人免疫缺陷病毒I型gag、env、rev mRNA检测

目的：动态检测人免疫缺陷病毒I型（HIV－1）基因gag,env,rev mRNA 水平。方法：将插入有HIV－1竞争模板的pSPI质粒DNA转化入感受态菌STBL－2，进行扩增，以T7RNA聚合酶体外转录出HIV－1 mRNA竞争模板，用3对引物对HIV－1 RNA标本进行定量竞争聚合酶链反应（QC－RT－PCR），检测HIV－1 gag,env,rev mRNA水平。结果：HIV－1 Ⅲ B感染的标本中，HIV－1,gag,env和rev mRNA的水平分别为36000拷贝／μl，9800拷贝／μl和9100拷贝／μl，此方法可动态定量检测HIV－1 gag,env,rev mRNA水平。结论：该方法简便易行，费用低廉，适用于实验室HIV致病机理，药物筛选和病毒复制状况的研究。     

Taqman技术检测肿瘤细胞中端粒酶逆转录酶信使核糖核酸及表达的意义

目的用定量Taqman技术检测人端粒酶逆转录酶(hTERT)信使核糖核酸(mRNA)以及在肿瘤细胞中表达的意义.方法在Trizol提取总RNA后,将mRNA逆转录成互补脱氧核糖核酸,用Taqman技术定量检测hTERT mRNA,并与经典逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法比较.结果急性髓细胞白血病患者hTERT mRNA表达水平为(52.9～7.3)×104拷贝/μl,平均3.5×103拷贝/μl,其阳性率(90.3%)高于健康体检者(5.6%,χ2=29.9,P<0.05),但与经典RT-PCR检出阳性率比较, 差异无显著意义(χ2=1.3,P>0.05).Taqman技术灵敏度为1.5～3拷贝/μl,特异性为100%;在(50～5)×108拷贝/μl之间有良好的线性关系,相关系数为100%;50和5 000 拷贝/μl的标本的内变异系数(CV)1.7%和2.0%,日间CV则分别为3.7%和2.9%.结论 Taqman技术是一种快速有效、灵敏度高、特异性良好的定量检测hTERT mRNA的方法.     

多重定量PCR法同步检测HBV、HCV和HIV-1在血液筛查中的优化及应用

目的 初步探讨多重定量聚合酶链反应（PCR）同步检测乙型肝炎病毒（HBV） DNA,丙型肝炎病毒（HCV） RNA及人类免疫缺陷病毒（HIV）-1 RNA在血液筛查中的应用前景.方法 选择2012年8月至12月,于孝感市中心血站志愿献血的合格献血者血样中,经2次酶联免疫吸附法（ELISA）检测HBV表面抗原（HBsAg）、抗HCV及抗HIV-1,检测结果均呈阴性的4 800份血样为研究对象.采用全自动核酸混合提取仪对该4 800份血样进行核酸提取,然后利用多重定量PCR方法对血样中HBV、HCV及HIV-1进行同步扩增检测.采用中国药品和生物制品检定所提供的HBV DNA、HCV RNA及HIV-1 RNA标准参考品,检测多重定量PCR的灵敏度,并与单重定量PCR的灵敏度进行比较.在HBV、HCV及HIV-1 3者中任意1种病毒基因组浓度较高的条件下,对多重定量PCR检测另2种低浓度病毒基因组的能力进行评估.结果 增加多重定量PCR中c-MMLV逆转录酶和Hot Taq酶的用量,并适量加入单链结合蛋白（SSB）,可使其扩增效率提升至单重定量PCR扩增水平.本组4 800份血样中,经多重定量PCR检测出3份HBV DNA阳性样品,ELISA漏检率为0.062 5％,未发现HCV RNA和HIV-1 RNA阳性样品;多重定量PCR检测HBV DNA、HCV RNA及HIV-1 RNA在95％置信区间的灵敏度浓度分别为115 IU/mL、376 IU /mL和232 IU /mL;单重定量PCR检测HBV DNA、HCV RNA和HIV-1 RNA在95％置信区间的灵敏度浓度分别为51 IU /mL、94 IU /mL和78 IU/mL.结论 本研究初步建立了对献血者血液同时进行HBV DNA、HCV RNA及HIV-1 RNA检测的多重定量PCR检测方法;该检测体系经过进一步优化后,有望应用于临床大规模血液病毒筛查.     

人B细胞激活因子基因表达水平的荧光定量测定

目的 研究建立人B细胞激活因子(BlyS)mRNA荧光定量检测方法,探讨正常人外周血单个核细胞(PBMC)中BlyS基因表达水平。方法 基于TaqMan荧光探针技术,构建克隆载体pMD18-T-BlyS作为定量模板,在GeneAmp 5700型检测仪上,通过荧光强度达到一定阈值时的循环数来定量起始模板,以建立实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(FQ-RT-PCR)方法;并对20名健康献血者外周血中BlyS表达进行检测。结果 FQ-RT-PCR的动态检测范围为104-109拷贝/μg RNA(r≥0.996),内参三磷酸甘油醛脱氢酶的动态检测范围为103-108拷贝/μg RNA(r≥0.998);低值的批内、批间的重复性分别为17.7％和24.3％,高值的批内、批间的重复性分别为5.3％和8.1％;20名献血员健康外周血的PBMC中均有BlyS mRNA的表达,范围为5.5×104-4.9×105拷贝/μg,均值为(1.7±1.4)×103拷贝/μg。 结论 成功建立人BlyS基因表达FQ-PCR检测方法,检测结果定量准确可靠,可用于BlyS基因表达与自身免疫性疾病发病机制的关系研究。     

Her2／neu基因定量检测方法的建立

目的 建立人Her2/neu基因mRNA荧光定量检测方法 ,评价该方法 的准确性及稳定性.方法 基于TaqMan荧光探针技术,构建克隆栽体pGEM-T-Her2/neu作为定量模板,通过荧光强度达到一定阈值时的循环数来定量起始模板,以建立实时荧光定量RT-PCR方法;并且在GeneAmp 5700型检测议上测定10例经免疫组织化学法证实Her2/neu表达卅的乳腺癌组织标本,同时对最大值及最小值重复测量.结果 Her2/neu动态检测范围为103～107拷贝/μg RNA(r≥0.996),内参β-actin的动态检测范围为103～108拷贝/μg RNA(r>0.998).10例检测癌组织的Her2/neu表达范围为6.6×104～4.7×106拷贝/μg,最大值10次重复测量值为(4.65±0.55)×106>拷贝/μg,最小值10次重复测量值为(7.36±0.75)×104拷贝/μg.结论 成功建立人Her2/neu基因表达RT-PCR检测方法 ,具有较高的准确性和稳定性,可用于检测Her2/neu基因表达水平,为进一步应用于乳腺癌预后判断及术后治疗方案的选择奠定了基础.     

北京市一例HIV-1 CRFl5_01B亚型类似毒株的鉴定

目的 通过对一例HIV-1毒株env、gag和pol基因的序列分析,表明HIV-1 CRF15_01B亚型类似毒株已在北京市出现.方法 从一例在北京居住的四川籍女性HIV-l感染者(BJ06108,通过性途径感染)血浆中提取病毒RNA,使用套式PCR方法扩增env、gag和pol基因,并进行序列测定和亚型分析.结果 病例BJ06108在env、gag和pol基因区与CRF15_01B亚型参考株1501B.TH.99.99TH_MU2079基因离散率较近,基因离散率分别为8.8%、6.1%和7.2%.系统进化树分析表明BJ06108与CRF15_01B亚型参考株1501B.TH.99.99TH_MU2079聚在一起.结论 CRF15_01B亚型类似毒株已在北京市出现,应该加强HIV-1毒株亚型变异的监测.     

夫妻感染HIV-1病毒的分子流行病学研究

目的研究宁波市HIV-1感染夫妻的免疫状况和HIV毒株的亚型分布特点和流行规律。方法收集宁波市7对已经被确认为HIV-1型阳性夫妻的全血样品,对CD4+T淋巴细胞进行绝对计数,运用巢式PCR方法扩增病毒膜蛋白env基因和gag基因区并进行序列测定。应用DNASTAR软件对序列和参考序列进行比对分析,确定基因亚型。结果成功获得11条env基因序列和13条gag基因序列,确定6株为B’亚型,2株为01_AE流行重组型,2株为07_BC流行重组型,4株为08_BC流行重组型。该11例HIV-1阳性全血的CD4+T淋巴细胞绝对数最低7个/μl,最高654个/μl,平均288个/μl。结论宁波市夫妻感染HIV-1毒株存在多种亚型,大多数的感染者免疫状况低下需要抗病毒治疗,流行形势严峻,应加强对该人群免疫状况和HIV-1毒株亚型变异的监测,及时调整防治策略。     

荧光定量RT-PCR检测Rac1 mRNA基因及其与胃癌转移的关系

目的 探讨肿瘤转移相关基因Rac1水平与胃癌转移的相关性,并评价分析Rac1 mRNA基因在胃癌转移和区分胃良、恶性病变中的价值.方法 用荧光定量RT-PCR TaqMan探针技术,选择Rac1基因目的 片段,与pET-20b(+)载体连接构建重组质粒,建立Rac1 mRNA荧光定量RTPCR标准曲线,并用于检测52份胃癌、癌旁组织及12份胃良性病变组织标本中Rac1 mRNA的含量,分析评价其与胃癌转移的关系.结果 胃癌组织中Rac1 mRNA表达阳性率和含量为100.0%,7.41×103 (3.50×105 ～4.36×106)拷贝/μl,癌旁组织为46.2%,0(0～1.73×104)拷贝/μl,良性病变组织为33.3%,0(0～3.55×103)拷贝/μl,3组间阳性率和Rac1 mRNA含量水平差异均有统计学意义(x2=43.16,x2k-w=64.19,P均＜ 0.01).当ROC曲线确定荧光定量RT-PCR检测Rac1含量的最佳临界值为1.73×104 拷贝/μl时,诊断胃癌组织标本的敏感度为88.5%,特异度为100.0%;当最佳临界值为7.49×103 拷贝/μl时,诊断胃癌是否发生淋巴结转移的敏感度为57.9%,特异度为78.6%.结论 荧光定量RT-PCR检测Rac1 mRNA对鉴别胃良、恶性病变及评价胃癌转移均有参考价值.     

人类免疫缺陷病毒1型感染基因诊断方法的建立

目的 建立人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)基因诊断方法。方法 随机选取80份全国送检的已确认的HIV阳性样品，从健康献血员中选取40份HIV阴性样品。分别提取人DNA和病毒RNA，再分别扩增HIV-1的gp41、pol和gag各基因区的3套反应系统，进行巢氏聚合酶链反应(nPCR)和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)。将结果与血清学方法比较，观察结果是否一致。同时检测3套反应系统的敏感性、重复性和对HIV-1各亚型参考病毒株的扩增情况。结果 用3套反应系统对80份阳性样本进行nPCR检测的阳性率为：gp41反应系统88．8％；pol反应系统83．8%；gag反应系统81．3％；3套系统联合应用检出率90.0％。用RT-PCR检测阳性率为：gp41反应系统96．3％；pol反应系统91．3％；gag反应系统95．0％；3套反应系统联合应用检出率可达98．8％。阴性样品扩增均阴性，特异性为100％。3套反应系统不但可扩增HIV-1型M组的A、B、C、D、CRF01-AE、F、G、H亚型，还可扩增其N和O组毒株，且与HIV-2无交叉反应。nPCR最低检测限为1拷贝／PCR。gag和pol反应系统RT-PCR最低检测限为750拷贝／ml；gp41反应系统最低检测限为150拷贝／ml。nPCR和RT一：PCR扩增gp41、pol和gag基因区的重复性分别为：93．3％、90．0％、86．70h，和100%、96．7％、100％。结论 建立的HIV-1基因诊断方法敏感性、特异性和重复性较好，且成本低廉，适合我国HIV检测实验室应用。     

艾滋病患者抗病毒治疗初期不同部位HIV-1 DNA比较研究

目的 了解抗逆转录病毒治疗早期,外周血、肠黏膜相关淋巴组织及淋巴结中单个核细胞中HIV-1 DNA量的差异.方法 收集2006至2011年首都医科大学附属北京佑安医院规律随诊的留取有外周血、肠黏膜相关淋巴组织及淋巴结标本的HIV-1/AIDS患者,共11例.平均年龄39(25～55)岁,收集治疗前及治疗12周后患者的外周血、肠黏膜相关淋巴组织及淋巴结标本,用密度梯度离心法分离单个核细胞,用DNA抽提试剂盒提取DNA,用实时定量聚合酶链反应的方法检测HIV-1 DNA拷贝数.用非参数检验方法分析比较各实验组之间HIV-1 DNA拷贝数的差异.结果 治疗前,不同部位HIV-1 DNA量的差异具有统计学意义(x2=17.636,P＜0.01),肠黏膜相关淋巴组织的HIV-1 DNA量[(10714±2043)拷贝/106细胞]和淋巴结内[(9145±1202)拷贝/106细胞]高于外周血[(66±8)拷贝/106细胞,差异有统计学意义(U值均为0.00,P值均＜0.05)],治疗前淋巴结与肠黏膜相关淋巴组织中的HIV-1 DNA量之间差异无统计学意义(U=46.00,P＞0.05);抗逆转录病毒治疗12周后,不同部位HIV-1 DNA量的差异有统计学意义(x2=22.000,P＜0.01);肠黏膜相关淋巴组织的HIV-1 DNA量[(1701±790)拷贝/106细胞]和淋巴结内[(11591±1781)拷贝/106细胞]高于外周血[(18±3)拷贝/106细胞(U值均为0.00,P值均＜0.05)];肠黏膜相关淋巴组织HIV-1 DNA水平从平均10714拷贝/106细胞降低至平均1701拷贝/106细胞,差异有统计学意义(Z=-2.934,P＜0.05)外周血HIV-1 DNA水平从平均66拷贝/106细胞降低至平均18拷贝/106细胞,差异有统计学意义(Z=-2.934,P＜0.05).结论 肠黏膜相关淋巴组织及淋巴结是HIV-1 DNA储存的重要场所.     

HIV-1env、gag与IFNα-2b基因融合蛋白的免疫学研究

目的将编码艾滋病病毒（HIV-1）外膜蛋白的env基因、核蛋白的gag基因与编码干扰素（IFNα-2b）基因分别插入pSFJ16与pSFJ38真核表达载体，观察表达产物诱导机体产生细胞免疫的变化规律。方法利用分子生物学技术构建重组质粒，经质脂体转染与野生型痘苗病毒在Cos-7细胞内同源重组，筛选、纯化获得重组痘苗病毒vJ38gag／IFNα-2b和vJ16env／IFNα-2b。免疫小鼠后，检测小鼠外周血与牌淋巴细胞对ConA及LDs的反应性，用流式细胞仪测定小鼠脾细胞CD4^＋、CD8^＋，细胞计数。结果外周血与脾淋巴细胞对ConA及Lps的反应性，实验组与对照组比较有显著差异（P〈0.05）。CD4^＋T淋巴细胞与对照组比较有显著差异（P〈0．05）。CD8^＋T淋巴细胞与对照组比较无显著差异（P〉0．05），但呈增高趋势。结论重组痘苗病毒能诱导小鼠产生较强的细胞免疫。重组痘苗病毒能在体外与HIV—1 env和HIV-1 gag阳性血清发生特异性反应，具有免疫原性和免疫反应性。     

HIV-1 CRF01-AE、CRF07/08-BC和B′构造病毒株体外适应性比较

目的构建NL4-3env-EGFP/DsRed2前病毒,观察中国主要流行的HIV-1 CRF01-AE?CRF07/08-BC和B′亚型构造病毒株体外适应性。方法 5份HIV-1B′,CRF07/08-BC,CRF01-AE亚型感染的干血斑样本和1份Zambia C亚型PBMC DNA样本,经单基因组扩增技术获得env全长基因,克隆、亚克隆、转染等步骤构建14个NL4-3env-EGFP/DsRed2前病毒,按顺序进行配对竞争实验,流式细胞仪定量检测被感染细胞的数量。结果 CRF01-AE亚型前病毒适应性最强,适应性值W1,其次为B′,Zambia C,CRF07-BC/CRF08-BC,P0.05。结论可利用NL4-3env-EGFP/DsRed2构造前病毒,通过竞争实验比较流行病毒株的体外适应性,推测env基因对适应性的影响。     

凉山州某县未接受抗病毒治疗的HIV-1感染者的耐药情况分析

目的 分析凉山州某县未接受抗病毒治疗的HIV-1感染者的传播性耐药(TDR)情况,为了解当地HIV-1耐药株的传播及抗反转录病毒治疗(ART)方案的制定提供理论依据和技术支撑。方法 以来源于2022年1—8月在凉山州某县未接受ART的HIV-1感染者为研究对象,采集其血液样本并分离血浆和血细胞,血浆样本用于HIV-1 RNA定量检测和HIV-1 RNA基因型耐药检测,血细胞样本用于HIV-1 DNA定量检测和HIV-1 DNA基因型耐药检测。结果 135例研究对象中,男性75例(55.6%),女性60例(44.4%),中位年龄37.5岁,彝族占比最大(96.3%)。性途径传播为HIV-1主要传播方式(83.0%)。发生TDR的有11例,发生率为8.1%。诊断HIV-1感染距耐药检测时间的中位数为11 d。HIV-1 RNA以10 001～100 000拷贝/mL占比较多(43.7%)。HIV-1 DNA以101～1 000拷贝/10⁶ cells占比较多(55.6%)。HIV-1亚型中,以B+C亚型重组占比最高(51.9%),其次为CRF07＿BC重组型(43.0...     

实时荧光定量PCR检测结直肠腺癌患者组织中广泛型线粒体肌酸激酶基因的表达

目的 建立检测人广泛型线粒体肌酸激酶(ubiquitous mitochondrial creatine kinase,uMtCk)mRNA荧光定量的方法,并检测了结直肠腺癌病人肿瘤组织和癌旁组织中uMtCk基因表达的水平.方法 基于TaqMan荧光探针技术,以GAPDH作为内参,建立实时荧光定量RT-PCR方法,并检测了30名结直肠腺癌病人肿瘤组织和癌旁组织 uMtCk mRNA的表达.结果 30例结直肠肿瘤患者肿瘤组织中有uMtCk mRNA的表达, 范围为7.4×105 ～5.3×108拷贝/μg RNA, 均值为(9.4±5.7)×106拷贝/μg RNA; 30例癌旁组织uMtCk表达为 4.5×103～6.9×105 拷贝/μg RNA, 均值为(8.6±3.4)×104拷贝/μg RNA.结论 成功地建立了人uMtCk基因表达含量的荧光定量检测方法,检测结果可用绝对拷贝数表示,定量准确可靠.且结直肠腺癌病人肿瘤组织uMtCk mRNA的含量是升高的,提示uMtCk mRNA含量的检测有助于结直肠腺癌病人临床诊断.     

VEGF-C mRNA和VEGFR-3 mRNA实时荧光定量检测方法的建立及初步应用

目的建立检测血管内皮生长因子-C（VEGF-C）mRNA和血管内皮生长因子受体-3（VEGFR-3）mRNA的实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（FO-RT-PCR）方法,并在食管癌组织中作初步应用。方法采用TaqMan荧光探针技术,分别以pMD18-VEGF-C和pMD18-VEGFR-3质粒作为定量模板,应用循环阈值（Ct）定量起始模板,建立检测食管癌组织的VEGF-CmRNA和VEG—FR-3tuRNA的实时FQ-RT-PCR方法。结果所建方法的线性范围：VEGF-CmRNA和VEGFR-3mRNA均为10^3～10^8拷贝／μg总RNA;测定VEGF-C mRNA低值的批内、批间变异系数（CV）分别为7．07％和9．04％,测定VDGF-CmRNA高值的批内、批间CV分别为7．55％和10．28％;测定VEGFR-3mRNA低值的批内、批间CV分别为7．69％和12．49％,测定VEGFR-3mRNA高值的批内、批间CV分别为7．31％和9．17％。24例淋巴结转移食管癌患者癌组织VEGF-CmRNA和VEG—FR-3 mRNA的测定范围分别为3．69&#215;10^4～9．44&#215;10^6拷贝／μg总RNA和2．54&#215;10^4～8．03&#215;10^6拷贝／μg总RNA,均值分别为2．18&#215;10^6拷贝／μg总RNA和2．27&#215;10^6拷贝／μg总RNA。16例无淋巴结转移食管癌患者癌组织VEGF-CmRNA和VEGFR-3mRNA的测定范围分别为2．32&#215;10^3～5．85&#215;10^5拷贝／μg总RNA和7．31&#215;10^2～8．21&#215;10^4拷贝／μg总RNA,均值分别为1．08&#215;10^5拷贝／μg总RNA和1．68&#215;10^4拷贝／μg总RNA。提示有淋巴结转移的食管癌组织VEGF-C和VEG—FR-3基因表达水平上调。结论本组建立的检测VEGF-CmRNA和VEGFR-3mRNA的实时FQ-RT-PCR方法灵敏、准确、稳定、重复性好,可供VEGF-C、VEGFR-3基因表达的临床检测和研究应用。     

乙肝五项指标与荧光定量PCR检测血清HBV-DNA含量联合运用

目的 用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)技术定量检测血清中乙型肝炎病毒含量,并探讨其与乙肝五项(乙型肝炎病毒标志物)之间的关系.方法 现有450例血清标本,采用FQ-PCR检测(HBV-DNA)含量,再用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定其乙肝五项,进行相关性分析.结果 450例血清标本中,156例HBsAg (+)/HBeAg(+)/HBcAb(+)的标本,HBV-DNA的阳性为148例,阳性率为94.9％(148/156),平均病毒量为4.51×107拷贝/ml,75例HBsAg(+)/HBeAb(+)/HBcAb(+)的标本,48例HBV-DNA阳性,阳性率为64％(48/75),平均病毒量为2.42×105拷贝/ml.12例HBsAg(+)/HBcAb(+)的标本,HBV-DNA阳性为7例,阳性率为58.0％(7/12),平均病毒量为4.26× 104拷贝/ml;20例HBsAb(+)/HBeAb(+)/HBcAb(+)的标本,HBV-DNA阳性为1例,阳性率为5％(1/20),平均病毒量为6.34× 103拷贝/ml;98例HBcAb(+)的标本,HBV-DNA阳性为1例,阳性率为5％(1/20),阳性率为1.2％(1/98),病毒含量为1.35×103拷贝/ml,89例乙肝五项全阴的标本,HBV-DNA阳性为1例,阳性率为1.1％(1/89),病毒含量为8.37×103拷贝/ml,测定结果表明,HBV-DNA的阳性率及平均病毒量在乙肝五项不同组合有明显差异.结论 应用FQ-PCR定量检测HBV-DNA能准确地反映体内的HBV真实感染和复制情况.     

磁捕法对传染性非典型肺炎冠状病毒RNA富集体系的初步研究

目的 初步研究建立磁捕法对传染性非典型肺炎又称严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒RNA的富集、纯化体系,以提高逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测SARS冠状病毒RNA的敏感性。方法 根据国际基因库公布的SARS冠状病毒基因序列,自行设计引物、探针,体外克隆目的RNA片段作为标准物质;利用标准RNA以及模拟SARS血清标本的RNA,评价自行设计的SARS冠状病毒巢式RT-PCR检测体系和磁捕法SARS冠状病毒RNA富集检测体系的检测效果。结果SARS冠状病毒巢式RT-PCR检测体系,对于模拟血清SARS标本RNA的最低检测样本浓度为20拷贝/μl,而磁捕法SARS冠状病毒RNA富集检测体系的最低检测样本浓度为1拷贝/μl。结论 初步建立的磁捕法SARS冠状病毒RNA富集检测体系,可有效地对低浓度的RNA样本进行浓缩、纯化,有效提高SARS RT-PCR检测方法的敏感性。     

百日咳杆菌荧光定量PCR检测方法的建立和应用

目的 建立快速、准确、特异的定量检测百日咳杆菌的方法,并进行临床应用研究.方法 根据百日咳杆菌IS481基因序列,设计并合成引物和荧光探针,建立百日咳杆菌荧光定量PCR检测方法,并对方法的特异度、重复性和灵敏度进行评价,检测百日咳疑似患者咽拭子225份和健康者咽拭子30份.结果 该方法的标准曲线显示模板浓度在102～108拷贝/μl线性范围与其循环阈值(Ct)具有较好的线性关系,相关系数(r)为0.998,最小检出量为102拷贝.特异度较好,灵敏度较高,重复性实验结果显示在同一时间检测高低浓度阳性克隆质粒(2×107与3×103拷贝/μ1)10次,连续检测5次,变异系数(CV)为5.78%～16.7%.在不同时间检测高低浓度阳性克隆质粒(2×107与3×103拷贝/μl),连续7次,CV为8.25%～14.9%.经检测,疑似患者的咽拭子有41份样本为阳性,30份健康人咽拭子均为阴性.结论 由于本实验建立的荧光定量PCR方法快速、灵敏度高、特异度好,适合临床实验室进行临床标本的百日咳杆菌的定量检测,有较大的应用前景.     

三种HBV DNA提取方法对荧光定量PCR检测结果影响的比较

目的 研究3种核酸提取方法对黄疸、溶血和脂血标本HBV DNA荧光定量结果的影响,为进一步提高临床检验质最和改进检测技术提供理论依据.方法 采用目前临床常用的多聚糖病毒沉淀浓缩法(PEG法)、碱液直接裂解和微量核酸释放剂(Micro-Nucleic-Releaser,MNR)等3种核酸提取方法,对含有HBV的黄疸、溶血和脂血标本进行荧光定量PCR检测,研究不同标本对荧光PCR定量结果和扩增效率的影响.选择酚一氯仿提纯法作为核酸提取对照方法.结果 黄疸、溶血和脂血标本,对3种不同核酸提取方法的荧光PCR定量结果和扩增效率都产生不同程度的影响,其中完全溶血的标本对PCR扩增效率的影响最大,如定量值为4×103拷贝/ml的低拷贝完全溶血标本,MNR法测定结果为2.21×103拷贝/ml,PEG法为1.02×103拷贝/ml,碱性直接裂解法的定量值为阴性,临床自然溶血较重的标本对荧光定量检测影响较小,脂血和黄疸标本对荧光定量PCR扩增效率有明显抑制作用,但对实际定最值无明显影响;其中,MNR法在不同标本的定量重复性和荧光PCR扩增效率最好,碱液直接裂解法较差.酚.氯仿提纯法虽然获得较高的扩增效率,但存在大约有1个数量级的核酸丢失.结论 基于MNR核酸提取方法的荧光定量PCR检测,对不同的临床标本均可获得较好的扩增效率、敏感性和重复性,操作简便、快速且无核酸丢失和污染,适合临床检验应用.     

某国产人类免疫缺陷病毒1型核酸定量检测试剂的临床试验研究

目的 评价某国产人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)核酸定量检测试剂(考核试剂)和对比试剂的相关性及一致性.方法 采用国产HIV-1考核试剂和对比试剂,对197例标本进行平行检测.采用相关性分析、Bland-Altman模型等统计方法分析2种检测试剂之间的相关性和一致性.结果 197例标本中该国产HIV-1考核试剂与对比...