Bio-Oss胶原结合骨髓基质细胞构建组织工程骨的实验研究

目的:研究Bio-Oss胶原作为骨组织工程支架材料的可行性。方法:抽取成年小型猪骨髓,贴壁法获得骨髓基质细胞(BMSCs),经成骨诱导培养液体外培养、扩增、诱导后观察细胞增殖情况,并进行I型胶原、骨钙素的免疫细胞化学检测。将培养的第3代细胞接种于Bio-Oss胶原,进行超微结构观察,并将Bio-Oss胶原/BMSCs复合物植入裸鼠背部皮下,4、8周后进行组织学检测。结果:当接种密度为0.8×106/ml时,细胞与支架材料之间有最大附着量;VonKossa染色可见钙结节形成;I型胶原、骨钙素免疫细胞化学染色呈阳性;超微结构观察可见细胞生长附着于材料网孔内表面;组织学检测提示,8周时复合物内有新骨形成。结论:Bio-Oss胶原/BMSCs复合物显示成骨活性,Bio-Oss胶原可用作骨组织工程支架材料。     

以Bio-oss胶原为支架材料的组织工程化骨修复种植体周围骨缺损的初步实验研究

目的研究以Bio-oss胶原为支架材料的组织工程化骨修复种植体周围骨缺损的效果。方法取4只小型猪设立自身对照,获取骨髓基质细胞(BMSCs),经成骨诱导培养液体外培养、扩增、诱导后进行I型胶原、骨钙素的免疫细胞化学检测,将培养的第3代细胞同Bio-oss胶原构建BMSCs/Bio-oss胶原复合物,构建小型猪下颌骨种植体周围骨缺损模型,将复合物植入骨缺损处,通过影像学、能谱分析种植体-新骨界面Ca2+含量及组织学检测初步评价其促成骨作用。结果Ⅰ型胶原、骨钙素免疫细胞化学染色呈阳性,Von Kossa染色可见钙结节形成;超微结构观察可见细胞生长附着于材料网孔内表面;8周时成骨组织学观察可见BMSCs/Bio-oss胶原复合物植入组成骨量大于Bio-oss胶原植入组,能谱分析显示,2组Ca2+含量有统计学差异。16周时,组织学观察可见2组成骨量已无明显差别,能谱分析显示,2组Ca2+含量无统计学差异。结论利用BMSCs/Bio-oss胶原复合物修复小型猪种植体周围骨缺损相对于植入Bio-oss胶原能够缩短种植体发生骨结合的时间。     

犬骨髓基质干细胞复合珊瑚羟基磷灰石皮下成骨的实验研究

目的：犬自体皮下非受力部位植入犬骨髓基质干细胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）复合珊瑚羟基磷灰石（coralline hydroxyapatite，CHA），观察成骨情况及其转归。方法：体外分离培养、成骨诱导、扩增犬BMSCs，并通过细胞化学、免疫细胞化学检测成骨表型。将第2代细胞接种于CHA上，形成细胞一材料复合物，植于9只犬右侧腹部皮下，并在对称部位植入CHA作为对照。术后4、12、26周取材，HE染色，观察新生组织结构；通过形态计量学分析，对成骨情况量化，并行t检验。结果：成骨诱导后，细胞碱性磷酸酶染色阳性，免疫细胞化学显示骨钙蛋白表达阳性。HE染色示植入4周后，无明显骨形成；12周后，实验组有较多新生骨小梁形成，苦味酸-硫堇和Masson染色示骨基质和胶原形成良好；26周后，实验组骨小梁量有减少趋势。图像分析显示，实验组12周成骨量最高，差异有统计学意义。结论：犬BMSCs诱导后具有成骨活性，复合CHA后，可促进形成组织工程化骨。在无应力刺激情况下，随时间延长．局部成骨活动减弱。     

大鼠脂肪干细胞体外定向诱导分化为成骨细胞的研究

目的：研究脂肪组织来源干细胞（adipose tissue-derived stem cells，ADSCs）在体外分离培养、诱导分化为成骨细胞的能力，探讨其作为骨组织工程种子细胞的可行性。方法：从SD大鼠腹股沟脂肪垫分离出脂肪组织，通过Ⅰ型胶原酶消化法获取原代ADSCs，适时传代。逐日倒置显微镜下观察细胞形态及增殖特征。第3代细胞用成骨诱导培养基向成骨细胞诱导分化，并进行碱性磷酸酶染色、VonKossa染色及免疫细胞化学染色鉴定成骨细胞特性。结果：从大鼠脂肪组织中分离培养出ADSCs，体外形态类似成纤维细胞，增殖迅速。在地塞米松、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠及1，25-（OH）2 VitD，诱导下，ADSCs表现出成骨细胞特性：ALP活性显著增高，Von Kossa染色出现钙化结节，OC、Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色阳性。结论：ADSCs易于分离培养，体外扩增迅速，经矿化诱导后可分化为成骨细胞，可作为骨组织工程的种子细胞。     

兔骨髓基质细胞的体外成骨定向诱导培养

目的:体外分离培养兔骨髓基质细胞(bonemarrowstromalcells,BMSCs),并向成骨定向诱导培养,为骨组织工程提供适宜的种子细胞。方法:抽取新西兰白兔的骨髓,体外分离纯化得到BMSCs,并利用条件培养液将其向成骨定向诱导培养、扩增。采用倒置相差显微镜观察细胞增殖分化情况;使用碱性磷酸酶(ALP)和VonKossa染色的方法,鉴定其成骨性能;用MTT法描绘标准细胞浓度-OD值曲线。结果:BMSCs在培养皿中贴壁生长、增殖;经ALP和VonKossa染色证实其有成骨潜能;标准BMSCs细胞浓度-OD值曲线显示细胞浓度和OD值呈线性正相关。结论:可以通过在体外分离纯化骨髓并诱导培养,获得足够数量、有成骨潜能的BMSCs作为骨组织工程的种子细胞。     

骨骼肌卫星细胞体外培养及分化为成骨样细胞的实验研究

目的:评估骨骼肌卫星细胞(skeletalmusclesatellitecells,SMSCs)体外分化为成骨样细胞的能力,探讨骨骼肌卫星细胞作为骨组织工程种子细胞的可能性。方法:取新生Wistar大鼠骨骼肌,采用酶消化法分离出SMSCs,体外原代及传代培养,经腺病毒介导的人骨形成蛋白2(Ad-BMP2)基因转染后,行成骨细胞标志物活性的检测及细胞化学染色,并进行细胞体外矿化能力的测定。结果:转染后细胞的碱性磷酸酶(ALP)活性增强(P<0.01)且组织化学染色呈阳性,骨钙素及I型胶原的免疫细胞化学染色呈阳性,21d后见钙结节形成。结论:体外培养的骨骼肌卫星细胞可以向成骨方向转化,有望成为骨组织工程的种子细胞。     

多孔型活性CPC复合骨髓基质细胞构建组织工程骨的实验研究

目的:观察多孔型活性磷酸钙骨水泥用作骨组织工程支架材料的可行性.材料与方法:抽取成年毕格犬的骨髓,贴壁法获得骨髓基质细胞,经成骨诱导培养液体外培养、扩增、诱导后观察细胞增殖情况.将培养的第3代细胞接种于多孔型活性磷酸钙骨水泥,进行超微结构观察,并将多孔型活性磷酸钙骨水泥/骨髓基质细胞复合物植入毕格犬背部皮下,2,4周后进行组织学检测.结果:碱性磷酸酶染色呈阳性;Von Kossa染色可见钙结节形成;骨钙素免疫细胞化学染色呈阳性;超微结构观察可见细胞生长附着于材料网孔内表面;组织学检测提示4周时复合物内有新骨形成.讨论:活性多孔CPC/BMSCs骨修复材料孔径250μm,孔隙率为70%,易于BMSCs的渗入发育成骨.结论:多孔型活性磷酸钙骨水泥/骨髓基质细胞复合物显示良好的成骨活性,多孔型活性磷酸钙骨水泥可以用于骨组织工程支架材料.     

兔骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定

［摘要］ 目的 寻求一种安全高效的兔骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs )的体外分离培养和鉴定方法。方法 采集兔胫骨骨髓组织,采用全骨髓贴壁培养法体外分离培养和扩增BMSCs;倒置相差显微镜观察细胞,取生长良好的第5代细胞成骨,免疫细胞化学染色和流式细胞术检测细胞表面标志物。结果 原代和传代的 BMSCs 贴壁生长,呈漩涡状排列生长;诱导后碱性磷酸酶活性持续高,有钙结节形成并茜素红染色阳性;CD29、CD44、CD105分子呈阳性, CD45、C-kit、CD34分子呈阴性。结论 成功建立了兔BMSCs 体外分离纯化、培养的有效方法,扩增的 BMSCs 具有多向分化潜能,是理想的组织工程种子细胞。     

犬骨髓基质细胞向成骨细胞诱导分化的实验研究

目的:研究犬骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)在体外诱导分化为成骨细胞的方法和活性检测。方法:抽取犬骨髓3 mL,使用成骨条件培养液,贴壁法体外培养,将培养的第2、3代细胞进行透射电镜、流式细胞仪、生长曲线、碱性磷酸酶、Von Kossa和免疫组化等检测。结果:第2代细胞碱性磷酸酶染色呈阳性表达;第3代细胞Von Kossa染色、骨桥素、骨涎蛋白和骨钙蛋白呈阳性表达;第3代细胞透射电镜显示高尔基体和线粒体丰富;流式细胞仪检测显示第3代处于S期的细胞比例较第2代增加。结论:犬骨髓基质细胞在体外能定向诱导分化为成骨细胞。     

骨髓基质干细胞诱导内皮细胞与自体骨髓基质干细胞低氧条件下培养后的成骨能力

目的:探讨骨髓基质干细胞(BMSCs)诱导内皮细胞(ECs)与自体BMSCs低氧条件下联合培养对BMSCs成骨能力的影响.方法:体外分离培养兔BMSCs并向ECs诱导培养,用CD34免疫细胞化学染色鉴定内皮细胞表型:实验分组为BMSCs常氧成骨诱导培养组,BMSCs低氧成骨诱导培养组,BMSCs+ ECs常氧成骨诱导联合培养组BMSCs+ECs低氧成骨诱导联合培养组,持续培养7d,前6d应用PNPP法每天固定时间测定碱性磷酸酶(ALP)活性并作统计学分析;茜素红染色观察第7d矿化结节形成情况.低氧组为1.0％O2浓度.采用SPSS11.0软件包对数据进行方差分析和q检验.结果:BMSCs在一定诱导条件下可诱导为ECs,CD34免疫细胞化学染色为阳性;统计学分析表明,BMSCs+ ECs低氧成骨诱导联合培养组的ALP活性表达显著高于其他3组(P＜0.05).只有BMSCs+ ECs低氧成骨诱导联合培养组有钙化结节形成,茜素红染色呈橘红色.结论:在一定时间内,由BMSCs诱导来源的ECs与自体BMSCs低氧条件下联合培养,BMSCs的成骨活性可显著提高.     

Effects of ultrasound on the proliferation and differentiation of cementoblast lineage cells

BACKGROUND: The purpose of this study was to investigate the effects of low-intensity pulsed ultrasound (LIPUS) stimulation on the proliferation and differentiation of cementoblast lineage cells. METHODS: An immortalized human periodontal ligament cell line (HPL) showing immature cementoblastic differentiation was used. Cultured HPL cells were subjected to LIPUS exposure (frequency = 1 MHz; pulsed 1:4; intensity = 30 mW/cm(2)) or sham exposure for 15 minutes per day. Expression levels of alkaline phosphatase (ALP), type I collagen (Col-I), runt-related gene 2 (Runx2), bone sialoprotein (BSP), osteocalcin (OCN), and osteopontin (OPN) mRNA were analyzed with real-time polymerase chain reaction analysis. Furthermore, ALP activity, collagen synthesis, and protein level of Runx2 were examined after 6 days of LIPUS exposure. RESULTS: mRNA and protein levels of ALP, Col-I, and Runx2 were significantly increased by LIPUS exposure compared to controls, whereas BSP, OCN, and OPN mRNA expression could not be detected in HPL cells, irrespective of LIPUS exposure. CONCLUSION: LIPUS enhanced ALP activity, collagen synthesis, and Runx2 expression of HPL cells, which provides important insight into the promotion of early cementoblastic differentiation of immature cementoblasts.     

永生化成牙本质细胞表达牙本质基质蛋白的实验研究

目的　探讨永生化人成牙本质细胞样细胞系hTERT-hOd-l表达牙本质基质蛋白的情况。方法　矿化液培养hTERT-hOd-l细胞5周,检测骨钙素(OC)分泌量和碱性磷酸酶(ALP)活性。采用免疫组织化学、RT-PCR和原位杂交方法检测Ⅰ型胶原、骨涎蛋白(BSP)、牙本质基质蛋白1 (DMP1)以及成牙本质细胞标志物牙本质涎磷蛋白(DSPP) 和牙本质涎蛋白(DSP)在细胞中的表达。结果　在矿化液诱导下,hTERT-hOd-l细胞ALP活性和OC分泌量升高。 hTERT-hOd-l细胞在mRNA水平上表达BSP、DMP1和DSPP,在蛋白质水平上表达DSP和Ⅰ型胶原。结论　hTERT- hOd-l细胞在体外表达牙本质基质蛋白,具有矿化的潜能。     

山羊骨髓基质干细胞向成骨细胞诱导后成骨分化相关基因表达的变化

目的:研究山羊骨髓基质干细胞向成骨细胞诱导后成骨分化相关基因ALP、OCN、COL I mRNA表达水平的变化.方法:采用全骨髓培养法培养骨髓基质干细胞,使用成骨条件培养液体外诱导成骨细胞,通过细胞形态学观察、免疫组化染色、钙结节等检测手段进行成骨细胞鉴定,采用RT-PCR和实时定量PCR检测诱导2周后骨髓基质干细胞ALP、OCN、COL Ⅰ的表达水平,未诱导的骨髓基质干细胞作为对照组.结果:通过成骨细胞鉴定,骨髓基质干细胞成功诱导分化为成骨细胞:OCN和COL Ⅰ基因存细胞诱导组表达上调,ALP基因表达在诱导组和未诱导组间无显著差异.结论:成功诱导山羊BMSCs向成骨细胞分化,成骨分化相关基因在诱导后为适应成骨细胞的功能发生变化.     

Behaviour of rat‐cultured dental pulp cells in three‐dimensional collagen type‐1 gel in vitro and in vivo

The purpose of this study was to investigate the growth and differentiation potential of dental pulp cells (DPCs) in three‐dimensional (3‐D) collagen type‐1 scaffold in vitro and in vivo. Third passage DPCs were cultured in a 3‐D collagen and expression of both bone‐ or dentin‐related mRNA (alkaline phosphatase (ALP), bone sialoprotein (BSP) and osteopontin (OPN)) and morphological changes evaluated in vitro. In the in vivo study, two types of grafts were transplanted into the rectus abdominus muscles of rats and harvested after 7 days: DPCs in α‐minimal essential medium and DPCs mixed with a collagen gel. ALP, BSP and OPN were used as primary antibodies for immunohistochemical study. Histological and immunohistochemical results showed that DPCs in collagen gel were spindle shaped and showed significantly greater expression of ALP, BSP and OPN in vitro than the controls. Transplanted DPCs in collagen type‐1 gel showed greater positive immunoreactivity for ALP, BSP and OPN than the controls. It was concluded that the collagen gel scaffold encouraged the differentiation of DPCs into osteoblastic cells.     

Temporal and spatial mRNA expression of bone sialoprotein and type I collagen during rodent tooth movement.

To investigate the mechanism of bone formation during tooth movement, in situ hybridization was performed with digoxigenin-labelled RNA probes to detect bone sialoprotein (BSP) and type I collagen mRNAs in the dentoalveolar tissue of 72 Sprague-Dawley rats. An elastic band was inserted between the first and second right maxillary molars, and the teeth experimentally moved for 1, 3, and 7 days. The left first maxillary molar was used as the control. For the untreated molars, osteoblasts and osteocytes near the distal surface of the interradicular septum (IRS) expressed a high level of both BSP and type I collagen mRNAs, while cells on the mesial side of the IRS showed a low level of these mRNAs. For the first molars subjected to experimental tooth movement, a high level of type I collagen mRNA expression was found in the osteoblasts on the tension side of the IRS after 1 day of experimental tooth movement. A high level of BSP mRNA was detected after 3 days of experimental tooth movement. However, a negligible amount of both mRNAs was found in cells on the compression side. These results support the hypothesis that BSP may be involved in mineralization during physiological bone remodelling. On application of orthodontic force, osteoblasts were activated and induced to express BSP mRNA, which is involved in bone remodelling due to orthodontic force. In addition, response to the orthodontic force was observed in osteocytes.