2010年安徽省蚊虫标本分离到基因Ⅰ型流行性乙型脑炎病毒

目的在安徽省不同地区开展流行性乙型脑炎病毒(JEV)病原学调查,了解当地JEV的基因型别及分子特征。方法 2010年8月在安徽省阜阳、淮南、安庆市的3个标本采集点使用诱蚊灯采集蚊虫标本,通过组织培养法分离病毒,并对病毒分离物进行血清学和分子生物学鉴定;利用生物信息学技术对新分离病毒的序列进行分析,完成同源性和系统发生分析。结果采集到3属3种共计7651只蚊虫标本,通过组织培养技术分离得到11株病毒分离物,鉴定结果显示均为基因Ⅰ型JEV。安徽省JEV新分离株与基因Ⅰ型JEV的同源性最高,核苷酸同源性为96.8%～99.5%,氨基酸同源性为97.8%～100%。结论在安徽省首次分离到基因Ⅰ型JEV,与我国上海市及浙江省JEV分离株进化关系较近。     

贵州省不同地区2008年虫媒病毒调查

目的调查贵州省不同地区虫媒病毒分布状况,对采集的蚊虫标本进行病毒分离与鉴定。方法 2008年7月在贵州省黔西、德江、榕江和从江县的4个标本采集点使用诱蚊灯采集蚊虫标本,通过组织培养法分离病毒,并对病毒分离物进行血清学和分子生物学鉴定;利用生物信息学技术对新分离病毒的序列进行分析,完成同源性和系统发生分析。结果采集到3属4种共计9160只蚊虫标本,从中分离到9株病毒,鉴定结果显示8株为盖塔病毒,1株为流行性乙型脑炎病毒(JEV);贵州省新分离盖塔病毒与原型株相比,核苷酸同源性为94.5%～94.9%,氨基酸同源性为97.4%～97.6%;新分离JEV与基因Ⅰ型JEV的同源性最高,系统进化分析结果显示属于基因Ⅰ型JEV。结论在贵州省分离到盖塔病毒和基因Ⅰ型JEV。盖塔病毒新分离株与我国其他省份分离株进化关系较近;JEV新分离株与四川省分离株进化关系较近。     

云南省澜沧江流域蚊虫流行性乙型脑炎病毒分子特征分析

目的确定2007-2009年从云南省澜沧江流域采集蚊虫中分离的13株流行性乙型脑炎病毒(JEV)基因型及其E基因序列特征。方法用反转录-聚合酶链反应(RTPCR)扩增E蛋白核苷酸序列,测序后用DNAStar软件包中的MegAlign程序完成核苷酸相似性和氨基酸同源性分析;用ClustalX1.83软件进行碱基配对后采用Mega5.0软件做进化树分析。结果 13株JEVE基因的核苷酸相似性为98.0%～100%,氨基酸的同源性为99.8%～100%,与我国乙脑减毒活疫苗株SA14-14-2的核苷酸相似性为86.1%～86.9%,氨基酸同源性为96.8%～97.2%;进化树分析发现,13株JEV均属于基因Ⅰ型。结论 2007-2009年从云南省澜沧江流域采集蚊虫中分离的13株病毒属于JEV基因Ⅰ型。     

山东省首次分离出基因1型流行性乙型脑炎病毒

目的从山东省济南市采集的蚊虫标本中分离流行性乙型脑炎（乙脑）病毒（Japanese Encephalitis Virus,JEV）,并确定其基因型别及前膜蛋白（Precursor Membrane,PrM）基因片段和包膜蛋白（Envelope,E）基因区段分子特征。方法对2008年采集的蚊虫标本进行病毒分离,对新分离的病毒进行血清学及分子生物学鉴定。逆转录-聚合酶链反应扩增新分离JEV的PrM、E区段核苷酸序列,测序后应用Clustal X（1.83）软件做碱基配对分析,MEGA3.1完成病毒进化分析,GENEDOS（3.2）软件完成氨基酸位点分析。结果共采集15700只蚊虫标本,包括库蚊、骚扰阿蚊、伊蚊、按蚊。随机抽取20批标本,从其中的1批三带喙库蚊标本中分离到1株病毒,经过血清学及分子生物学鉴定属于基因1型JEV。新分离JEV与减毒活疫苗株SA14-14-2株E区段核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为88.0%和97.2%,存在14处氨基酸位点差异。结论从山东省首次分离到基因1型JEV。     

浙江省部分地区2009--2010年蚊媒中乙型脑炎病毒分子流行病学特征研究

目的 了解浙江省部分地区蚊媒携带流行性乙型脑炎(乙脑)病毒(JEV)情况及其分子流行病学特征.方法 2009-2010年7-8月从浙江省慈溪市和仙居县乙脑监测点采集蚊13620只,利用荧光定量PCR方法检测蚊中JEV核酸,用BHK-21细胞分离病毒,扩增JEV分离株E基因,然后选择6株进行测序并进行同源性分析.结果 慈溪和仙居监测点蚊中JEV带病毒率分别为17.0％(27/159)和3.4％( 1/29);从2010年143批蚊中分离到22株JEV,分离率为15.4％.6株测序株E基因全长均为1500个核苷酸(nt),推导编码500个氨基酸(aa),未发现nt插入和丢失,nt和aa同源性分别为99.2％～ 99.8％和100.0％,与浙江省2007-2008年JEV分离株的nt和aa同源性分别为99.1％～99.3％和99.2％～ 99.8％,与乙脑疫苗株SA14-14-2同源性分别为87.6％～88.0％和97.8％.E基因进化树显示,6株测序株位于基因Ⅰ型分支上.结论 浙江省慈溪市和仙居县监测点蚊媒携带JEV,其中慈溪监测点蚊媒中乙脑带病毒率明显高于仙居监测点,JEV分离株均为基因Ⅰ型.     

辽宁省乙型脑炎病毒分离及进化树分析

目的 分离鉴定2007年辽宁省蚊虫携带流行型乙型脑炎(乙脑)病毒及基因型别.方法 用细胞培养方法分离病毒,对致金黄色地鼠肾细胞系(BHK-21)细胞病变(CPE)的病毒进行逆转录-聚合酶链式扩增(RTPCR)检测;扩增的目标片段进行序列测定;用Mega3.1软件、以邻位相连法构建进化树.结果 共分离到22株病毒,RT-PCR检测结果表明,均为乙型脑炎病毒;随机选择其中3株病毒的基因序列进行基因型鉴定分析,均为Ⅰ型乙型脑炎病毒.3株病毒E基因编码结构域(Domain)区段分析结果显示,其核苷酸和氨基酸同源性分别为99.3%和100%;与疫苗株SA14-14-2的Domain区相比,共有12个氨基酸位点变异.结论 辽宁省蚊虫标本中分离的病毒均为基因Ⅰ型乙型脑炎病毒,其中E基因所编码Domain区E-327(S→T)位点发生的变异,提示在辽宁省首次分离到乙型脑炎病毒变异株.     

四川省虫媒病毒调查研究

目的通过对四川省虫媒病毒调查,了解乙脑主要流行区蚊虫及其虫媒病毒的分布状况,为防制提供依据。方法 2006-2008年在调查点蚊虫孳生高峰期采集蚊虫标本,进行分类鉴定,并用BHK细胞分离病毒,连续3代观察细胞病变情况;收获细胞病变阳性分离物进行血清学和分子生物学鉴定;采用MEGA3.1生物学软件完成氨基酸序列和病毒进化树分析。结果三带喙库蚊和骚扰阿蚊为乙脑流行区优势种群,分离11株虫媒病毒,其中8株经IFA和RT-PCR鉴定为乙脑病毒(JEV),均属于基因Ⅰ型JEV。E基因区段核苷酸和氨基酸比较发现,8株病毒之间核苷酸和氨基酸同源性分别为98.1%～100.0%和99.7%～100.0%;与2004年四川分离株的核苷酸同源性在97.8%～99.6%,氨基酸同源性在99.3%～100.0%。另外3株病毒在BHK细胞上出现病变时间较JEV快,用20种不同种属的虫媒病毒免疫腹水IFA鉴定和相关的引物进行PCR扩增,结果均为阴性。结论在四川省乙脑流行区有5种蚊虫,其中三带喙库蚊和骚扰阿蚊为优势种群,乙脑病毒由三带喙库蚊携带,其E区核苷酸和氨基酸相对保守,有利于采取针对性防控措施。同时,分离出3株不能鉴定的虫媒病毒,提示为我国不常见种型或尚未发现的新毒种,其生物学特性和对人类的致病性有待进一步研究。     

浙江省仙居县2012-2013年流行性乙型脑炎病毒基因特征和人群血清学研究

目的：分析浙江省仙居县媒介蚊虫中流行性乙型脑炎（乙脑）病毒（JEV）基因型别和健康人群乙脑抗体水平。方法2012-2013年在浙江省仙居乙脑监测点采集蚊虫,分离JEV,测定其E基因核苷酸序列,并进行同源性与进化分析;对监测点的642名健康人群,在乙脑流行季节前后,分别采集双份血清,共计样本1263份,检测JEV中和抗体。结果采集11650只蚊虫标本,分离25株JEV,同源性分析显示,2012-2013年分离到的JEV与浙江省1982-2010年JEV之间E基因核苷酸同源性为87.8%～99.7%,与乙脑疫苗株SA14-14-2之间核苷酸同源性为87.7%～88.0%。E基因进化分析显示,2012-2013年JEV属于基因Ⅰ型,E基因编码病毒毒力和抗原表位的位点未发生改变。健康人群JEV中和抗体阳性率为31.5%～42.0%,抗体几何平均滴度（GMT）为1∶2.56～1∶3.53,流行前后人群抗体阳性率（χ2≤1.76,P＞0.05）和GMT（u≤0.64,P＞0.5）差异均无统计学意义。结论2012-2013年浙江省仙居县蚊媒中携带基因Ⅰ型JEV,健康人群JEV中和抗体阳性率≤42.0%,流行前后抗体阳性率和中和GMT均无明显变化。     

湖北省部分地区2010年蚊传虫媒病毒调查

目的继续调查湖北省蚊媒和病毒种类及其分布状况。方法 2010年夏季在湖北省恩施州、神农架林区、江陵县和随州市采集蚊虫标本,用组织培养法分离病毒,用血清学和分子生物学方法对阳性病毒分离物进行鉴定,利用生物信息学软件对新分离病毒进行序列同源性和系统进化分析。结果采集到3属4种12 845只蚊虫标本,共分离到38株阳性分离物,经血清学和分子生物学鉴定,32株阳性分离物为流行性乙型脑炎病毒(JEV),5株阳性分离物为盖塔病毒,1株为JEV和盖塔病毒感染混合株。JEV E基因序列进化分析显示新分离JEV均为基因Ⅰ型JEV。盖塔病毒NS2基因序列进化分析显示新分离病毒与中国河北省和韩国毒株同源性最高,与俄罗斯分离株进化关系较远。结论首次在湖北省分离到盖塔病毒,并再次在湖北省分离到基因Ⅰ型JEV。     

浙江省蚊媒携带流行性乙型脑炎病毒的分布特点

目的 了解浙江部分地区蚊媒及猪携带流行性乙型脑炎(乙脑)病毒情况以及浙江省存在的乙脑病毒基因型别.方法 于2007年5月至10月在浙江省仙居、龙泉和慈溪3个县人房及猪舍采集蚊虫标本和猪血清,共采集10 662只蚊虫和204份猪血清,蚊虫标本中以淡色库蚊和中华按蚊为主.利用病毒分离和荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测蚊虫携带乙脑病毒,应用酶联接免疫吸附剂测定(ELISA)方法对猪血清进行抗体检测.应用荧光定量RT-PCR方法对细胞分离株进行病毒鉴定;利用RT-PCR方法扩增新分离乙脑病毒PrM基因,并对细胞分离到的病毒进行基因分型.结果 在蚊虫标本中检出7批乙脑病毒核酸阳性样本,并分离出3株病毒,经鉴定3株病毒均为乙脑病毒,基因分析表明3株病毒均属于基因Ⅰ型乙脑病毒.猪血清有121份阳性,总阳性率为59.3%.6月份有50%以上的猪血清中乙脑病毒抗体呈阳性.结论 浙江省部分地区存在着乙脑的传播媒介,在蚊媒和猪中携带有乙脑病毒;采集的蚊虫标本中分离到3株病毒,经鉴定为基因Ⅰ型乙脑病毒,是近年来在浙江省首次分离到的基因Ⅰ型乙脑病毒.     

江西省流行性乙型脑炎病毒的分离与鉴定

目的调查江西省的虫媒病毒分布状况,在当地采集蚊虫标本进行病毒分离与鉴定。方法 2008-2009年夏季在江西省共选择8个标本采集点,使用诱蚊灯采集蚊虫标本,通过组织培养法分离病毒,并对病毒分离物进行血清学和分子生物学鉴定;利用生物信息学技术对新分离病毒的序列进行分析,完成同源性和系统发生分析。结果 2008年采集到3属3种共计11916只蚊虫标本;2009年采集到4属5种共计5905只蚊虫标本;共分离到4株病毒,经鉴定均为流行性乙型脑炎(乙脑)病毒;新分离乙脑病毒与基因Ⅰ型乙脑病毒的同源性最高,系统进化结果显示,4株乙脑病毒均属于基因Ⅰ型。结论在江西省分离到基因Ⅰ型乙脑病毒,与上海市和浙江省分离株进化关系较近。     

湖北省新分离的二株乙型脑炎病毒全基因组序列特征分析

目的 对2008年湖北省新分离的2株乙型脑炎(简称乙脑)病毒进行全基因组序列测定和分析,了解当地乙脑病毒株的分子生物学特性.方法 病毒复苏鉴定后,使用覆盖乙脑病毒全基因组的16对特异性引物,RT-PCR法扩增乙脑病毒HBZG08-09株和HBZG08-55株的全基因组片段,直接测序拼接获得全基因组序列.使用ClustalX 1.83、MegAlign、Mega 4和Genedoc 3.2等生物学软件进行序列比对、核苷酸和氨基酸同源性分析、系统进化分析及氨基酸位点差异分析.结果 新分离的2株乙脑病毒基因组全长均为10 965个核苷酸,从97位到10 392位为开放阅读框,编码3432个氨基酸,2株间的全基因组核苷酸和氨摹酸间源性分别是98.2%和99.7%.进一步的基因型研究显示HBZG08-09株和HBZG08-55株均属于基因Ⅰ型乙脑病毒.2株病毒与我国近年来在河南及浙江的乙脑病毒分离株进化关系最近.与目前使用的减毒活疫苗株SA-14-14-2相比较,HBZG08-09株全基因组共存在82个氨基酸差异,HBZG08-55株存在84个氨基酸差异.但影响毒力或抗原的关键氨基酸位点未发生改变.结论 新分离的2株乙脑病毒均属于基因Ⅰ型,与疫苗株相比关键氨基酸位点未见变异.     

辽宁省部分地区2008年虫媒病毒分离鉴定

目的在辽宁省采集蚊虫标本进行病毒分离,了解虫媒病毒分布情况。方法2008年夏季在辽宁省丹东和锦州市采集蚊虫标本,利用C6/36和BHK-21等细胞分离病毒;对新分离病毒利用血清学、分子生物学和生物信息学方法进行鉴定。结果在辽宁省丹东和锦州市共采集蚊虫标本3属5种9296只,包括库蚊属的三带喙库蚊、淡色库蚊,伊蚊属的刺扰伊蚊、背点伊蚊和按蚊属的中华按蚊。从蚊虫标本中共得到4株病毒分离物,其中1株为乙型脑炎(乙脑)病毒(丹东市的三带喙库蚊),2株为版纳病毒(锦州市的中华按蚊),1株为辽宁病毒和版纳病毒混合(锦州市的中华按蚊)。新分离乙脑病毒属于基因Ⅰ型乙脑病毒,E基因编码病毒毒力和抗原表位的位点未发生改变。结论在辽宁省再次分离到乙脑病毒,并首次证明辽宁省存在辽宁病毒。     

两种基因型流行性乙型脑炎病毒在上海市共同流行

目的掌握上海市流行性乙型脑炎(乙脑)病毒基因型别特征。方法 2002-2005年在上海市奉贤县养猪场采集蚊虫标本,研磨处理后分离病毒,完成病毒细胞学、动物学、血清学及分子生物学鉴定。测定病毒全基因组序列,应用ATGC、ClustalX(1.83)、MegAlign、GeneDoc3.2和Mega5.0等生物学软件完成序列拼接、比对、核苷酸与氨基酸同源性分析、系统进化分析。结果共采集38347只蚊虫标本,主要是三带喙库蚊。分离到13株乙脑病毒。测定13株乙脑病毒全基因组序列,结合上海市其他年份分离的乙脑病毒及涵盖5个基因型别的其他乙脑病毒全基因组序列,通过系统进化分析发现,上海市2001、2003、2005和2007年分离的乙脑病毒属于基因Ⅰ型,2004年和2006年分离的乙脑病毒属于基因Ⅲ型。结论 2种基因型别乙脑病毒(Ⅰ、Ⅲ型)在上海市共同流行。     

Study on the protective efficacy of SA14-14-2 attenuated Japanese encephalitis against different JE virus isolates circulating in China

Prior to 1976 only Japanese encephalitis virus (JEV) genotype III could be detected in China. Recently, numerous genotype I JEV strains have been isolated from JE patients, mosquitoes and pigs while genotype III strains remain present. Two kinds of JEV vaccines are currently used in China for the prevention disease: the JE live attenuated vaccine (LAV) SA14-14-2 virus and the inactivated P3 strain (IPV) vaccine. The SA14-14-2 and P3 viral strains were isolated in the year of 1953 and 1949 respectively and both belonged to the JEV genotype III. In order to evaluate the protective efficacy of both vaccines against the JEV genotype I isolates we conducted vaccination-challenge protection assays in mice. These data demonstrated that both LAV (≥234 pfu virus) and IPV (1:5 dilution) vaccines effectively conferred protection against all 16 isolates tested following intraperitoneal (i.p.) challenge. However, when vaccinated mice were challenged via intracerebral (i.c.) injection, ≥60% LAV vaccinated animals were protected against challenge with most JEV isolates but only ≤40% protection was observed following vaccination with IPV. These results indicated that JE vaccines used in China still protected effectively against both JEV genotypes now prevalent in China and that the LAV formulation conferred higher levels of protection compared to the protection conferred by IPV.