着色性干皮病基因B对白介素-6介导血管平滑肌细胞增殖作用的影响及机制

目的探讨着色性干皮病基因B（xeroderma pigmentosumB,XPB）对白介素-6（IL-6）介导人血管平滑肌细胞（VSMC）增殖及凋亡的影响。方法用脂质体转染法将重组质粒pcDNA3.1-XPB和空载质粒pcDNA3.1稳定转染VSMC,然后给予100 U/mL的IL-6孵育48 h。实验分为6组:空白对照组;pcDNA3.1组;pcDNA3.1-XPB组;IL-6组;IL-6+pcDNA3.1组;IL-6+pcDNA3.1-XPB组。用RT-PCR和Western blot法检测XPB、Bcl-2、Bax和野生型p53（wtp53）表达量的变化;用MTT法观察细胞增殖活力;用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率。结果 RT-PCR和Westernblot检测发现,重组质粒pcDNA3.1-XPB的转染使得细胞XPB表达增高（P<0.05或P<0.01）,同时使得Bcl-2表达降低、Bax和wt-p53表达增高（P<0.05或P<0.01）,并能抑制IL-6促进VSMC的Bcl-2表达增高、Bax和wt-p53表达降低的作用（P<0.05或P<0.01）;MTT结果显示,XPB高表达抑制了细胞增殖活力（P<0.05）,并能抑制IL-6促进VSMC增殖的作用（P<0.05）;流式细胞仪结果显示,XPB高表达引起了细胞G₀/G₁期增加（P<0.05）、S期减少（P<0.05）、凋亡率增加（P<0.01）,并能抑制IL-6促进VSMCG₀/G₁期减少、S期增加、凋亡率降低的作用（P均<0.01）。结论 XPB基因能抑制VSMC增殖并促进其凋亡,并能抑制IL-6促进VSMC增殖和降低其凋亡的作用,有望成为治疗动脉粥样硬化的靶点。     

着色性干皮病基因D对白介素-6促进人血管平滑肌细胞增殖作用的影响

目的血管平滑肌细胞(vascular smooth musclecell,VSMC)过度增殖是促进动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)发生发展的一个关键因素。而且在AS损伤中,白介素-6(interleukin-6,IL-6)起到了刺激VSMC过度增殖的作用。有研究发现,着色性干皮病基因D(xeroderma pig-mentosum D,XPD)表达上调能促进某些类型细胞的凋亡。然而,XPD对VSMC的增殖和凋亡是否有影响目前未见相关报道。为此,本研究探讨XPD对IL-6促进人VSMC增殖作用的影响及其与AS之间的关系。方法用脂质体转染法将重组质粒pEGFP-N2/XPD和空载质粒pEGFP-N2稳定转染VSMC,然后给予100 U/mL的IL-6孵育48h。实验分为6组:(1)空白对照组;(2)pEGFP-N2组;(3)pEGFP-N2/XPD组;(4)IL-6组;(5)IL-6+pEGFP-N2组;(6)IL-6+pEGFP-N2/XPD组。用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白报告基因表达情况;用MTT法观察细胞增殖活力;用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率;用RT-PCR和Western blotting检测XPD、Bcl-2、Bax和野生型P53(wild type P53,wtP53)表达量的变化。结果在荧光显微镜下,可在转染了重组质粒pEGFP-N2/XPD或空载质粒pEGFP-N2的细胞中观察到绿色荧光,即转染成功;MTT结果显示,重组质粒pEGFP-N2/XPD的转染抑制了细胞增殖活力(P<0.01)。结论 XPD能抑制VSMC增殖并促进其凋亡,并能抑制IL-6促进VSMC增殖和降低其凋亡的作用,有望成为治疗动脉粥样硬化的靶点。     

乙型肝炎病毒X基因下调miR-192对人肝癌细胞株HepG2凋亡的影响

目的 探讨乙型肝炎病毒X基因(HBx)通过调节人肝癌细胞株HepG2中miR-192的表达而抑制其凋亡的机制.方法 设立3个细胞组:稳定转染HBx基因的HepG2细胞(HepG2/HBx),稳定转染空载体pcDNA3.1的HepG2细胞(HepG2/pcDNA3.1)以及未作转染的HepG2细胞.用流式细胞术分析3个细胞组的凋亡率差异,用Taqman探针荧光定量PCR检测3组细胞中miR-192的表达水平.转染miR-192后,用流式细胞术检测HepG2细胞凋亡率的变化,同时用SYBR Green荧光定量PCR和Western blot检测细胞中p53、PUMA表达的变化.计量资料均数的比较用单因素方差分析.结果 HepG2/HBx细胞的凋亡率为2.37％±0.35％,较HepG2/pcDNA3.1、HepG2细胞(11.46％±0.69％、12.50％±0.66％)明显降低(F=171.722,P＜0.01).miR-192表达在HepG2/HBx细胞中为49.1％±5.9％,较HepG2/pcDNA3.1、HepG2细胞(98.0％±8.9％,100％)也明显下调(F=14.319,P＜ 0.05).转染miR-192后HepG2细胞的凋亡率(15.74％±1.17％)较转染相应阴性对照的HepG2细胞的凋亡率(10.74％±1.15％)显著升高(F=18.415,P＜0.05),同时,p53、PUMA基因在mRNA (953:1.68±0.12比0.90±0.09,F=43.115,P＜0.05 ; PUMA:1.66±0.10比0.98±0.06,F=22.541,P＜0.05)和蛋白质水平(p53:3.07比1,PUMA:2.13比1)的表达均显著上升.结论 miR-192促进HepG2细胞凋亡,HBx通过下调miR-192抑制HepG2细胞凋亡.     

盐酸地尔硫(艹卓)对血管平滑肌细胞增殖与凋亡的影响

目的 探讨合贝爽对血管平滑肌细胞(VSMC)增殖和凋亡的影响及其作用机制.方法 将VSMC随机分为五组,分别为空白组、模型组(AngⅡ10<'-7>mol/L)和模型+合贝爽1、2、3组(剂量分别为10<'-5>、10<'-6>、10<'-7>mol/L),应用MTT法检测VSMC的生长率,TUNEL法检测凋亡率,RT-PCR检测Bcl-2、Bax、Fas和P53 mRNA的表达.结果 合贝爽抑制VSMC增殖,促进VSMC凋亡,抑制抗凋亡基因Bcl-2的表达,促进促凋亡基因Bax、Fas和P53的表达.结论 合贝爽使VSMC增殖减少,凋亡增加,其机制可能与抑制抗凋亡基因Bcl-2表达、促进促凋亡基因Bax、Fas和P53表达有关.     

SOCS1对氧化低密度脂蛋白促进人血管平滑肌细胞增殖作用的影响

目的血管平滑肌细胞(vascular smooth musclecell,VSMC)过度增殖是促进动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)发生发展的一个关键因素。而且在AS损伤中,氧化型低密度脂蛋白(oxidative low-density lipoprotein,oxLDL)起到了刺激VSMC过度增殖的作用。有研究发现,细胞因子信号转导抑制因子-1(suppressor of cytokine signaling-1,SOCS1)表达下调能促进某些类型细胞的凋亡。然而,SOCS1对VSMC的增殖和凋亡是否有影响目前未见相关报道。为此,本研究探讨SOCS1对oxLDL促进人VSMC增殖作用的影响及其与AS之间的关系。方法用脂质体转染法将靶向人SOCS1基因的siRNA(SOCS1-siRNA)和阴性对照siRNA(NC-siRNA)转染VSMC,然后给予100μg/mL的oxLDL孵育48 h。实验分为6组:空白对照组;NCsiRNA组;SOCS1-siRNA组;oxLDL组;oxLDL+NC-siRNA组;oxLDL+SOCS1-siRNA组。用RT-PCR和Western blot法检测SOCS1、Bcl-2、Bax和野生型p53(wt-p53)表达量的变化;用MTT法观察细胞增殖活力;用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率。结果 RT-PCR和Western blot检测发现,SOCS1-siRNA的转染使得细胞SOCS1表达降低(P<0.01)。结论 SOCS1表达下调能抑制VSMC增殖并促进其凋亡,并能抑制oxLDL促进VSMC增殖和降低其凋亡的作用,有望成为治疗动脉粥样硬化的作用靶点。     

IL-18增强pcDNA3.1/SjOST48抗血吸虫感染的免疫保护性研究

目的探讨白细胞介素18 (IL-18)是否能增强DNA疫苗候选抗原pcDNA3.1/SjOST48对日本血吸虫病感染的免疫保护效果。方法构建pcDNA3.1/SjOST48和pcDNA3.1/IL-18真核载体,表达重组蛋白。Western blotting检测HeLa细胞内重组质粒pcDNA3.1/SjOST48和pcDNA3.1/IL-18表达情况,ELISA检测细胞培养基中IL-18的表达情况。100只雌性BALB/c小鼠随机均分为PBS组(空白对照组)、 pcDNA3.1组(空质粒组)、pcDNA3.1/IL-18组、 pcDNA3.1/SjOST48组和pcDNA3.1/SjOST48+pcDNA3.1/IL-18组等5组,各组小鼠左后腿股四头肌肌内注射相应的重组质粒(30μg),共免疫3次,每次间隔14 d。末次免疫后2周,各组取5只小鼠采集血样,ELISA检测各组小鼠血清IgG抗体及其亚类(IgG1和IgG2a)水平。末次免疫后3周,各组取5只小鼠脾组织,无菌分离小鼠脾淋巴细胞,ELISA检测小鼠脾淋巴细胞上清中TNF-α、 INF-γ、 IL-2、 IL-4、 IL-6和IL-17含量及脾淋巴细胞增殖水平。末次免疫后2周,各组取15只免疫小鼠感染血吸虫尾蚴(20±1)条/鼠。感染后6周处死小鼠,无菌分离肝,计算减卵率;门静脉灌注法收集成虫,计算减虫率;另取肝组织,切片后行HE染色,显微镜下观察肝虫卵肉芽肿数量及炎症浸润情况。结果末次免疫后2周,ELISA结果显示,pcDNA3.1/SjOST48+p cDNA3.1/IL-18组、 pcDNA3.1/SjOST48组、 pcDNA3.1/IL-18组小鼠的IgG抗体水平分别为0.82±0.07、 0.41±0.06、0. 16±0. 05,均高于pcDNA3. 1组的0. 12±0. 03 (P 0. 05); pcDNA3. 1/SjOST48+pcDNA3. 1/IL-18组较pcDNA3. 1/SjOST48组和pcDNA3.1/IL-18组均增高(P 0.05); pcDNA3.1/SjOST48+pcDNA3.1/IL-18组和pcDNA3.1/SjOST48组的IgG2a/IgG1比值分别为4.02±0.01、 2.51±0.01 (P 0.05),均1,其他3组均1。末次免疫后3周,pcDNA3.1/SjOST48+pcDNA3.1/IL-18组小鼠脾淋巴细胞上清中的IL-2、 TNF-α、 INF-γ、 IL-6和IL-17含量分别为(101.82±8.90)、(738.02±146.22)、(593.41±51.07)、(685.64±171.2)、(261.32±48.19)pg/ml,高于pcDNA3.1/SjOST48组[(55.82±9.69)、(538.21±85.26)、(393.41±51.07)、(335.64±62.63)、(118.32±8.91) pg/ml](P 0.05)和pcDNA3.1/IL-18组[(35.16±6.43)、(284.40±69.96)(141.91±24.48)、(198.44±38.15)、(47.66±14.33) pg/ml](P 0.05),三者均高于pcDNA3.1组[(12.91±8.01)、(74.86±6.64)(23.75±6.06)、(82.75±10.96)、(22.91±13.80) pg/ml](P 0.05); IL-4含量为(12.28±7.08) pg/ml,与pcDNA3.1/SjOST48组[(15.03±10.12) pg/ml]、 pcDNA3.1/IL-18组[(13.59±4.42) pg/ml]、 pcDNA3.1组[(16.13±10.08) pg/ml]比较差异无统计学意义(P 0.05)。pcDNA3.1/SjOST48+pcDNA3.1/IL-18组脾淋巴细胞增殖水平为11.84±0.16,高于pcDNA3.1/SjOST48组(5.93±0.25)(P 0.05)和pcDNA3.1/IL-18组(3.19±0.36)(P 0.05),三者均高于pcDNA3.1组(2.08±0.16)(P 0.05)。末次免疫后2周,经日本血吸虫感染后6周,pcDNA3.1/SjOST48+pcDNA3.1/IL-18组小鼠的平均检获成虫数为(14.33±1.08);与pcDNA3.1组比较,减虫率和减卵率分别为46.19%和44.68%,高于pcDNA3.1/SjOST48免疫组(32.18%和35.78%)和pcDNA3.1/IL-18组(13.22%和16.68%)(P 0.05)。各组小鼠肝组织切片HE染色结果显示,与其他4组比较,pcDNA3.1/SjOST48+pcDNA3.1/IL-18组小鼠肝组织虫卵结节较少,虫卵肉芽组织数量明显减少,炎症浸润不明显。结论 IL-18能使pcDNA3.1/SjOST48免疫小鼠诱导较高水平的Th1型和Th17型免疫应答,并且增强其抗血吸虫感染的免疫保护效果。     

Dickkopf-1克隆及其抗结肠癌作用

目的:探讨Dkk1 cDNA抗结肠癌的机制.方法:利用脂质体介导pcDNA3.1( )Dkk1进行瞬时转染结肠癌细胞CT26和表达Dkk1的肝癌细胞HEPA1-6, 转染后的细胞为实验组, 转染空载体pcDNA3.1( )的细胞和未转染的细胞分别为空载体组和未转染组, 用MTT法检测CT26增殖、免疫印迹法检测细胞Dkk1, p53, Bcl-2和Bax的表达量.结果: MTT实验显示在570 nm的吸光度均值CT26实验组明显低于其空载体组和未转染组(0.779±0.025 vs 0.968±0.016, 0.973±0.016), P<0.05); 与CT26空载体组和未转染组相比, 实验组p53, Bcl-2的表达量降低、而Dkk1、Bax表达增高.结论:外源Dkk1可反馈抑制突变型p53的生成, 下调Bcl-2, 增加Bax因子表达而抑制结肠癌的增殖.     

周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂和3-磷酸甘油醛脱氢酶复合基因真核表达载体的构建及免疫研究

目的 构建周期型马来丝虫(Bm)半胱氨酸蛋白酶抑制剂(CPI)和3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)重组复合基因真核表达质粒,观察其在小鼠体内的细胞免疫应答效应.方法 将重组质粒pGEM-T/BmCPI和pGEM-T/BmG APDH以及真核重组表达载体分别进行双酶切,构建真核重组表达质粒pcDNA3.1 (+)-BmCPI/BmGAPDH.将纯化的pcDNA3.1(+)-BmCPI/BmGAPDH和含非甲基化胞嘧啶和鸟嘌呤的寡聚脱氧核苷酸(CpG ODN)免疫BALB/c小鼠,并设PBS对照组及空质粒对照组,共免疫3次,每次间隔2周.采用RT-PCR方法检测肌肉组织内的目的基因,采用四甲基偶氮唑盐( MTT)法和ELISA法分别检测免疫小鼠T淋巴细胞刺激增殖指数和血清中IFN-γ、IL-4水平.统计学分析采用t检验.结果 pcDNA3.1 (+)-BmCPI/BmGAPDH复合基因真核表达载体免疫小鼠后,从小鼠肌肉组织内扩增出目的基因.免疫6周后,pcDNA3.1(+)-BmCPI/CpG组和pcDNA3.1(+)-BmCPI/BmGAPDH/CpG组T淋巴细胞刺激增殖指数分别为1.466±0.635和1.610±0.112,显著高于PBS组的1.004±0.019和pcDNA3.1(+)-CpG组的1.078±0.129(t=64.438、45.318、42.749、34.314,均P＜0.05).免疫4周后,pcDNA3.1(+)-BmCPI/BmGAPDH/CpG组IFN-γ、IL-4水平均高于pcDNA3.1(+)-CpG组(t=288.053、76.453,均P＜0.05),其中IFN-γ水平与pcDNA3.1(+)-BmCPI/CpG组相比也有明显提高(t=129.642,P＜0.05).结论 pcDNA3.1(+)-BmCPI/BmGAPDH重组复合基因真核表达载体能在小鼠体内表达,并可有效诱导特异性细胞免疫应答.     

LINC00176下调miR-761对胃癌细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响

目的探讨LINC00176对胃癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响及潜在的作用机制。方法 miR-NC组(转染miR-NC)、miR-761组(转染miR-761 mimics)、pcDNA3.1组(转染pcDNA3.1)、pcDNA3.1-LINC00176组(转染pcDNA3.1-LINC00176)、si-NC组(转染si-NC)、si-LINC00176组(转染si-LINC00176)、anti-miR-NC组(转染anti-miR-NC)、anti-miR-761组(转染anti-miR-761)、miR-NC+WT-LINC00176组(共转染miR-NC和WT-LINC00176)、miR-NC+MUT-LINC00176组(共转染miR-NC和MUT-LINC00176)、miR-761+WT-LINC00176组(共转染miR-761和WT-LINC00176)、miR-761+MUT-LINC00176组(共转染miR-761和MUT-LINC00176)、pcDNA3.1-LINC00176+miR-NC组(共转染pcDNA3.1-LINC00176和miR-NC)、pcDNA3.1-LINC00176+miR-761组(共转染pcDNA3.1-LINC00176和miR-761)均用脂质体法转染至SGC-7901细胞;采用qRT-PCR检测LINC00176和miR-761的表达水平;CCK-8法检测各组细胞增殖;Transwell检测各组细胞迁移和侵袭;流式细胞术检测各组细胞凋亡;Western印迹检测蛋白表达;双荧光素酶报告基因检测实验检测荧光活性。结果相较于正常胃黏膜细胞GES-1,胃癌细胞MGC-803、SGC-7901中LINC00176的表达水平显著降低(P0.05);过表达LINC00176、抑制表达miR-761均可抑制SGC-7901细胞增殖、迁移和侵袭,促进细胞凋亡;抑制Bcl-2、细胞周期蛋白(Cyclin)D1、基质金属蛋白酶(MPP)-2蛋白表达,促进Bax蛋、E-钙黏蛋白(cadherin)、P21蛋白表达。LINC00176靶向调控miR-761表达。过表达miR-761能逆转LINC00176对胃癌细胞SGC-7901增殖、迁移、侵袭的抑制和凋亡的促进作用。结论长链非编码RNA LINC00176可抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭,促进其凋亡,其机制可能与靶向miR-761基因有关,将可为胃癌的预防和治疗提供新靶点。     

螺内酯和缬沙坦对高血压大鼠心肌细胞凋亡相关蛋白的影响

目的探讨螺内酯和缬沙坦对肾血管性高血压大鼠左心室细胞凋亡调控相关蛋白P53、Bax及Bcl-2表达的影响。方法选取SD大鼠46只制成肾血管性高血压大鼠模型后,随机分为高血压组(N组,12只)、缬沙坦组(V组,11只)、螺内酯组(S组,12只)、螺内酯加缬沙坦组(S+V组,11只),另选10只未造模大鼠为假手术组(C组),各组治疗10周后行超声心动图检查,测定大鼠颈动脉压,应用免疫组织化学法检测P53、Bax及Bcl-2蛋白的表达。结果治疗10周后,与C组比较,N组大鼠收缩压明显升高(P0.01);与N组比较,V组、S+V组大鼠收缩压明显降低(P0.05);与C组比较,N组大鼠Bax、Bcl-2和Bax/Bcl-2明显升高,S组大鼠Bax和Bax/Bcl-2明显升高(P0.05,P0.01);与N组比较,S组大鼠Bax、Bax/Bcl-2和V组、S+V组大鼠Bax、Bcl-2、Bax/Bcl-2均明显下降(P0.05,P0.01);与S组比较,V组、S+V组大鼠Bax、Bax/Bcl-2明显下降(P0.05,P0.01)。结论两肾一夹肾血管性高血压大鼠左心室肥厚形成过程中,Bax过表达不完全依赖P53调节。缬沙坦可以通过与血管紧张素Ⅱ1型受体结合,抑制心肌细胞凋亡相关蛋白P53、Bax及Bcl-2的表达及左心室肥厚的发生。螺内酯可以通过与醛固酮受体结合明显降低P53及Bax的表达,降低Bax/Bcl-2比值,部分地逆转左心室肥厚。     

The role of XPB in cell apoptosis and viability and its relationship with p53, p21 and c-myc in hepatoma cells

BACKGROUND: Accumulation of DNA damage has been implicated in hepatocarcinogenesis. XPB plays a pivotal part in repairing damaged DNA. However, up to now, the biological effect of XPB on hepatoma cells remains elusive. MATERIALS AND METHODS: Here, we investigated the role of XPB in the apoptosis and the viability of hepatoma cells by using the terminal deoxynucleotidyltransferase-mediated dUTP-biotin nick end-labelling and cell viability assay; we also investigated their relationship with p53, p21(waf1/cip1) and c-myc by using the RT-PCR and Western blot. RESULTS: Compared with the control cells HepG2/pcDNA3.1 or HepG2, XPB-transfected HepG2 cells (HepG2/pcDNA3.1-XPB) displayed lower viability, weaker activity and higher apoptosis index. At the same time, an increased expression of p21(waf1/cip1) mRNA, protein and p53 protein in addition to a decreased expression of c-myc mRNA and protein were detected in HepG2/pcDNA3.1-XPB cells. CONCLUSIONS: Our results indicated that XPB could inhibit the proliferation of hepatoma cells and had a positive effect on the expression of p53 and p21(waf1/cip1) but a negative effect on c-myc.     

结核性胸膜炎中的IL-27对Th22细胞分化的影响

目的 探讨结核性胸腔积液IL-27对辅助性(Th) 22细胞定向分化过程的影响.方法 2014年6月至2015年6月在佛山市第一人民医院呼吸内科住院并且经胸腔镜取胸膜活检由病理学确诊的结核性胸膜炎患者20例,其中男11例,女9例,年龄25～60岁,平均35 5岁.从患者胸腔积液中的分离纯化出初始Th细胞,以含有抗-CD3+抗CD28单克隆抗体的基础培养条件为对照组,实验组则加入重组人IL-27、肿瘤坏死因子α(TNF-α) +IL-6或IL-27+ TNF-α+IL-6进行培养;在部分实验中,实验组为胸腔积液上清作为分化培养条件,加或不加入IL-27受体/Fc段嵌合体.培养7d后,使用流式细胞仪检测分化后的Th细胞表达IL-22以及特异性核转录因子芳香烃受体(AHR)的百分比.结果 对照组的Th22细胞比例为(2 2±0.9)％,AHR的比例为(4.2±0.8)％.与对照组相比,TNF-α+IL-6组的Th22细胞比例为(13.2±3.5)％、AHR的比例为(19.5±5.0)％,两者的比例显著上调(t=13.7、11.6,均P＜o.05).IL-27组的Th22细胞比例为(2.0±0.6)％、AHR的比例为(3.3±0.8)％,与对照组相比,两者的比例差异均无统计学意义(t =0.2、0.7,均P＞0.05).与TNF-α+ IL 6组相比,IL-27+TNF-α+IL 6组的Th22细胞比例为(6.0±2.0)％、AHR的比例为(8.4±2.6)％,两者的比例均显著下调(t =8.9、8.4,均P＜0.05);后续实验中,与对照组的Th22细胞比例(2.4±1 0)％以及AHR比例(4.2±1.1)％相比,胸腔积液上清组的Th22细胞比例(5.2±1.3)％以及AHR比例(6.5±1.6)％均显著上调(t=4.3、3.3,均P＜0.05).与胸腔积液上清组相比,胸腔积液上清+ IL-27受体/Fc段嵌合体组的Th22细胞比例(8.2±2.6)％以及AHR比例(13.8±2.0)％均进一步地显著上调(t=4.4、10.7,均P＜0.05).结论 IL-27本身不引起Th22细胞的分化,但对由TNF α+IL-6诱导的Th22细胞分化过程具有负向调节作用,在结核性胸膜炎微环境中能够抑制过强的Th22反应.     

小干扰RNA特异性沉默CD44基因对羧甲基壳聚糖保护大鼠软骨细胞凋亡的影响

目的 探讨小干扰RNA(siRNA)沉默大鼠软骨细胞的CD44基因后对细胞CD44基因表达的抑制作用及对软骨细胞在羧甲基壳聚糖(CMCS)作用下细胞生物学特性变化及其作用机制.方法 构建针对CD44基因特异性的siRNA(siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3),LipofectamineTM 2000转染软骨细胞.通过免疫荧光鉴定CD44基因特异性siRNA(CD44-siRNA)的转染情况,通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及蛋白印迹法检测CD44-siRNA转染细胞中CD44基因及蛋白的表达情况;通过硝普钠诱导软骨细胞凋亡并通过流式细胞技术检测CMCS对硝普钠诱导正常及经CD44-siRNA转染软骨细胞凋亡的影响.采用单因素方差分析及SNK-q检验对结果进行统计学分析.结果 免疫荧光检测发现CD44-siRNA成功转染进入软骨细胞,转染率在60％左右.RT-PCR检测结果表明,转染siRNA-1后的24、48及72 h,与空白对照组(0.429±0.053,0.501±0.037,0.341±0.009)相比,CD44的mRNA表达明显减弱(分别为0.198±0.007,0.211±0.016,0.153±0.005;q=5.93,7.01,11.23; P＜0.01).蛋白印迹法检测表明转染siRNA-1后24 h,与空白对照组相比,CD44的蛋白表达明显减弱(0.231±0.064与0.675±0.113,q=13.09,P＜0.01).流式细胞检测结果表明3 mmol/L硝普钠可以成功诱导软骨细胞发生早期凋亡[(70±6)％];50、100、200μg/ml CMCS对硝普钠诱导的凋亡有一定的抑制作用[凋亡率分别为(51±7)％,(30±4)％,(15±4)％;q=5.08,6.97,9.73;P＜0.01];但CMCS对硝普钠诱导的CD44-siRNA-1转染的软骨细胞的凋亡抑制作用比未转染组明显减弱[凋亡率分别为(34±6)％和(15±4)％,q=6.95,P＜0.01 ].结论 CD44特异性siRNA-1转染体外培养的大鼠软骨细胞能显著下调CD44基因的表达;CD44基因在CMCS保护硝普钠诱导软骨细胞凋亡中发挥重要的作用.     

CD28-T细胞亚群在类风湿关节炎患者外周血和关节液中的表达

目的 探讨CD28-T细胞亚群在类风湿关节炎(RA)患者外周血和关节液中的变化和意义。方法 随机选择RA患者45例,取新鲜抗凝外周血单个核细胞(PBMC),其中15例同时提取关节液单个核细胞( SFMC),以流式细胞技术检测CD28-T细胞数量及其表面可诱导共刺激分子(ICOS)的表达。2 组间比较用独立样本t检验。结果 ①与PBMC相比,RA患者SFMC中CD4+CD28+ ICOS+、CD4+CD28-ICOS+、CD8+ CD28+、CD8+ CD28+ ICOS+T细胞明显升高[(36±19)％与(15±8)％,t=-4.234,P＜0.01;(2.1±2.2)％与(0.6±1.4)％,t=-3.143,P＜0.01;(62±15)％与(47±18)％,t=-2.885,P＜0.01;(9±9)％与(3±3)％,t=-2.131,P＜0.05];CD8+CD28-T细胞明显降低[(38±15)％与(54±18)％,t=2.975,P＜0.01];CD8+ CD28- ICOS+、C1D4+CD28+和CD4+CD28-T细胞无明显变化（P＞0.05）。②同一RA患者SFMC与PBMC相比,CD4+CD28+ICOS+、CD8+ CD28+T细胞明显升高[(38±18)％与(16±10)％,t=-4.065,P＜0.01;(61±16)％与(41±21)％,t=-2.883,P＜0.01];CD8+ CD28-T细胞明显降低[(39±16)％与(59±21)％,t=2.949,P＜0.01]。③缓解期与活动期RA患者相比,PBMC中CD4+CD28-、CD8+ CD28-、CD28-ICOS+T细胞无明显变化（P＞0.05）。结论 RA患者关节液中CD28-T细胞亚群失衡和ICOS分子表达异常,可能是导致RA关节损伤的重要机制。     

乙型肝炎病毒/P22蛋白对HepG2细胞凋亡的影响

目的研究HBV／P22蛋白对肿瘤坏死因子（TNF）α诱导的HepG2细胞凋亡的影响。方法用放线菌素D和TNFo【分别诱导表达HBV／P22蛋白的HepG2细胞（实验组）、表达空载体的HepG2细胞（阴性对照组）和HepG2细胞（空白对照组）凋亡，雅培试剂检测细胞上清液中HBeAg的表达，Westernblot及免疫细胞化学法检测HBV／P22蛋白表达，流式细胞仪和末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷缺口末端标记（TUNEL）法检测细胞凋亡。体内实验：将前述三种细胞分别注射入裸鼠皮下，放线菌素D、TNF仅注射瘤体后，免疫组织化学法检测组织HBV／P22蛋白的表达，TUNEL法检测组织细胞凋亡率。结果实验组细胞培养上清液中HBeAg表达阳性，两对照组阴性；Westernblot及免疫细胞化学法检测均显示实验组细胞有HBV／P22蛋白表达，两对照组均为阴性；流式细胞仪和TUNEL结果均显示实验组细胞凋亡率明显低于两对照组（P〈0．05）。体内实验：实验组瘤体组织免疫组织化学检测结果显示HBV／P22蛋白表达阳性，TUNEL检测结果显示接种表达HBV／P22蛋白的HepG2细胞裸鼠瘤组织细胞凋亡率明显低于两对照组（P〈0．05）。结论HBV／P22蛋白在体内外均可抑制TNFα诱导的HepG2细胞凋亡。     

替罗非班对急性心肌梗死再灌注模型猪的梗死区微血管的保护作用

目的 研究替罗非班对猪急性心肌梗死(AMI)再灌注后梗死区微血管血流的作用,探讨替罗非班减少AMI再灌注后梗死区微血管梗阻(microvessel obstruction,MO)的作用机制和与炎性因子的关系. 方法 中国实验用小型猪,随机分为对照组和替罗非班组.通过介入球囊封闭冠状动脉的方法堵闭左前降支中段90 min后,撤出球囊制作急性心肌梗死再灌注模型.采用延迟增强多层螺旋CT(delayed enhancement multi-slice spiral CT,DE-MSCT)检测心肌梗死面积并计算体积和梗死区微血管梗阻的情况,采用酶联免疫吸附法测定血清白细胞介素( IL)-6、IL-10浓度.最后处死小猪,取得心脏标本行2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色. 结果 对照组10只、替罗非班组9只实验猪成功穿刺并行冠状动脉造影.对照组和替罗非班组各6只猪的心肌梗死再灌注模型制作成功,对照组4只、替罗非班组3只实验小猪在DE-MSCT上出现心肌梗死区微血管梗阻.两组微血管梗阻体积在AMI再灌注后各时间点均呈增加趋势,替罗非班组微血管梗阻体积在再灌注后1、24、48、72 h均小于对照组,分别为(9.6±3.1)％与(4.8±0.7)％、(13.4±3.3)％与(5.8±1.2)％、(15.1±3.8)％与(6.4±1.2)％和(15.9±4.6)％与(6.6±0.8)％,差异有统计学意义(t值分别为6.99、13.76、14.21和11.38,均P＜0.05);两组在AMI后30 min时,血清IL-6、IL-10水平开始升高,AMI再灌注后10 min至72 h的各时间点,替罗非班组血清IL-6水平明显低于对照组,而血清IL-10水平高于对照组,差异均有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01). 结论 替罗非班可缩小AMI再灌注后心肌梗死区微血管梗阻范围,除抗血小板机制外其还可能与减轻AMI再灌注后炎症反应有关.     

p38丝裂原活化蛋白激酶抑制剂减少大鼠肝脏炎症细胞因子的表达

目的 观察p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)抑制剂SB203580阻断p36 MAPK信号通路,减少脑死亡大鼠肝脏促炎细胞因子表达的作用.方法 雄性Wistar大鼠30只,体质量180～200 g,随机分3组,每组10只.脑死亡组:诱导大鼠及死亡;脑死亡+SB203580组:大鼠脑死亡诱导成功后,经阴茎背静脉注射SB203580(10 mg/kg);两组大鼠脑死亡诱导成功,行人工呼吸6 h后,若平均动脉压大于80 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa),则为脑死亡供体,获取肝脏待检.对照组:正常大鼠麻醉后取肝脏待检.逆转录-聚合酶链反应检测肝脏肿瘤坏死因子(TNF)α和白细胞介素(IL)-1β的mRNA表达,Western blot检测肝脏TNF α和IL-1 β的蛋白质表达以及磷酸化p38 MAPK的表达.多个样本间比较行One-Way ANOVA分析,SNK法行两两样本间比较.结果 脑死亡组大鼠肝脏出现p38 MAPK磷酸化,磷酸化p38 MAPK的相对表达量比对照组明显增加(0.190±0.004比0.001±0.002),差异有统计学意义(q=172.53,P＜0.01);肝脏TNF α的mRNA和蛋白质表达量分别为0.670±0.012和0.240±0.003,较对照组(分别为0.130±0.013和0.001±0.002)明显增加(q值分别为123.99和243.09,P值均＜0.01);肝脏IL-1 β的mRNA和蛋白质表达量分别为0.560±0.009和0.190±0.003,较对照组(分别为0.160±0.010和0.001±0.002)明显增加(q值分别为135.35和192.23,P值均＜0.01).脑死亡SB203580组大鼠肝脏p38 MAPK磷酸化下降,磷酸化p38 MAPK的表达量(0.120±0.004)比脑死亡组明显下降(q=63.90,P＜0.05),但仍明显高于对照组(q=108.63,P＜0.01);肝脏TNF α的mRNA和蛋白质表达量分别为0.430±0.016和0.180±0.004,较脑死亡组明显下降(q值分别为55.11和61.03,P值均＜0.01),但仍高于对照组(q值分别为68.89和182.06,P值均＜0.01);肝脏IL-1β的mRNA和蛋白质表达量分别为0.270±0.009和0.140±0.004,较脑死亡组明显下降(q值分别为98.13和50.85,P值均＜0.01),但仍高于对照组(q值分别为37.22和141.38,P值均＜0.01).结论 SB203580能抑制p38 MAPK的磷酸化,阻断p38 MAPK信号通路,减少脑死亡大鼠肝脏促炎细胞因子表达,降低肝脏免疫原性.     

血管内皮生长因子小干扰核糖核酸联合双自杀基因抗胃癌作用的体外研究

目的 探讨联合应用靶向血管内皮生长因子(VEGF)小干扰RNA(siRNA)与双自杀基因yCDglyTK对人胃癌细胞的体外杀伤作用。方法 以磷酸钙纳米颗粒为载体介导空白质粒pcDNA3.1（-）null(空白质粒组)、靶向VEGF的干扰质粒pGenesil-shVEGF(干扰质粒组)、双自杀基因质粒pcDNA3.1（-）CV-yCDglyTK(双自杀基因组)及联合基因质粒pcDNA3.1（-）shVEGF-yCDglyTK（联合基因组）转染胃癌SGC7901细胞,未转染的胃癌细胞为空白对照组,经G418筛选稳定转染的胃癌细胞株,采用RT-PCR和免疫印迹法验证目的基因表达。给予前体药物5-氟胞嘧啶(5-FC)后,通过四甲基偶氮唑盐(MTT)生长曲线、旁观者效应实验、Hoechst 33258染色及流式细胞术,观察各组细胞的生物学特性变化、凋亡细胞形态及凋亡率。采用SPSS 13.0统计学软件进行数据处理分析,组间多重比较采用LSD检验。结果成功建立4种转染不同质粒的胃癌细胞株,联合基因组及双自杀基因组均可检测到双自杀基因yCDglyTK的表达。MTT生长曲线显示5-FC作用24 h后,与空白对照组和空白质粒组相比,干扰质粒组、双自杀基因组及联合基因组吸光度值明显降低(P＜0.01)。当稳定转染联合基因的SGC7901细胞占60％、80％和100％时,细胞相对存活率分别为13.09％±2.40％、9.74％±2.83％及5.68％±1.03％。荧光显微镜下见双自杀基因组及联合基因组大量细胞呈现凋亡形态改变。流式细胞检测结果示干扰质粒组、双自杀基因组以及联合基因组的凋亡率分别为16.40％±4.68％、57.63％±4.96％及69.07％±4.69％,与空白对照组相比,差异有统计学意义(P＜0.01)。结论采用靶向VEGF siRNA与双自杀基因联合治疗可有效杀伤胃癌SGC7901细胞,诱导凋亡是其杀伤瘤细胞的重要机制之一。     

莫西沙星对大鼠气道平滑肌细胞线粒体膜电位及凋亡的影响

目的 观察大鼠气道平滑肌细胞(ASMC)在不同浓度的莫西沙星作用下,其线粒体膜电位（△Ψm）和半胱氨酸天冬氨酰蛋白酶-3（Caspase-3）表达及细胞凋亡的变化,探讨莫西沙星促进ASMC凋亡的可能机制。方法体外原代培养大鼠ASMC,按随机数字表法分为空白对照组、莫西沙星40 mg/L组（M40组）、80 mg/L组（M80组）、120 mg/L组（M120组）和200 mg/L组（M200组）,均孵育48 h后,Annexin-V/PI双标记流式细胞仪分析法检测细胞凋亡率,用JC-1荧光探针在免疫荧光显微镜下检测细胞△Ψm的变化,Western blot法检测凋亡蛋白Caspase-3的表达。结果各莫西沙星浓度组（M40组、M80组、M120组及M200组）的细胞凋亡率分别为(2.95±0.21)％、(7.39±0.63)％、(13.39±0.40)％和(21.20±1.42)％,均明显高于空白对照组的(0.94±0.05)％(均P＜0.01),并存在浓度依赖性(r=0.974,P＜0.01);荧光显微镜检测显示空白对照组以红色荧光为主,随着莫西沙星浓度增大,红色/绿色荧光强度值比率(分别为6.54±0.15、4.48±0.14、2.25±0.10和1.99±0.12)逐渐降低,与空白对照组(10.02±0.20)相比差异有统计学意义（均P＜0.01）,并存在药物浓度依赖性（r=-0.946,P＜0.01）;Western blot检测显示,空白对照组几乎无Caspase-3蛋白表达(0.31±0.03),各莫西沙星浓度组Caspase-3蛋白表达(分别为0.45±0.05、0.59±0.04、0.69±0.06和0.84±0.04)均明显高于空白对照组(0.31±0.03)（均P＜0.01）,同时也存在浓度依赖性(r=0.979,P＜0.01)。各组细胞凋亡率与△Ψm水平呈负相关（r=-0.887,P＜0.01）,与凋亡蛋白Caspase-3水平呈正相关(r=0.955,P＜0.01),各组细胞△Ψm水平与Caspase-3水平呈负相关(r=-0.951,P＜0.01)。结论 莫西沙星可能通过影响大鼠AΨm促进ASMC凋亡。