化学致癌剂3'-甲基-4-DAB影响SD大鼠肝干细胞的增殖与迁移

目的 采用免疫组织化学技术标记SD大鼠肝干细胞中OV6、CD34的表达,探讨肝干细胞与造血干细胞之间的关系.方法 用化学致癌剂3'-甲基-4-二甲基氨偶氮苯(3'-methy-4-dimethylaminoazobenzen, 3'-me-DAB)喂养SD大鼠4周,取大鼠肝脏,用免疫组化法标记卵圆细胞的特异性标记物OV6与造血干细胞标记物CD34在大鼠肝干细胞中的表达.结果 汇管区靠近界板处卵圆细胞同时表达OV6与CD34,阳性细胞成簇状分布,主要集中在赫令氏管周围,并见OV6和CD34阳性细胞向肝小叶内迁移,散在分布于肝细胞索;在肝实质内还分布着大量的表达OV6与CD34阳性的单核样干细胞;在肝实质内还可见多个CD34阳性小集落,集落内或周围也可见少许单核样干细胞.结论 3'-me-DAB刺激大鼠肝内卵圆细胞大量增生的同时,还可刺激骨髓造血干细胞增生并向肝内迁移与分化.     

2-乙酰氨基芴对大鼠肝卵圆细胞增殖模型的影响

目的 在建立大鼠肝卵圆细胞增殖模型的基础上，进一步研究2—乙酰氨基芴(AAF)对大鼠肝卵圆细胞增殖的影响。方法 按本室建立和改进的方案建立大鼠肝卵圆细胞增殖模型，AAF剂量分别按10、20及25mg/kg给予，同时设单纯切肝对照组、假手术对照组及生理盐水对照组，重点观察大鼠肝组织结构变化及不同剂量下肝卵圆细胞增殖情况。结果 3个对照组大鼠肝组织内均未见到肝卵圆细胞，而3个实验组均见肝卵圆细胞增生；与10mg/kg剂量组比较，20mg/kg及25mg/kg两个剂量组大鼠肝组织内的肝卵圆细胞增殖更加明显，但25mg/kg剂量组大鼠死亡率较高，存活大鼠健康状况差。结论 AAF可诱导大鼠肝卵圆细胞增殖，剂量以20mg/kg较为理想。     

三七总皂甙对大鼠肝卵圆细胞增殖肝脏CX/GJIC的影响

目的研究三七总皂甙（Panax notoginoside，PNS）对大鼠肝卵圆细胞增殖模型肝脏缝隙连接蛋白（connexin，CX）表达及其介导的缝隙连接细胞间通讯（gap junction intercellular communication，GJIC）的影响。方法选择体重150g左右的雄性Wistar大鼠，随机分为对照组、模型组和PNS组。采用2-AAF／PH方法（2-acetylamin-ofluorene＋two thirds partial hepatectomy）建立肝卵圆细胞增殖模型，切开标记／染料示踪技术（incision loading／dye transfer，IL／DT）检测肝脏GJIC，免疫组织化学法检测CX32、43的表达和计数肝卵圆细胞，并观察PNS腹内注射后的表达变化。结果（1）对照组未见肝卵圆细胞，PNS组、模型组肝卵圆细胞增殖明显；PNS组与模型组相比，卵圆细胞增殖高峰低、持续时间长。（2）各组CX32和GJIC的表达：模型组与PNS组均低于对照组，表达峰呈先下调后逐渐恢复趋势，PNS组高于模型组。（3）各组CX43的表达：模型组与PNS组均高于对照组，表达峰呈先升高后逐渐恢复与肝卵圆细胞的增殖趋势一致，PNS组与模型组相比表达高峰滞后。结论2-AAF／PH是理想的肝卵圆细胞增殖模型；CX32和GJIC的下调可动员肝卵圆细胞，CX43可促进其增殖，CX／GJIC对肝卵圆细胞增殖有重要的调控作用；PNS可通过影响CX／GJIC的表达，调节肝卵圆细胞的增殖过程。     

大鼠肝卵圆细胞的增殖模型建立和体外分离培养、诱导分化研究

目的 建立大鼠肝卵圆细胞(HOC)的增殖模型,探讨分离培养及鉴定HOC的方法.方法 采用2-乙酰氨基芴/部分肝切除术刺激建立成体大鼠肝卵圆细胞增殖模型,于肝切除术后第12天切取剩余肝脏,使用胶原酶Ⅳ消化分离和Percoll梯度离心纯化肝卵圆细胞,免疫荧光技术和KT-PCK分析法检测肝卵圆细胞标志物mRNA表达.行体外培养并添加干细胞生长因子(SCF)、肝细胞生长因子(HGF)和表皮生长因子(EGF)诱导其分化.结果 分离得到的肝卵圆细胞存活率达到90%,经c-kit免疫荧光显色,PCR 分析显示有CK19和白蛋白mRNA表达.生长因子诱导下有向胆管细胞和肝细胞分化的特性.结论 肝卵圆细胞分离纯化及鉴定方法和肝卵圆细胞成功培养,为进一步研究肝干细胞生物学特性和与肝癌的关系提供了物质基础.     

肝卵圆细胞与原发性肝癌的相关性研究

目的:探讨肝卵圆细胞与原发性肝癌的相关性,为原发性肝癌发生的"癌干细胞"假说提供临床病理学依据。方法:运用免疫组化方法检测不同肝病组(检测对照组、肝血管瘤组、良性肝病合并肝硬化组、肝癌组、肝癌合并肝硬化组)肝脏组织中表达Ck-7、Ck-8/18、Ck-19、C-kit、AFP肝卵圆细胞数。结果:Ck-7、Ck-8/18、Ck-19阳性的肝卵圆细胞在上述各检测组中均有表达,AFP阳性的肝卵圆细胞仅在肝癌组中表达。各组间表达的Ck-7、Ck-8/18、Ck-19、C-kit、AFP阳性的肝卵圆细胞数目随病变由良性疾病向恶性疾病变化而增加。肝癌组、肝癌合并肝硬化组间表达的C-kit阳性的肝卵圆细胞数有显著性差异(P<0.05)。结论:肝卵圆细胞参与了原发性肝癌的生长、细胞分化调控。     

大鼠肝癌发生过程中卵圆细胞分化的双染色研究

用r`谷氨酰转肽酶-甲胎蛋白(GGT-AFP)双染色法,对F_344大鼠肝癌发生过程中卵圆细胞的分化进行研究.结果表明,与免疫酶双标记法相比,此法具有特异性高、简便、精确、易于观察、经济、易推广等优点。卵圆细胞GGT 阳性,AFP 阴性;过渡细胞GGT,AFP 双表达;小肝细胞AFP 阳性,胆管细胞GGT 阳性。提示卵圆细胞是一种具有分化潜能的干细胞,过渡细胞双表达是处于双向分化状态,表达AFP 可以分化成小肝细胞,表达GGT 可以分化成胆管细胞。     

大鼠成体肝卵圆细胞分离培养及诱导分化的初步研究

目的 通过成体大鼠肝卵圆细胞分离培养获取纯净的干细胞并观察诱导分化前后从肝卵圆细胞到肝细胞的形态变化.方法 采用AAF/PH肝干细胞刺激模型,胶原酶Ⅳ消化分离和Percoll梯度离心纯化肝卵圆细胞的方法,用地塞米松、DMSO和EGF、HGF、SCF、LIF等生长因子联合应用诱导肝卵圆细胞增殖和分化为肝实质细胞.观察肝卵圆细胞到肝细胞形态变化过程,用免疫荧光技术,Western blotting分析检测了干细胞标志c-kit和RT-PCR分析法检测肝干细胞白蛋白和CK19 mRNA表达鉴定卵圆细胞.结果 分离得到的肝卵圆细胞活度达到90%,细胞形态包括大小和颜色呈不均质,卵圆细胞直径是肝细胞直径的1/4～1/6.诱导后出现大而圆的肝细胞,可见卵圆细胞到肝细胞的中间变化过程,新分离的肝卵圆细胞在生长因子诱导下有向肝细胞分化的特性.经c-kit免疫荧光染色显黄绿色荧光,Western blotting检测肝卵圆细胞有c-kit蛋白条带,而大鼠肝细胞及胆管细胞则未出现条带.PCR分析显示卵圆细胞有CK19和白蛋白mRNA表达.结论 新分离的肝卵圆细胞同时表达c-kit,CK19和白蛋白3种抗原,诱导分化出现一系列从卵圆细胞到肝细胞的形态学变化,这种现象证明分离的肝卵圆细胞就是肝干细胞,经诱导分化可以产生成熟的肝细胞,成为进一步研究肝干细胞生物学特性的基础.     

化学致癌剂3''''-甲基-4-DAB影响巢蛋白Nestin在SD大鼠肝卵圆细胞中的表达

目的：采用免疫组化方法标记大鼠肝卵圆细胞中巢蛋白Nesin的表达，探讨肝卵圆细胞新的表面标记蛋白。方法：用化学致癌剂3’-甲基4-二甲基氨偶氮苯(3’-Methy-4-dimethylaminoazobenzen，3’-me-DAB)喂养SD大鼠4周，取大鼠肝脏，用免疫组化法标记神经前体细胞的特异性表面标记物巢蛋白Nestin在大鼠肝卵圆细胞中的表达。结果：汇管区靠近界板处卵圆细胞表达Nestin阳性，Nestin阳性细胞成簇状分布或呈双层排列成管状，主要集中在赫令氏管周围并见Nestin阳性细胞向肝小叶内迁移，散在分布于肝细胞索。结论：大鼠肝内存在Nestin表达阳性的卵圆细胞，Nestin可能是肝卵圆细胞新的标记蛋白。     

大鼠肝脏卵圆细胞干细胞特性的研究

目的 探讨大鼠肝脏卵圆细胞体外培养扩增及其干细胞特征.方法 采用2-乙酰氨基芴/四氯化碳方法建模,胶原酶灌流和流式细胞术分选纯化卵圆细胞,进行培养和扩增.透射电子显微镜观察肝脏卵圆细胞的超微结构,免疫细胞化学法检测干细胞标志物OV-6、c-kit和Thy-1.1的表达;RT-PCR法检测卵圆细胞内c-kit、肝细胞标志物(HNF-4a、AFP)和胆管细胞标志物(CK-7、CK-19)的基因表达;Western blotting法检测OV-6和AFP蛋白的表达.结果 大鼠肝脏组织可见明显的卵圆细胞增生,成簇分布,逐渐向肝实质内延伸.细胞体外培养可达40d以上,细胞体积较小,多呈圆形和卵圆形.透射电子显微镜下可见细胞直径5～10 μm,细胞核大,胞质少,核/质比例大,细胞器少,仅见少量线粒体和内质网.免疫细胞化学检测显示,细胞表面OV-6、c-kit和Thy-1.1染色阳性;RT-PCR检测显示,卵圆细胞内有c-kit、HNF-4α、AFP、CK-7和CK-19基因表达;Western blotting检测显示,OV-6蛋白持续表达,AFP蛋白表达逐渐增强.结论 大鼠肝脏卵圆细胞体外可大量扩增并且保留其干细胞和双向分化潜能特性.     

大鼠肝脏卵圆细胞干细胞特性的研究

目的探讨大鼠肝脏卵圆细胞体外培养扩增及其干细胞特征。方法采用2-乙酰氨基芴/四氯化碳方法建模,胶原酶灌流和流式细胞术分选纯化卵圆细胞,进行培养和扩增。透射电子显微镜观察肝脏卵圆细胞的超微结构,免疫细胞化学法检测干细胞标志物OV-6、c-kit和Thy-1.1的表达;RT-PCR法检测卵圆细胞内c-kit、肝细胞标志物(HNF-4α、AFP)和胆管细胞标志物(CK-7、CK-19)的基因表达;Western blotting法检测OV-6和AFP蛋白的表达。结果大鼠肝脏组织可见明显的卵圆细胞增生,成簇分布,逐渐向肝实质内延伸。细胞体外培养可达40 d以上,细胞体积较小,多呈圆形和卵圆形。透射电子显微镜下可见细胞直径5～10μm,细胞核大,胞质少,核/质比例大,细胞器少,仅见少量线粒体和内质网。免疫细胞化学检测显示,细胞表面OV-6、c-kit和Thy-1.1染色阳性;RT-PCR检测显示,卵圆细胞内有c-kit、HNF-4α、AFP、CK-7和CK-19基因表达;Western blotting检测显示,OV-6蛋白持续表达,AFP蛋白表达逐渐增强。结论大鼠肝脏卵圆细胞体外可大量扩增并且保留其干细胞和双向分化潜...     

胰腺HGF对大鼠肝卵圆细胞调控的探讨

目的 探讨胰腺组织HGF表达对大鼠肝卵圆细胞增殖、分化的影响.方法 选择体重150～200 g的雄性Wistar大鼠,建立肝卵圆细胞增殖模型（2-AAF/PH）.采用免疫组织化学和RT-PCR方法,观察不同时间点胰腺、肝脏组织中HGF蛋白和mRNA的表达及其变化.结果 实验组大鼠胰腺HGF表达上调,与对照组比较有显著意义,其高峰时间与肝脏HGF表达及肝卵圆细胞增殖高峰时间同步.结论 胰腺可能通过HGF的内分泌调控对大鼠肝卵圆细胞介导的肝再生起一定作用.     

HBV所致终末期肝病患者肝组织胆管增生的免疫组织化学研究

目的在乙型肝炎病毒（HBV）所致的终末期肝病患者肝组织内，常可见大量的胆管增生，但其发生机制及临床意义尚不清楚。为阐明该类患者胆管增生的发生机制及其与卵圆细胞增生及肝细胞再生的关系，我们对8例HBV相关的终末期肝病患者及2例正常人肝组织进行了免疫组化染色及图像分析。方法肝组织连续切片后进行免疫组化染色。观察指标为细胞角蛋白（CK）7、CK8、CK19、OV6、增殖细胞核抗原（PC—NA）、甲胎蛋白（AFP）及白蛋白（ALB）。结果在所有8例惠者肝组织汇管区内均可见典型增生的胆管及非典型增生的胆管，且对CK7、CKB、CK19、OV6及PCNA染色呈阳性反应，但两种类型的胆管在染色强度上存在明显差异。一些非典型增生的胆管细胞表现出肝卵圆细胞的形态学及免疫组化特征。某些小型肝细胞样细胞在形态及免疫组化特征方面介于肝卵圆细胞及成熟肝细胞之间。结论在t-IBV相关的终末期肝病患者肝组织内，胆管增生可能存在不同起源。某些非典型增生的胆管细胞实际上就是活化的肝卵圆细胞。非典型增生的胆管细胞与肝细胞再生密切相关。小型肝细胞样细胞可能是肝卵圆细胞与成熟肝细胞之间的中间过渡细胞。     

大鼠肝组织中增生卵圆细胞移植裸鼠后的形态观察

将化学诱癌早期产生的大量卵圆细胞增生肝组织,移植于裸鼠皮下,结合G-6-P酶和γ-GT酶组织化学(简称组化)、AFP免疫组化、~3H-dT放射自显影及超微结构形态学方法,动态地观察卵圆细胞的演变过程。实验结果表明,卵圆细胞显示未分化细胞特征,移植后卵圆细胞仍增生活跃,进一步向过渡细胞、小肝细胞及胆管细胞分化。我们认为卵圆细胞代表肝组织中的一种原始的干细胞,在致癌剂的作用下,由于分化异常,可成为肝细胞癌的组织来源之一。     

人胎肝干细胞的分离、培养和鉴定

为探讨人胎肝中干细胞的存在并对其生物学特性进行鉴定 ,采用原代分离法培养人胎肝细胞集落 ,免疫组化鉴定细胞集落分子标志物的表达。结果 :从人胎肝组织中成功分离表达甲胎蛋白 (AFP)、白蛋白、波形蛋白等标志物的胎肝干细胞集落。证实人胎肝中同样存在具有干细胞特性的原始细胞。这一发现为肝干细胞的生物学特性的深入研究奠定了良好的基础     

VIP对人脐血CD34+细胞向肝系分化的影响初探

目的探讨血管活性肠肽(VIP)对人脐血造血干细胞(HSC)向肝系分化的影响.方法采用免疫磁分选技术纯化人脐血CD34+细胞,流式细胞术鉴定纯度;VIP和混合因子(包括VIP、EGF、HGF)作用CD34+细胞后,酶联免疫化学法测定CD34+细胞及上清AFP水平,免疫细胞化学法检测CD34+细胞上肝系标志AFP、白蛋白(ALB)、细胞角质素19(CK-19)的表达,Western blot方法检测CD34+细胞上ALB表达;巢式RT-PCR方法检测CD34+细胞上AFP、ALB的mRNA表达,随机选送ALB产物测序.结果免疫组化结果显示CD34+细胞上不表达CK-19蛋白,但有AFP和ALB蛋白表达;VIP作用CD34+细胞14 d后, 细胞内的AFP质量浓度(165.00±8.51 pg/mL)较对照组(270.00±11.37 pg/mL)显著下降(P<0.05).Western blot显示VIP作用后CD34+细胞内ALB蛋白表达有减弱趋势.人脐血CD34+细胞表达了AFP mRNA和ALB mRNA,随机选取ALB产物测序与GeneBank中ALB基因序列完全相同.结论人脐血CD34+细胞表达肝系标志AFP、ALB,虽未见CK-19表达,但仍提示造血干细胞有向肝细胞横向分化的可能.VIP降低了人脐血CD34+细胞AFP及ALB表达.这种对造血干细胞内胚层细胞标志物表达的抑制,提示VIP对HSC向肝细胞横向分化具有抑制作用.     

肝细胞癌中卵圆细胞表面标记的表达及意义

目的探讨卵圆细胞部分表面标记在肝细胞癌中的表达状况和意义。方法应用免疫组织化学SABC法检测20例肝细胞癌中CK7、CK19、CK18、CD34、e—kit抗原的表达。结果14例肝细胞癌CK7表达呈阳性，其阳性表达率为70％（14／20）；9例c—kit的阳性表达率为45％（9／20）；在20例肝细胞癌癌组织中的CK18全部呈阳性表达，CK19和CD34全部呈阴性表达。CK7、C—kit表达与患者年龄、性别无关，与肿瘤大小、是否合并肝硬化以及组织学分级也不相关（P〉0．05）。结论肝细胞癌癌组织中存在表达卵圆细胞表面标记的细胞，其表达CK7、C—kit，不表达造血干细胞标记物CD34。其进一步提示，肝细胞癌可能不是起源于肝干细胞而是来源于过渡性的前体细胞／祖细胞，如来源于Hering管的卵圆细胞。     

肝细胞癌中CK7、CK19及AFP的表达相关性研究

目的探讨CK7、CK19在肝细胞癌（HCC）中的表达,以及与HCC患者甲胎蛋白（AFP）表达及临床病理特征的关系。方法收集65例原发性HCC患者的癌组织标本及血清标本,免疫组化检测CK7、CK19表达情况,并用ELISA法检测血清中AFP水平。结果HCC患者癌组织中CK7的表达阳性率为46.2%（30/65）,CK19表达阳性率为18.5%（12/65）。HCC癌组织中可见表达CK7、CK19的卵圆细胞,可同时表达AFP。CK19表达与血清AFP表达水平有显著相关性（P=0.000）。结论人类HCC中同样有卵圆细胞的存在,这部分HCC患者预后较差,AFP及CK19的联合检测可有助于这部分患者的早期诊断。     

三七总皂甙对大鼠肝卵圆细胞增殖模型肝脏P—ERK1／2表达的影响

目的 研究三七总皂甙(PNS)对大鼠肝卵圆细胞(HOC)增殖模型肝脏p-ERK1/2表达的影响,探讨PNS调节HOC增殖的可能信号途径.方法 将66只健康雄性Wistar大鼠随机分成对照组(n=6)、模型组(n=30)和PNS组(n=30).模型组、PNS组采用2-AFF/PH方法建立HOC增殖模型,PNS组大鼠建模时(即第一次2-AAF灌胃前1 h)予以PNS 25 mg/(kg·d)腹腔内注射,并持续至实验结束.模型组、PNS组在术后第4小时,第4、8、12、16天随机取6只大鼠检测.对照组大鼠未予特殊处理.采用组织病理技术观察肝组织的形态学变化;免疫组织化学和细胞形态学方法计数HOC;免疫组织化学及Western blot分析p-ERK1/2蛋白水平.结果 对照组、模型组和PNS组术后第4小时未见HOC增殖.模型组术后第4天汇管区有HOC增殖反应,第8天HOC增殖达峰值,第12天HOC从汇管区向肝实质内浸润,第16天HOC增殖较第12天减少.与模型组比较,PNS组第4、8、16天HOC增殖均减少(均P<0.05),第12天HOC增殖增多(P<0.05).对照组大鼠肝组织p-ERK1/2蛋白水平很低,模型组p-ERK1/2蛋白表达术后各时点分别为对照组的(2.24±0.17)、(3.87±0.35)、(5.28±0.48)、(2.96±0.33)、(2.12±0.19)倍;PNS组各时点p-ERK1/2的表达分别为对照组的(1.56±0.23)、(2.77±0.19)、(3.53±0.35)、(3.62±0.45)、(1.36±0.16)倍.与模型组比较,PNS组术后第12天p-ERK1/2表达升高(P<0.01),第4小时,第4、8、16天表达均减少(均P<0.05).结论 在HOC介导肝再生过程中,HOC的p-ERK1/2表达与其增殖趋势相同;PNS可使大鼠肝脏的HOC增殖及p-ERK1/2的表达降低、滞后、持续时间延长.