正五聚蛋白3对血管紧张素Ⅱ刺激后血管内皮细胞凋亡及血管活性物质分泌的影响

目的探讨正五聚蛋白(PTX)3对血管紧张素(Ang)Ⅱ刺激后的血管内皮细胞(HUVECs)凋亡及血管活性物质分泌的影响。方法以10~(-7) mol/L AngⅡ刺激体外培养的HUVECs 0、12、24和48 h后,Western印迹检测HUVECs中PTX3蛋白的表达。利用Lipofectamine2000将PTX3 siRNA转染至HUVECs,Western印迹检测其转染效果。将HUVECs随机分为空白组(未做任何处理)、AngⅡ组(10~(-7)mol/L AngⅡ刺激)、AngⅡ+siNC组(转染阴性对照序列后,给予10~(-7) mol/L AngⅡ刺激)和AngⅡ+siPTX3组(转染PTX3 siRNA后,给予10~(-7)mol/L AngⅡ刺激),噻唑蓝(MTT)法检测各组细胞的增殖情况,流式细胞仪检测各组细胞的凋亡,实时聚合酶链反应(RT-PCR)检测各组细胞中血管活性物质内皮素(ET)-1和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA的表达。结果随着AngⅡ刺激时间的延长,PTX3蛋白表达水平显著升高。转染PTX3 siRNA后成功下调了AngⅡ引起的PTX3表达。AngⅡ刺激可引起HUVECs增殖减弱,凋亡增强,ET-1和iNOS mRNA表达升高;下调PTX3表达能够减弱AngⅡ引起的HUVECs损伤,促进HUVECs增殖,抑制凋亡,并下调ET-1和iNOS mRNA表达。结论 PTX3在AngⅡ刺激后HUVECs中表达升高,下调其表达可抑制AngⅡ诱导的细胞凋亡及血管活性物质的分泌。     

肾素通过非血管紧张素Ⅱ途径促进大鼠血管平滑肌细胞钙化

目的 探讨肾素通过非血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)途径对大鼠血管平滑肌细胞钙化的影响及其可能的分子机制.方法 采用组织块贴壁法培养原代大鼠主动脉平滑肌细胞,利用β-甘油磷酸钠联合丙酮酸钠制备血管平滑肌细胞钙化模型.细胞随机分为6组:空白对照组(予常规培养基)、钙化组(予钙化培养基)、钙化+ AngⅡ受体阻断剂组(予钙化培养基,再予氯沙坦10-6 mol/L和PD123,31910-5 mol/L分别阻断AngⅡ受体AT1、AT2)、钙化+肾素(10-10、10-9和10-8 mmol/L)组(于钙化培养基中,先加入氯沙坦10-6 mol/L和PD123,319 10-5 mol/L,再分别予10-10、10-9和10-8 mmol/L肾素).用Von Kossa染色鉴定钙化细胞,测定各组细胞中钙含量、碱性磷酸酶(ALP)活性判断钙化程度.用RT-PCR检测成骨细胞标志物核结合因子α1(Cbfα1)和转化生长因子β1 (TGF-β1) mRNA表达,Western blot测定各组细胞Cbfα1蛋白含量.结果 与空白对照组相比,钙化组钙含量、ALP活性显著增加,Cbfα1和TGF-β1 mRNA及Cbfα1蛋白表达明显增加(P＜0.01).与钙化组相比,钙化+AngⅡ受体阻断剂组对钙化的影响无统计学差异.与钙化+ AngⅡ受体阻断剂组相比,钙化+肾素(10-10、10-9和10-8 mmol/L)组呈剂量依赖地促进大鼠血管平滑肌细胞的钙含量、ALP活性,以及Cbfα1和TGF-β1 mRNA及Cbfα1蛋白表达(P＜0.05).结论 肾素可通过非AngⅡ途径作用促进β-甘油磷酸钠诱导的血管平滑肌细胞钙化,其作用可能与TGF-β1、Cbfα1表达上调有关.     

肾素血管紧张素拮抗剂对血管紧张素Ⅱ诱导的基质金属蛋白酶高表达的抑制作用

目的 研究血管紧张素转换酶抑制剂卡托普利和血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)受体拮抗剂氯沙坦对AngⅡ诱导的血管平滑肌细胞基质金属蛋白酶-1(MMP-1)和MMP-9 mRNA表达的干预作用.方法 体外原代培养雄性Wistar大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞,分为对照组、AngⅡ组、卡托普利组、氯沙坦组和卡托普利与氯沙坦联合应用组.收集各组培养终点细胞,以反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测所收集标本中MMP-1和MMP-9 mRNA的表达,观察不同浓度AngⅡ和作用时间对血管平滑肌细胞MMP-1、MMP-9 mRNA表达的影响及卡托普利、氯沙坦的干预作用.结果 MMP-1 mRNA表达随AngⅡ浓度增加及作用时间延长而增加(P＜0.05),AngⅡ浓度为10-6mol/L时最为显著(P＜0.01).一定浓度的卡托普利(5×10-6mol/L)和氯沙坦(5×10-6mmol/L)可抑制AngⅡ的作用(P＜0.05,P＜0.01);AngⅡ为10-7、10-6、10-5、10-4mol/L时,MMP-9 mRNA表达量分别为0.47±0.03、0.86±0.04、0.94±0.14和1.12±0.19,与对照组0.10±0.04比较,差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01).卡托普利和氯沙坦可抑制AngⅡ对血管平滑肌细胞分泌的MMP-9 mRNA的促进表达作用,以卡托普利和氯沙坦联合应用时抑制作用最强;MMP-9 mRNA的表达随AngⅡ作用时间延长而增加;MMP-9 mRNA较MMP-1表达早.结论 AngⅡ可以诱导血管平滑肌细胞分泌的MMP-1和MMP-9 mRNA高表达,且存在剂量和时间依赖性.卡托普利、氯沙坦可抑制AngⅡ诱导的血管平滑肌细胞MMP-1和MMP-9 mRNA高表达;卡托普利和氯沙坦联合应用时抑制作用最强;这种抑制作用与作用时间相关.

Abstract：

Objective To investigate the effect of angiotensin converting enzyme inhibitor (ACEI) captopril and angiotensin Ⅱ receptor antagonist losartan on the mRNA expression of matrix metalloproteinase (MMP)-1 and MMP-9 in vascular smooth muscle cells induced by angiotensin Ⅱ (Ang Ⅱ ).Methods Male Wistar rats' thoracic aortic vascular smooth muscle cells were cultured in vitro.The cultured cells were divided in to control group,Ang Ⅱ group,captopril group,losartan group,and captopril plus losartan group.Cells in all groups were collected at the culture end-point.MMP-1 and MMP-9 mRNA expressions were detected by RT-PCR method in the collected specimens,and the effects of Ang Ⅱ on MMP-1 and MMP-9 mRNA expression and the intervention effects of captopril and losartan were observed in different Ang Ⅱ concentrations and different action times to vascular smooth muscle cells.Results ( 1 ) MMP-1 mRNA expression gradually increased along with the increments of Ang Ⅱ concentration and the action time (P＜0.05),and the most significant concentration was 10-6 mol/L (P＜0.01).(2)Captopril (5 × 10-6 mol/L) and losartan (5 × 10-6mol/L) inhibited the action of AngⅡ (P＜0.05,P＜0.01).MMP-9 mRNA expression was 0.47±0.03 ,0.86 ± 0.04,0.94±0.14 and 1.12±0.19 vs.0.10±0.04 (P＜0.05,P＜0.01) respectively when Ang Ⅱ concentration was 10-7 ,10-6 ,10-5 and 10-4 mol/L respectively.Captopril (5 × 10-6mol/L) and losartan (5 × 10-6 mol/I) significantly inhibited the MMP-9 mRNA expression which was stimulated by Ang Ⅱ (P＜0.05,P＜0.01),especially in captopril plus losartan group.The MMP-9 mRNA expression increased with the prolonging of stimulating time of Ang Ⅱ,MMP-9 mRNA expression was earlier than that of MMP-1.Conclusions AngⅡ increases the expression of MMP-1 and MMP-9 of vascular smooth muscle cells in a dose-and time-dependence manner.Captopril and losartan inhibit the MMP-1 and MMP-9 mRNA expression of vascular smooth muscle cells induced by Ang Ⅱ ,and the inhibition is the strongest when losartan was combined with captopril.The inhibitive effects is positively correlated to action time.     

血管紧张素(1-7)与血管紧张素Ⅱ对THP-1巨噬细胞高密度脂蛋白受体表达的影响

目的观察血管紧张素(1-7)[Ang(1-7)]及AngⅡ对THP-1巨噬细胞高密度脂蛋白受体I(SR-BI)表达的影响。方法将THP-1巨噬细胞根据AngⅡ和Ang(1-7)对SR-B1表达的影响分别分为:空白对照组及不同浓度AngⅡ组(10～10~4 nmol/L组);空白对照组及不同浓度Ang(1-7)组(10～10~4 nmol/L组);空白对照组、AngⅡ10~2nmol/L组、AngⅡ10~2 nmol/L+Ang(1-7)组(10~2～10~4 nmol/L组)、AngⅡ+Ang(1-7)+A-779组。运用RT-PCR和Western blot法检测各组SR-BI mRNA及SR-BI蛋白表达的变化。结果与空白对照组比较,AngⅡ10～10~4nmol/L组SR-BI mRNA及蛋白表达明显下调,呈浓度依赖性(P<0.05);而Ang(1-7)10～10~4 nmol/L组SR-BImRNA及蛋白表达明显上调,呈浓度依赖性(P<0.05);与空白对照组和AngⅡ组比较,AngⅡ10~2 nmol/L+Ang(1-7)组(10~2～10~4 nmol/L组)SR-BI表达明显上调,呈浓度依赖性(P<0.05)。与空白对照组比较,AngⅡ+Ang(1-7)10~2 nmol/L+A-779组SR-BI mRNA及蛋白表达明显下调(P<0.05)。结论 Ang(1-7)通过其特异性MAS受体浓度依赖性地拮抗AngⅡ抑制SR-BI的表达,促进胆固醇外流,提高了胆固醇逆转运的效率。     

肾上腺髓质素对血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞MCP-1表达的影响

目的观察肾上腺髓质素（ADM）对血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导的大鼠主动脉血管平滑肌细胞（VSMCs）单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）表达的影响。方法体外培养大鼠主动脉VSMCs。实验分组：空白对照组（A组）;1×10^-7mol/L ADM组（B组）;1×10^-7mol／LAngⅡ组（C组）;1×10^-8mol／L ADM＋1×10^-7mol／L AngⅡ组（D组）;1×10^-7mol／LADM＋1×10^-7mol／LAng Ⅱ组（E组）。采用逆转录聚合酶链反应技术测定细胞中MCP-1 mRNA的表达量。结果C组MCP-1 mRNA的表达量高于A组（P〈0．05）。D组、E组MCP-1 mRNA的表达量低于C组（P〈0．05）。结论ADM对Ang Ⅱ诱导的大鼠主动脉VSMCs MCP-1的表达起明显的抑制作用,这可能是其发挥抗炎、心血管保护作用机理中的一个重要途径。     

转染血管紧张素Ⅱ受体(AT1)反义核苷酸对血管平滑肌细胞增殖的影响

目的:评价转染AT1反义核菩酸(AT1A)对血管平滑肌细胞(VSMCs)血管紧张Ⅱ(AngⅡ)受体亚型mRNA表达、蛋白激酶C(PKC)、丝裂素活化蛋白激酶p38(P38MAPK)蛋白表达,及蛋白核酸合成的作用.方法:RT-PCR克隆AT1 cDNA序列(476bp),将克隆的AT1cDNA反向插入PcDNA3.1,构建一完整的含AT1A的质粒(PAT1A),测序鉴定.转染培养的大鼠VSMCs,RT-PCR检测转染VSMCs AT1mRNA表达.AngⅡ(10-7mol/L)刺激24 h后,比较转染与非转染的VSMCs AT1与AT2 mRNA表达(RT-PCR)、P38MAPK和PKC蛋白表达(免疫印迹,western blot)、蛋白核酸合成(3H-Leucine及3H-Thymidine掺入).结果:成功构建PAT1A.RT-PCR显示转染VSMCs AT1 mRNA表达量显著减少,与对照VSMC相比差异显著(P＜0.01).AngⅡ(10-7mol/L)刺激24 h后,与非转染VSMCs相比,转染VSMCs AT1 mRNA明显减少(P＜0.01),AT2 mRNA明显增加(P＜0.01);但两组间PKC和P38MAPK蛋白表达;3H-Leu及3H-TdR掺入量均无显著性差异(P＞0.05).结论:经AT1A封闭后,能显著抑制VSMC AT1mRNA表达,同时上调AT2 mRNA.单纯封闭AT1 mRNA并不能有效阻断AngⅡ介导的VSMCs蛋白核酸合成及VSMCs生长相关的信号转导,其他信号通路可能有代偿作用.     

氧化低密度脂蛋白对大鼠血管平滑肌细胞弗林蛋白酶表达的影响

目的:研究氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)对体外培养的大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)弗林蛋白酶(furin)表达的影响,初步探讨ox-LDL影响活性转化生长因子-β(TGF-β)产生的作用机制。方法:本实验分为5组:对照组,ox-LDL 20、40、80、100mg/L组;体外培养大鼠VSMCs,按实验方案给予不同浓度ox-LDL作用24h后,采用实时定量PCR和western blot方法检测各组细胞furin的mRNA及蛋白表达量,用荧光分析法检测各组furin的活性。结果:与对照组比较,ox-LDL 20、40mg/L组的furin蛋白表达量升高[(0.628±0.013),(0.991±0.009),(1.078±0.033),P<0.01],而ox-LDL 80、100mg/L组furin的蛋白表达量下降[(0.584±0.017),(0.559±0.021),P<0.05]。结论:低浓度ox-LDL(20、40mg/L)促进大鼠VSMCs中furin的表达,而高浓度ox-LDL(80、100mg/L)则抑制furin的表达;ox-LDL可能通过furin途径影响活性TGF-β的产生,从而影响斑块的稳定性。     

缬沙坦对血管紧张素Ⅱ抑制klotho基因表达的影响

目的:研究血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)调控klotho基因表达的机制,探讨缬沙坦(valsartan)对其调控作用的影响。方法:将大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)与干预药物共培养。(1)按AngⅡ浓度梯度0(对照组)、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L和时间梯度0(对照组)、3、6、12和24h分组培养,用RT-PCR检测klotho mRNA的表达水平。(2)按Valsartan浓度梯度0(对照组)、10-9、10-7、10-5和10-3mol/L分组培养,RT-PCR检测klothomRNA的表达。(3)设对照组、AngⅡ(10-7mol/L)组、AngⅡ(10-7mol/L) Valsartan(10-5mol/L)组和Valsartan(10-5mol/L)组,用RT-PCR和免疫组化法检测klotho mRNA和蛋白表达。结果:(1)AngⅡ对klotho mRNA表达呈量效抑制关系,但在时效关系上,klotho在3h点被AngⅡ抑制(P<0.05),6~12h klotho mRNA表达量逐渐增加,而24h后klotho mRNA表达减少,呈明显抑制状态(P<0.05)。(2)不同浓度Valsartan对klotho mRNA的表达无显著影响,组间差异无统计学意义(P>0.05)。(3)AngⅡ可明显抑制klotho表达(P<0.05),给予Valsartan阻断AngⅡ作用后,klotho表达增高(P<0.05),而Valsartan本身对klotho表达无影响(P>0.05)。结论:AngⅡ对klotho基因的抑制作用呈浓度依赖性,Valsartan可拮抗AngⅡ对klotho基因的抑制作用,血管紧张素Ⅱ1型受体是AngⅡ调控klotho基因表达的关键环节。     

血管紧张素Ⅱ对巨噬细胞移动抑制因子mRNA表达的影响

目的探讨血管紧张素(Ang)Ⅱ是否能通过核因子(NF)-κB途径调节巨噬细胞移动抑制因子(MIF) mRNA的表达。方法佛波酯诱导THP-1细胞48 h并使其转化为巨噬细胞,用CD68进行免疫细胞化学鉴定。第一组:对照组、AngⅡ1×10~(-8)mol/L组、AngⅡ1×10~(-7)mol/L组、AngⅡ1×10-6mol/L组、AngⅡ1×10~(-5)mol/L组。第二组:对照组、AngⅡ(1×10(-6)mol/L)组、AngⅡ(1×10~(-6)mol/L)+吡咯烷二硫代氨基甲酸铵(PDTC)组、PDTC组。Western印迹方法检测第一组细胞核内NF-κB的表达。Real time RT-PCR方法检测第二组巨噬细胞MIF mRNA的表达。结果 Western印迹随着AngⅡ浓度的升高,NF-κBp65的表达逐渐增强。Real time RT-PCR:AngⅡ组MIF mRNA表达明显高于对照组;给予NF-κB特异性抑制剂PDTC后,由AngⅡ诱导的MIF mRNA表达明显降低。结论 AngⅡ能通过NF-κB信号通路促进巨噬细胞MIF mRNA的表达。     

N-乙酰半胱氨酸对血管紧张素Ⅱ致成纤维细胞增殖及纤维连接蛋白表达的作用研究

目的:探讨不同浓度N-乙酰半胱氨酸(NAC)对血管紧张素Ⅱ致成纤维细胞(CFs)增殖及纤维连接蛋白(FN)表达的影响。方法:分离培养1~3日龄SD大鼠乳鼠的CFs,分组加入不同浓度的血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)及NAC进行干预。1组加入普通培养基(含10%FBS的DMEM培养液);2组在普通培养基中加入终浓度为2.5×10-7μmol/L的AngⅡ;3组在普通培养基中加入终浓度为5.0×10-7μmol/L的AngⅡ;4组在普通培养基中加入终浓度为5.0×10-7μmol/L的AngⅡ和5.0μmol/L的NAC;5组在普通培养基中加入终浓度为5.0×10-7μmol/L的AngⅡ和10.0μmol/L的NAC。采用免疫荧光法检测各组FN的蛋白表达水平;CCK8法检测各组CFs的增殖活性,RT-PCR检测各组FN的mRNA表达水平。结果:与1组相比,2组CFs增殖活性、FN mRNA及蛋白表达水平均明显升高(P均0.01)。与1组及2组相比,3组CFs增殖活性、FN mRNA及蛋白表达水平均明显升高(P均0.01)。在培养基中加入NAC进行干预,4组和5组与3组相比,CFs增殖活性、FN mRNA及蛋白表达水平均明显降低(P均0.01);5组较4组CFs增殖活性、FN mRNA及蛋白表达水平均明显降低(P均0.01)。结论 :NAC在抑制CFs增殖及减轻FN在心肌间质沉积的过程中发挥重要作用。     

血管紧张素Ⅱ促血管平滑肌细胞增殖和细胞外基质降解作用的研究

目的探讨血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对血管平滑肌细胞(VSMCs)基质金属蛋白酶2(MMP2)活性的影响及其与细胞增殖的关系。方法体外培养大鼠主动脉VSMCs,用AngⅡ进行刺激,采用明胶酶图法检测MMP2的活性。结果经AngⅡ处理12、24、48h后,VSMCs的MMP2活性分别为未处理组的237、196、158倍(P<005)。但AngⅡ对VSMCs增殖的促进作用在刺激3h时较明显(P<005)。结论AngⅡ提高VSMCs的MMP2活性晚于促进VSMCs增殖作用,显示AngⅡ这两种作用具有时相差异。     

自噬在血管紧张素Ⅱ诱导血管平滑肌细胞迁移和增殖的作用

目的探讨自噬对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的血管平滑肌细胞(VSMCs)迁移和增殖的影响。方法采用体外培养大鼠胸主动脉VSMCs,采用不同浓度AngⅡ(10-10mol/L~10-6mol/L)刺激VSMCs 24 h,免疫印迹检测细胞自噬标志物LC3、Beclin1的表达;采用最佳浓度AngⅡ(10-7mol/L)对VSMCs刺激不同时间点(0 h、0.5 h、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h),同时检测LC3、Beclin1表达。采用AngⅡ1型受体阻断剂(洛沙坦钾)、AngⅡ型受体阻断剂(PD123319)进行预孵,之后采用最佳浓度AngⅡ刺激,检测LC3表达。采用自噬特异性阻断剂3-MA进行预孵,通过损伤愈合试验,CCK8增殖试验检测细胞自噬在AngⅡ诱导的VSMCs迁移和增殖的作用。结果 AngⅡ刺激可引起VSMCs发生自噬,表现为LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1上调,且呈现明显时间、剂量效应(P0.0 5),1 0-7mol/L AngⅡ刺激2 4 h自噬最强。AngⅡ1型受体(AT 1)阻滞剂(洛沙坦钾)能抑制AngⅡ诱导VSMCs的自噬(P0.05),而AngⅡ2型受体(AT2R)阻滞剂(PD123319)不能抑制AngⅡ诱导VSMCs自噬(P0.05)。自噬特异性阻断剂3-MA能抑制AngⅡ诱导VSMCs的迁移和增殖。结论 AngⅡ可通过AT1R诱导VSMCs发生自噬,从而促进VSMCs迁移和增殖。     

川芎嗪对血管紧张素Ⅱ诱导大鼠心脏成纤维细胞纤维化的影响

目的探讨川芎嗪(ligustrazine)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导心脏成纤维细胞纤维化的机制及影响。方法体外培养SD大鼠乳鼠CFs,实验分为5组,A组(对照组):培养时不加干预药物;B组(AngⅡ组):加AngⅡ10-6mol/L;C组(川芎嗪低剂量组):AngⅡ10-6mol/L+川芎嗪5 mg/L;D组(川芎嗪中剂量组)AngⅡ10-6mol/L+川芎嗪10 mg/L;E组(川芎嗪高剂量组)AngⅡ10-6mol/L+川芎嗪20 mg/L,干预48 h后,采用RT-PCR法测定α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及钙调神经磷酸酶催化亚基Aβ亚型(Cn Aβ)mRNA的表达情况;Western Blot法检测α-SMA及活化T细胞核因子3(NFAT3)的蛋白表达情况。结果与A组比较,B组α-SMAmRNA、Cn AβmRNA表达均显著增高,差异有统计学意义(P0.05),α-SMA、NFAT3蛋白的表达也显著增加,差异有统计学意义(P0.05);与B组比较,C组α-SMAmRNA、Cn AβmRNA表达差异无统计学意义(P0.05),α-SMA、NFAT3蛋白表达无统计学意义(P0.05),D组和E组α-SMA、Cn Aβ的mRNA表达均显著降低,差异有统计学意义(P0.05),α-SMA、NFAT3蛋白表达显著减少,差异有统计学意义(P0.05)。结论在一定浓度范围,川芎嗪以剂量依赖方式抑制AngⅡ诱导的SD大鼠CFs心肌纤维化过程,其机制可能与心脏成纤组细胞纤组化川芎嗪抑制CFs的钙调神经磷酸酶(Ca N)信号通路有关。     

血管紧张素Ⅰ抑制血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞增殖

目的探讨血管紧张素-(1-7)[Ang-(1-7)]对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖的影响。方法采用组织贴块法培养VSMCs,取生长良好的第3～5代细胞用于实验。随机分为对照组、AngⅡ组、Ang-(1-7)组、AngⅡ Ang-(1-7)组、AngⅡ Ang-(1-7) (A-779)组,通过3H胸腺嘧啶(3H-TdR)掺入法测定VSMCs的DNA合成,用结晶染色的方法检测细胞数目,观察VSMCs的增殖情况。结果①与对照组比,AngⅡ(100nmol/L)孵育细胞24h后可明显诱导VSMCs3H-TdR掺入量增加;Ang-(1-7)(1000nmol/L)可减少3H-TdR掺入量。②与AngⅡ组比较,Ang-(1-7)(10nmol/L、100nmol/L、1000nmol/L)呈浓度依赖性的抑制AngⅡ诱导的VSMCs3H-TdR掺入量。加入Ang-(1-7)特异性受体阻断剂A-779后,Ang-(1-7)此作用消失。③结晶染色结果显示,AngⅡ可诱导VSMCs数目明显增加(P<0.05)。Ang-(1-7)可抑制AngⅡ诱导的VSMCs增加,亦呈浓度依赖性(P<0.05)。结论Ang-(1-7)能抑制基础和AngⅡ诱导的VSMCs增殖,通过其特异性受体发挥作用。     

血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞迁移与胞浆蛋白酪氨酸激酶的激活

目的　探讨血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞 (vascularsmoothmusclecells,VSMCs)迁移与胞浆蛋白酪氨酸激酶 (proteintyrosinekinase,PTK)活性变化的关系。方法　用不同浓度的血管紧张素Ⅱ (angiotensinⅡ ,AngⅡ )刺激培养的VSMCs,利用γ 3 2 P同位素参入法测定细胞胞浆PTK活性变化 ;自制改良的BoydenChamber检测VSMCs迁移。结果　基础状态下可观测到很少量的VSMCs迁移。AngⅡ浓度为 1× 10 - 1 0 、1× 10 - 9、1× 10 - 8、1× 10 - 7和 1× 10 - 6mol L时细胞迁移数分别比对照组升高了3 7、4 6、5 9、6 6和 6 3倍 ,存在组间差异 ,峰值浓度为 1× 10 - 7mol L。AngⅡ浓度为 1× 10 - 1 0 ,1× 10 - 9,1× 10 - 8,1× 10 - 7和 1× 10 - 6mol L时胞浆PTK活性分别增高了 1 0、1 7、2 4、3 2和 2 4倍 ,峰值浓度为 1× 10 - 7mol L。统计分析显示AngⅡ诱导的VSMCs迁移与胞浆PTK激活效应显著正相关 (r=0 96 ,P <0 0 1)。 2 5 μmol L、40 μmol L的PTK抑制剂Genistein均可显著地减少AngⅡ诱导的VSMCs迁移 (与单纯 1× 10 - 7mol LAngⅡ组比较 ,P <0 0 1)。结论　激活酪氨酸激酶信号链可能是AngⅡ诱导VSMCs迁移的胞内信号转导机制之一。     

RhoA/Rho激酶通路在血管紧张素Ⅱ诱导大鼠血管外膜成纤维细胞表达纤维连接蛋白中的作用

目的观察血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对大鼠血管外膜成纤维细胞(VAF)纤维连接蛋白(FN)表达的影响,并探讨RhoA/Rho激酶通路在AngⅡ诱导FN表达中的相关机制。方法分别以不同时间(0、6、12、24、48h)和不同剂量(0、10-8、10-7、10-6、10-5 mol/L)AngⅡ刺激体外培养的SD大鼠VAF,应用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应及Western blot检测FN的表达变化,并分别应用表达目的基因N19RhoA的重组腺病毒和Rho激酶抑制剂Y27632进行干预,观察其对AngⅡ诱导FN表达的影响。结果 AngⅡ促进大鼠VAF表达FN。应用10-7 mol/L AngⅡ刺激VAF 24h,FN mRNA表达和蛋白表达增高最为明显(均P0.05)。与AngⅡ刺激组比较,表达目的基因N19RhoA的重组腺病毒和Y27632可明显抑制AngⅡ诱导的FN mRNA(N19RhoA组0.78±0.11,Y27632组0.72±0.08比AngⅡ刺激组1.82±0.12,均P0.05)和蛋白表达(N19RhoA组1.56±0.12,Y27632组1.43±0.12比AngⅡ刺激组3.89±0.32,均P0.05)。结论 AngⅡ促进大鼠VAF表达FN,RhoA/Rho激酶通路参与了该过程的调控。     

吡哆胺对血管紧张素Ⅱ诱导的自发性高血压大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响

目的:探讨吡哆胺对血管紧张素Ⅱ( AngⅡ)诱导的自发性高血压大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖的影响及其作用机制.方法:原代培养自发性高血压大鼠胸主动脉VSMCs,选3～4代处于对数生长期的细胞进行药物干预.以未加任何干预的自发性高血压大鼠VSMCs为对照组,以10-7 mol/L AngⅡ刺激作为AngⅡ组,以不同浓度(0.1 mmol/L、1.0 mmol/L、10.0 mmol/L)吡哆胺预处理作为吡哆胺组.采用四唑盐比色法检测吡哆胺对VSMCs增殖的影响,酶联免疫吸附法检测细胞上清液晚期糖基化终末产物(AGEs)水平,流式细胞仪分析细胞内活性氧簇(ROS)水平,实时荧光半定量PCR检测晚期糖基化终末产物受体(RAGE)、核因子κB( NFκB)P65、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(NADPH)氧化酶P47phox的mRNA水平.结果:与对照组相比,Ang Ⅱ组促进细胞增殖(P＜0.01),升高细胞上清液中AGEs浓度(P＜0.01),使细胞内ROS生成增多(P＜0.01),胞内RAGE、NF-κB P65、NADPH氧化酶P47phox mRNA相对量的表达均较对照组显著升高(P＜0.01);1.0mmol/L和10.0 mmol/L吡哆胺预处理可以逆转AngⅡ作用下的细胞增殖(P＜0.01),降低细胞上清液中AGEs 浓度(P＜0.01),减少ROS生成(P＜0.01),使RAGE、NF-κB P65、NADPH氧化酶P47phoxmRNA表达下降(P＜0.01),且吡哆胺10 mmol/L作用比1 mmol/L更显著(P＜0.01).结论:毗哆胺可能通过抑制AGEs的形成、降低胞内ROS水平,减少RAGE、NF-κB P65、NADPH氧化酶P47phox表达,从而有效抑制AngⅡ诱导的VSMCs增殖作用.     

骨桥蛋白参与血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞迁移

目的检测血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对骨桥蛋白(OPN)表达的影响及其涉及的信号传导途径,并探讨OPN在AngⅡ诱导中膜平滑肌细胞(VSMCs)迁移中的作用。方法采用贴壁法培养SD大鼠胸主动脉的VSMCs。以免疫印迹(Western blot)法检测OPN表达。运用Transwell观察反义OPN在AngⅡ诱导的VSMCs迁移中的作用。结果(1)体外培养的大鼠VSMCs在基础状态下表达一定水平的OPN蛋白,经10-7mol/L AngⅡ诱导24 h后,OPN蛋白水平与对照组相比增加1.3倍(P<0.05);(2)预先给予AngⅡ1型(AT1)受体拮抗剂氯沙坦(losartan)、胞外信号调节激酶(ERK)抑制剂PD98059和P38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)抑制剂SB202190后,AngⅡ诱导的OPN的表达分别下降44.2%、23.6%及72.5%(P<0.05),而其2型(AT2)受体拮抗剂PD123319对OPN的表达没有影响。(3)反义OPN可以明显抑制AngⅡ诱导的VSMCs迁移(每个视野平均迁移细胞数目26.34±5.47 vs 50.23±6.12,P<0.05),而OPN正义、错配义组无此变化。结论(1)AngⅡ上调VSMCs中OPN的表达;(2)AT1受体、ERK和P38MAPK信号系统参与AngⅡ诱导的OPN表达。(3)OPN参与AngⅡ诱导的VSMCs迁移。     

血管紧张素Ⅱ与分泌型卷曲相关蛋白5在心肌细胞肥大中相关性研究

目的:探讨分泌型卷曲相关蛋白5(s FRP5)在心肌细胞肥大中的表达情况及其发挥的作用。方法:体外培养SD乳鼠心肌细胞,应用血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导心肌细胞肥大。替米沙坦、PD123319分别阻滞血管紧张素1型受体(AT1R)、血管紧张素2型受体(AT2R)的表达,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及蛋白免疫印迹法(Western bolt)检测sFRP5、脑利钠肽(BNP)及肿瘤坏死因子-a(TNF-a)的表达。结果:s FRP5能够在心肌细胞中表达。sFRP5 mRNA及蛋白水平、BNP蛋白水平的表达随AngⅡ干预时间的延长而增加,48 h达到最高值(P0.05)。与AngⅡ(10~(-6) mol/L)组相比,AngⅡ+替米沙坦(10μmol/L)组sFRP5 mRNA和蛋白水平显著降低(P0.05),AngⅡ+PD123319(10μmol/L)组sFRP5 mRNA和蛋白水平差异无统计学意义(P0.05);与AngⅡ(10~(-6) mo1/L)+sFRP5(0 ng/ml)组比较,AngⅡ(10~(-6) mo1/L)+sFRP5(10 ng/ml)组及AngⅡ(10~(-6) mo1/L)+sFRP5(100 ng/ml)组BNP蛋白及TNF-a的蛋白表达水平明显下降(P0.05)。结论:在AngⅡ诱导的心肌细胞肥大过程中,主要通过血管紧张素Ⅱ型受体上调sFRP5的表达,且sFRP5在抑制心肌细胞肥大中发挥作用。     

骨桥蛋白参与血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞迁移

目的检测血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对骨桥蛋白(OPN)表达的影响及其涉及的信号传导途径,并探讨OPN在AngⅡ诱导中膜平滑肌细胞(VSMCs)迁移中的作用.方法采用贴壁法培养SD大鼠胸主动脉的VSMCs.以免疫印迹(Western blot)法检测OPN表达.运用Transwell观察反义OPN在AngⅡ诱导的VSMCs迁移中的作用.结果 (1)体外培养的大鼠VSMCs在基础状态下表达一定水平的OPN蛋白,经10-7mol/L AngⅡ诱导24 h后,OPN蛋白水平与对照组相比增加1.3倍(P＜0.05);(2)预先给予AngⅡ1型(AT1)受体拮抗剂氯沙坦(losartan)、胞外信号调节激酶(ERK)抑制剂PD98059和P38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)抑制剂SB202190后,AngⅡ诱导的OPN的表达分别下降44.2%、23.6%及72.5%(P＜0.05),而其2型(AT2)受体拮抗剂PD123319对OPN的表达没有影响.(3)反义OPN可以明显抑制AngⅡ诱导的VSMCs迁移(每个视野平均迁移细胞数目26.34±5.47 vs 50.23±6.12,P＜0.05),而OPN正义、错配义组无此变化.结论 (1)AngⅡ上调VSMCs中OPN的表达;(2)AT1受体、ERK和P38MAPK信号系统参与AngⅡ诱导的OPN表达.(3)OPN参与AngⅡ诱导的VSMCs迁移.