富血小板血浆促进人牙髓细胞增殖的实验研究

目的探讨不同浓度富血小板血浆(Platelet rich plasma,PRP)对人牙髓细胞(human dental pulp cells,HDPCs)的增殖作用。方法两步离心法制备PRP,通过ELISA的方法测定PRP中两种主要生长因子血小板源性生长因子(PDGF-AB)和转化生长因子(TGF-β1)的浓度;用四唑盐比色法(MTT)观察5%、10%、20%PRP在2d、4d时对牙髓细胞的增殖作用,并探讨这种作用是否依赖于胎牛血清(FBS)的存在。结果所制备的PRP中血小板的浓度大于1000×109个/L,为全血中的4倍以上,经ELISA的方法测定PRP及贫血小板血浆(Platelet poor plasma,PPP)中PDGF-AB、TGF-β1的浓度分别增加4倍以上。MTT法测定不同浓度组的PRP对牙髓细胞均有增殖作用,以10%PRP增殖效应最明显,P值均<0.05;4d时PRP对细胞的增殖作用明显强于2d时,P值<0.05;10%PRP组较10%胎牛血清组增殖作用明显,P值<0.05。结论本实验制备的PRP含有较高浓度的PDGF-AB及TGF-β1,不同浓度的PRP均能有效促进牙髓细胞增殖,以10%PRP浓度增殖效应最明显;并且这种增殖作用并不依赖于胎牛血清的存在;随着时间延长,PRP对细胞增殖作用增加。     

富血小板血浆对人牙周膜细胞增殖及分化的影响

目的:探索不同浓度富血小板血浆(platelet-rich plasma,PRP)对人牙周膜细胞体外增殖和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性的影响.方法:两步离心法制备PRP,用酶联免疫吸附法检测血浆、PRP、激活后PRP上清液中转化生长因子-β1(transforming growth factors-β1,TGF-β1)和血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factorAB,PDGF-AB)的水平.分别用2%、5%、105、20%激活后的PRP作用于人牙周膜细胞,以DMEM培养液为阴性对照.在作用24h和72h后,用细胞计数试剂盒检测细胞增殖状况,以对硝基磷酸二钠为底物,检测细胞ALP的活性.用SPSS10.0软件包中的方差分析和配对t检验进行统计学分析.结果:激活后的PRP上清中,TGF-β1和PDGF-AB的水平均高于未经激活的PRP和血浆.各浓度PRP促细胞增殖和ALP活性的作用均显著强于阴性对照组(P＜0.001);各浓度PRP 72h时促细胞增殖和ALP活性的作用均高于24h时(P＜0.01);不同浓度PRP组问存在显著差异(P＜0.001),PRP浓度从2%渐增至10%时,细胞增殖和ALP活性随之增加;当PRP浓度达到20%时,促细胞增殖作用开始下降,而促ALP活性作用继续增强.结论:在1～3d内,PRP对人牙周膜细胞的体外增殖和ALP活性均有促进作用,并在一定范围内呈剂量依赖关系.     

富血小板血浆对根尖乳头干细胞增殖的影响

目的:观察不同浓度富血小板血浆(platelet-rich plasma,PRP)对人根尖乳头干细胞(human apical papilla stem cells,HAPSCs)增殖的影响.方法:两步离心法制备PRP,并用ELISA法测定其中血小板数以及血小板源性生长因子(PDGF-AB)、转化生长因子(TGF-β1)的浓度;组织块法分离、培养HAPSCs,分别用含5％、10％、20％ PRP的DMEM中进行培养(以不含PRP的DMEM作对照),在培养1、2、3、4、5d各时间点以CCK-8法检测各组HAPSCs的增殖活性.结果:所制备的PRP中血小板数和各生长因子浓度均大于全血;与对照组相比,不同浓度PRP对HAPSCs的增殖均有明显促作用(P＜0.05),且随培养时间越来越明显,各实验组4d时的促进增殖作用均明显强于2d时(P＜0.05);不同浓度PRP相比,以10％组促增殖作用最强,与另两组相比各时间点差异均有统计学意义(P＜0.05),而5％与20％组相比无统计学差异(P＞0.05).结论:5％、10％、20％的PRP对HAPSCs的增殖均有明显促进作用,其中以10％组最为显著.     

PRF 及所含三因子对大鼠脂肪干细胞增殖和黏附的影响

目的：研究富血小板纤维蛋白（PRF）及其所含三因子 TGF-β1、PDGF-AB、VEGF 分别对大鼠脂肪干细胞（ADSCs）增殖和黏附的影响。方法：将 ADSCs 培养在含有 PRF 膜和不同浓度的 PDFG-AB、TGF-β1、BEGF 中,细胞黏附实验检测培养2 h 后细胞黏附能力,CCK-8法检测培养1～7 d 细胞增殖。结果：黏附实验显示,PRF 组的黏附细胞数显著高于阴性对照组（P ＜0．05）;不同浓度的 PDGF-AB 组内黏附细胞数的差异无统计学意义（P ＞0．05）;不同浓度的 TGF-β1、VEGF 组内黏附细胞数的差异有统计学意义（P ＜0．05）。CCK-8实验表明,PRF 组的细胞增殖在各个时间点（1、3、5、7 d）显著高于阴性对照组（P ＜0．05）;不同浓度的 PDGF-AB、VEGF 组内细胞的增殖差异有显著性（P ＜0．05）;不同浓度的 TGF-β1组细胞增殖的差异无显著性（P ＞0．05）。结论：PRF 能提高 ADSCs 的增殖和黏附的能力。PDGF-AB 和 VEGF 可促进 ADSCs 的增殖;TGF-β1和 VEGF 均可促进 ADSCs 的黏附,并呈一定的量效正相关。     

富血小板血浆对根尖乳头干细胞增殖及矿化的影响

目的：探讨不同浓度富血小板血浆（Platelet—rich plasma,PRP）对根尖乳头干细胞（Stem cell from the apical papilla,SCAP）增殖及矿化的影响。方法：两步离心法制备PRP,通过ELISA的方法测定PRP中血小板源性生长凶子（PDGF—AB）和转化生长因子（TGF—B1）的浓度;CCK-8法、ALP活性检测法观察5％、10％、15％、20％PRP与对照组在1d、2d、3d、4d、5d、6d时对根尖乳头干细胞增殖及矿化作用的影响。结果：PRP中血小板浓度大于全血中血小板浓度,为全血中的5倍以上。CCK-8法测定不同浓度组的PRP对根尖乳头细胞增殖均有促进作用,以10％PRP增殖作用显着,P〈0．05。PRP组与对照组相比,3d时,ALP活性无显著性差异（P〉0．05）;6d时,差异有显著性（P〈0．05）。结论：PRP对根尖乳头干细胞的增殖及矿化均具有促进作用,以10％PRP增殖效应最为显著。     

血小板血浆对人牙髓细胞增殖的影响

目的：观察血小板血浆及其细化成分对人牙髓细胞增殖的影响。方法：使用因正畸而拔除的人牙的牙髓细胞，用细胞定量测定试剂盒测定细胞增殖情况。结果：5％的多血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP）、5％和10％的洗净血小板（washed platelet，WPLT）均明显地促进了人牙髓细胞的增殖，而且WPLT的作用较PRP更显著。乏血小板血浆（platelet-poor plasma，PPP）呈浓度依赖性地抑制了人牙髓细胞增殖，5％WPLT促进人牙髓细胞增殖的作用。结论：去除血浆成分的WPLT对培养的人牙髓细胞增殖有明显的促进作用；血浆中可能存在对抗血小板生长因子作用的因子。     

富血小板血浆对人真皮细胞增殖及PDGF、TGF-β和VEGF表达的影响

目的:研究富血小板血浆(PRP)对人真皮成纤维细胞(hFbs)增殖、分化及胞质中PDGF、TGF-β和VEGF表达量的影响。方法:2次离心法制备PRP,成骨诱导条件下hFbs培养液中加入不同浓度PRP于第12天、21天钙-钴法染色,第21天茜素红染色;免疫细胞化学法检测加不同浓度PRP后第4天细胞PDGF、TGF-β和VEGF的表达;碱性磷酸酶染色(ALP)检测细胞活性;CCK-8法检测有和无成骨诱导条件下不同浓度PRP对细胞增殖的影响。结果:茜素红染色显示,2.8%PRP组钙结节形成最明显;钙-钴法染色显示,2.8%PRP组矿化作用最强;免疫细胞化学结果表明PDGF表达存在剂量依赖性,TGF-β和VEGF表达虽无剂量依赖性,但有适宜浓度的要求;ALP染色表明3%PRP组细胞增殖明显,活性最强。CCK-8检测表明各浓度PRP对hFbs均有促增殖作用,PRP加成骨诱导组比单纯PRP组表现出更明显的促增殖作用,其中4.8%PRP促增殖作用最强。结论:适宜浓度的PRP可促进hFbs增殖,但相关因子的表达存在适宜浓度的要求,PRP通过促进细胞增殖,增加相关因子表达促进创伤愈合。     

TGF-β1对人年轻恒牙牙髓细胞的增殖效应

目的:探讨转化生长因子(transforminggrowthfactor,TGFβ1)对培养人牙髓细胞的增殖效应。方法:应用MTT、3H-TdR渗入法观察TGFβ1对人牙髓细胞的增殖效应。结果:TGFβ1浓度在0.1ng/ml～100ng/ml时均可显著促进牙髓细胞的增殖,增殖效应呈现出浓度依赖性。结论:TGFβ1可能通过促进牙髓细胞的增殖参与牙本质—牙髓复合体的修复过程。     

Smad7反义寡核苷酸对TGF-β1调控人牙髓细胞生长和分化的影响

目的 :观察Smad7反义寡核苷酸对转化生长因子 β1(transforminggrowthfactor -β ,TGF -β1)调控人牙髓细胞生长和分化的影响。方法 :细胞培养 ,细胞转染 ,MTT比色测定法和碱性磷酸酶活性测定法。结果 :Smad7反义寡核苷酸促进TGF -β1对人牙髓细胞增殖的诱导作用和对碱性磷酸酶活性的抑制作用。 结论 :Smad7参与介导TGF -β1对人牙髓细胞增殖和ALP活性的调控 ,提示TGF -β1调控人牙髓细胞生长和分化可能是通过Smad信号途径发生的     

富血小板纤维蛋白与富血小板血浆体外释放生长因子的比较及其对脂肪干细胞增殖分化的影响

目的比较富血小板纤维蛋白（PRF）与富血小板血浆（PRP）体外释放生长因子的质量浓度及其对脂肪干细胞（ADSCs）增殖和成骨分化的影响。方法抽取兔耳中央动脉血,一次离心法制备PRF,二次离心法制备PRP,分别将其置于5 mL新鲜的α-MEM培养液中,分别于37 ℃下静置1、7、14、21、28 d,收集PRF与PRP析出液,检测析出液中转化生长因子-β1（TGF-β1）及血小板源性生长因子-AB（PDGF-AB）的质量浓度。将收集的PRF与PRP析出液配置成条件培养液培养ADSCs,观察其对ADSCs增殖及碱性磷酸酶（ALP）活性的影响。结果1）生长因子释放情况：不同时间点的PRF析出液中,14 d时TGF-β1的质量浓度达到最高,7 d时PDGF-AB的质量浓度最高;不同时间点的PRP析出液中,1 d时TGF-β1与PDGF-AB的质量浓度即达最高,以后逐渐下降。2）对ADSCs增殖及ALP活性的影响：PRF析出液中,14 d时对其影响最大;PRP析出液中,1 d时对其影响最大。结论与PRP相比,PRF能够缓慢持久地释放生长因子,更有力地刺激ADSCs的增殖和分化。     

锌指E盒结合同源框2在人牙髓组织和细胞的表达

目的：检测锌指E盒结合同源框2（ZEB2）在人牙髓组织和细胞中的表达,并初步探讨其意义。方法：制作牙髓组织石蜡切片,荧光原位杂交技术（FISH）检测 ZEB2的表达;实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测正常及TGF-β1刺激下人牙髓细胞（hDPCs）中ZEB2 mRNA表达水平;制作hDPCs细胞爬片, FISH检测ZEB2的表达。结果： FISH结果显示ZEB2在牙髓组织中主要表达于成牙本质细胞层,在牙髓细胞呈弱阳性表达。 RT-qPCR结果显示TGF-β1的作用促进ZEB2的表达,且具有浓度和时间依赖性,5ng/ml TGF-β1刺激ZEB2表达达最大（P〈0.05）;5ng/ml TGF-β1刺激后, ZEB2 mRNA在24h内表达逐渐上调,24h达峰值（P〈0.05）。 FISH结果示ZEB2在正常hDPCs胞质和胞核均呈弱阳性表达, TGF-β1刺激24h后ZEB2表达增强,胞核表达明显。结论： ZEB2在牙髓组织中主要表达于成牙本质细胞层,正常hDPCs中弱阳性表达,而TGF-β1可促进hDPCs中ZEB2表达,提示ZEB2可能通过参与TGF-β1信号通路调控hDPCs的成牙本质向分化过程。     

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目的观察大鼠磨牙应用矿物三氧化物凝聚体（MTA）直接盖髓术后牙髓组织中转化生长因子-β1（TGF—β）的表达变化及其在牙髓损伤修复中的作用。方法本研究于2012年10月至2013年3月在中国医科大学口腔医学院中心实验室进行。28只雌性Wistar大鼠第一磨牙机械穿髓后用MTA直接盖髓,并以对侧第一磨牙为对照,分别于术后1、3、5、7、14、21、28d处死动物并取材（每次处死4只）,进行免疫组化染色,观察TGF-β1在牙髓组织的动态表达和定位情况,用图像分析软件测定各组标本中TGF—β1阳性染色的光密度值。结果在正常牙髓组织中TGF—β1基本无表达,MTA直接盖髓后TGF—β1表达强度呈先升高后降低的基本变化,其中盖髓后5d的TGF—β1表达最强,21d时接近正常水平。表达主要位于盖髓剂下方中性粒细胞、成牙本质细胞、成纤维细胞和血管内皮细胞。结论MTA直接盖髓后,TGF—β1可能参与牙髓的损伤修复过程。     

转化生长因子β3促进兔牙髓干细胞成骨向分化机制的初步研究

［摘要］ 目的 探讨转化生长因子β3（transforming growth factor β3,TGF-β3 ）体外联合兔牙髓干细胞(rabbit dental pulp stem cells,rDPSCs)诱导其成骨向分化的作用机制。方法 酶解组织块法分离获得rDPSCs;将rDPSCs分为实验组（rDPSCs+80ng/ml TGF-β3）,对照组（rDPSCs+矿化液）和空白组（rDPSCs）,三组细胞分别培养第7、14d行ALP活性定量检测;RT—qPCR检测COL-IA1、Runx-2, OPN, BSP和Smad4基因的表达;western blot法检测COL-1A1,Runx-2蛋白的表达情况;茜素红染色观察矿化结节形成情况。结果 成功分离获得rDPSCs;实验组ALP含量明显高于对照组和空白组（P＜0.05）;COL-1A1、Runx-2、OPN、BSP、Smad4基因的表达均高于空白组（P＜0.05）COL-1A1、Smad4基因的表达高于对照组（P＜0.05）; Western blot结果示实验组COL-1A1,Runx-2蛋白的表达均强于其余两组（P＜0.05）;实验组矿化结节较其余两组明显。结论 TGF-β3体外促进rDPSCs成骨向分化;TGF-β3促进rDPSCs成骨向分化可能通过激活Smad通路来实现。     

缓释人富血小板血浆生长因子壳聚糖微球的制备

目的：制备载人富血小板血浆（hPRP）生长因子壳聚糖微球,观察其体外缓释效果。方法：选用离子凝胶法制备壳聚糖微球,利用微球吸附hPRP生长因子;以微球对hPRP中主要生长因子TGF-β1的吸附率作为评价指标,优化微球制备配方,并观察优化配方微球体外缓释TGF-β1效果;以hPRP中PDGF-AB为对象考察优化配方微球对其吸附率、载生长因子率,验证微球吸附效果。结果：当壳聚糖溶液浓度为2.5mg/ml、10mg/ml多聚磷酸钠溶液滴加量为2.5ml时可获得优化的壳聚糖微球制备配方。优化配方微球对hPRP中主要生长因子TGF-β1、PDGF-AB吸附率分别为78.02%、58.28%,载生长因子率分别为3.70ng/mg、1.31ng/mg;载hPRP生长因子的微球体外21天缓释TGF-β1累计35.80ng,占吸附总量的85.52%。结论：本实验制备的壳聚糖微球可初步实现吸附hPRP复合生长因子,并初步达到体外缓释效果。     

不同生长因子对大鼠牙乳头细胞生物学特性的影响

目的：探讨bFGF＋IGF1、TGFβ1＋BMP4、bFGF＋IGF1＋TGFβ1＋BMP4对体外培养的大鼠牙乳头细胞（rDPCs）增殖、分化的影响并筛选出最佳的组合因子。方法：分离培养、鉴定rDPCs,应用四唑盐（MTT）比色法和酶动力学法分别检测不同组合因子刺激后的第1/4/7/10/14天rDPCs的增殖活性、细胞内总蛋白合成量、碱性磷酸酶（ALP）的分泌水平,应用罗式诊断分析法和放射免疫分析法检测细胞上清液内钙、磷浓度和骨钙素含量。结果：组①bFGF（10ng/mL）＋IGF1（100ng/mL）在P4d能最显著地促进rDPCs的增殖、分化与矿化,并在P10d能显著地升高细胞外液的钙离子、磷离子浓度;组②TGFβ1（5ng/mL）＋BMP4（10ng/mL）在P4d能最大程度地促进rDPCs的分化、矿化并显著促进细胞外液骨钙素的分泌合成,且在P7d能最显著地促进rDPCs内总蛋白的合成（P〈0.05）。结论：bFGF＋IGF1、TGFβ1＋BMP4两组因子均可促进rDPCs的增殖活性和分化潜能,为体外牙齿再生提供实验依据。     

表皮生长因子对牙囊细胞增殖活性的影响

目的：研究表皮生长因子（EGF）对体外培养的大鼠牙囊细胞增殖活性的影响。方法：原代培养Wistar大鼠牙囊细胞,选择生长良好的第3代细胞,分别加入不同浓度的EGF（0.5、1、5、10、50 ng/mL）与牙囊细胞共孵育5 d,MTT法对比观察不同浓度的EGF对牙囊细胞增殖活性的影响。数据采用SPSS 13.0软件包进行方差分析。结果：在EGF浓度为5～10 ng/mL时,牙囊细胞的增殖活性显著增高（P〈0.05）,10 ng/mL时达到最高（P〈0.01）。结论：EGF可作用于牙囊细胞,合适浓度的EGF能显著增加牙囊细胞的增殖活性。