue field now is to extend these studies with mouse MAbs to better understand the human antibody response. The human antibody response is complex as it involves a polyclonal response to primary and secondary infections with 4 different DENV serotypes. Here we review studies conducted with immune sera and MAbs isolated from people exposed to dengue infections. Most dengue-specific antibodies in human immune sera are weakly neutralizing and bind to multiple DENV serotypes. The human antibodies that potently and type specifically neutralize DENV represent a small fraction of the total DENV-specific antibody response. Moreover, these neutralizing antibodies appear to bind to novel epitopes including complex, quaternary epitopes that are only preserved on the intact virion. These studies establish that human and mouse antibodies recognize distinct epitopes on the dengue virion. The leading theory proposed to explain the increased risk of severe disease in secondary cases is antibody dependent enhancement (ADE), which postulates that weakly neutralizing antibodies from the first infection bind to the second serotype and enhance infection of FcγR bearing myeloid cells such as monocytes and macrophages. Here we review results from human, animal and cell culture studies relevant to the ADE hypothesis. By understanding how human antibodies neutralize or enhance DENV, it will be possible to better evaluate existing vaccines and develop the next generation of novel vaccines.     

肺炎支原体重组P1蛋白抗体研究

目的研制针对肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,Mp)主要粘附蛋白-P1蛋白的特异性抗体。方法用纯化后重组P1蛋白免疫BALB/c小鼠,获得多克隆抗体(Polyclonal Antibody,PcAb),通过传统的杂交瘤技术制备抗P1重组蛋白单克隆抗体(Monoclonal Antibody,McAb),采用ELISA和IFA法对单抗和多抗进行反应性和特异性检测。结果ELISA法检测P1重组蛋白抗原性显示,P1蛋白与Mp抗血清有较好的反应性,蛋白敏感性大于1ng/ml;在重组P1蛋白免疫小鼠获得的PcAb与Mp的反应中,检测到的抗体滴度可达到1∶1600;获得针对Mp重组P1蛋白的特异性McAbs2株,在ELISA检测中均与P1抗原有较好的反应特异性,抗体滴度可达到1∶800～1600;IFA结果显示,上述PcAb和McAbs均与Mp有较好反应性,与生殖支原体等无交叉反应。结论本研究选取的重组P1蛋白具有较好的免疫原性;其特异性PcAb和McAbs与Mp有较好的特异性,为临床Mp感染的抗原快速、早期诊断方法的建立打下了基础。     

Isolation and partial characterization of dengue virus type 2 and 4 strains from dengue fever and dengue haemorrhagic fever patients from Mindanao, Republic of the Philippines

OBJECTIVE: Isolation of dengue virus from dengue fever and dengue haemorrhagic fever cases from Mindanao, Republic of the Philippines. METHODS: 12 patients with clinically suspected dengue fever (DF) or dengue haemorrhagic fever (DHF) presenting in four regional hospitals between August and September 1995 on Minadano were enrolled in the study. Dengue virus was isolated by inoculation of Vero/E6 or C6/36 cells with patient serum. IgM antibodies were measured using a commercial test system. Up to 454 bp of the capsid region and 240 bp of the E/NS1 gene junction of different viral isolates were sequenced and phylogenetically analyzed. RESULTS: Virus could be isolated from seven patients, five isolates were typed as dengue virus type 2 and two as dengue virus type 4 by immunostaining with monoclonal antibodies or by RT/PCR. Phylogenetic analysis confirmed a close relationship of the dengue virus type 2 isolates with viruses isolated in the Philippines in 1983 and 1988. CONCLUSION: As observed in studies from other parts of South East Asia, dengue virus type 2 was readily isolated from dengue haemorrhagic fever cases. Dengue virus type 2 and 4 circulate in Mindanao, Philippines, with dengue type 2 being responsible for most of our severe DF or DHF cases.