TP47蛋白在梅毒血清学诊断中的应用

目的采用原核基因工程技术重组表达梅毒螺旋体TP47蛋白,探讨其在梅毒血清学诊断中的应用。方法PCR扩增获得TP47基因片段并构建pET28b-TP47原核表达重组质粒,转化到大肠杆菌BL21中,以IPTG诱导蛋白质表达。经镍柱纯化后通过质谱技术进行鉴定。采用免疫印迹法测定其与梅毒患者血清的免疫反应性。建立基于重组TP47抗原的ELISA间接法并对30份TPPA阳性血清和75份TPPA阴性血清进行方法学验证。结果PCR扩增获得约1．1kb的基因片段,成功构建原核表达载体pET28b-TP47。重组蛋白在细菌中以包涵体形式表达,约占菌体蛋白含量的70％,分子量约39000Mr,经纯化后其纯度约95％。经质谱分析表明重组蛋白为TP47蛋白。免疫印迹法证实TP47蛋白能够与梅毒患者血清发生特异性反应,ELISA测定TPPA阳性血清和阴性血清的符合率分别为97％（29／30）和97％（73／75）。结论通过DNA重组技术成功获得了梅毒螺旋体TP47蛋白,证实其与梅毒阳性血清具有良好的反应性,为研发新一代梅毒感染诊断试剂盒奠定了基础。     

TpN17重组抗原的表达及在梅毒血清学诊断中的初步应用

目的用基因工程技术表达梅毒螺旋体TpN17重组抗原,并建立操作简便、特异性好、敏感性高的梅毒血清抗体间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测。方法采用PCR技术扩增梅毒螺旋体TpN17基因,再进行T-A克隆及测序,然后亚克隆到原核表达载体中,以亲和层析法纯化重组蛋白。将重组蛋白包被于反应板,建立检测血清中梅毒抗体的ELISA间接检测法,利用该法与梅毒螺旋体血凝试验(TPHA)、甲苯胺红不加热血清试验(TRUST)同时检测血清样品,对其结果进行比较研究。结果TpN17重组蛋白在大肠杆菌BL21中得到稳定表达,并成功建立了检测血清中梅毒抗体的ELISA间接检测法及试剂。对135例梅毒可疑患者血清进行检测,ELISA、TPHA和TRUST的检出阳性率分别为82.96%、98.52%和71.11%,而TRUST测出的8例可疑样品及31例阴性样品中,TPHA结果全部阳性、而ELISA只有2例阴性。结论TpN17重组抗原ELISA试剂在特异性和敏感性上明显优于TRUST法。     

梅毒螺旋体TP0772蛋白的原核表达和免疫反应性鉴定

目的 利用原核基因工程技术克隆表达梅毒螺旋体TP0772基因,探讨其在梅毒血清学诊断中的应用.方法 PCR扩增获得TP0772基因,构建pET-28b-TP0772重组质粒,转化到大肠杆菌BL21中,以IPTG诱导蛋白质表达,经镍柱纯化后通过质谱技术鉴定.采用免疫印迹法测定其与梅毒患者血清的免疫反应性.建立基于重组TP0772抗原的ELISA间接法并对30份TPPA阳性血清和25份TPP阴性血清进行方法学评价.结果 PCR扩增获得约850 bp的基因片段,成功构建原核表达载体pET-28b-TP0772.目的蛋白分子量约为32kDa,以包涵体的表达形式存在,约占菌体总蛋白的30%.经质谱技术和免疫印迹分析证实重组蛋白为TP0772蛋白,并能够与梅毒患者血清发生特异性结合反应.ELISA测定TPPA阳性血清和阴性血清的符合率分别为93%（28/30）和96%（24/25）.结论 通过DNA重组技术成功获得了重组TP0772蛋白,其与梅毒阳性血清具有良好的免疫反应性,为优化梅毒的血清学诊断方法奠定基础.     

梅毒螺旋体Tp0751黏附蛋白的表达、纯化及免疫活性研究

目的 表达梅毒螺旋体黏附蛋白Tp0751,纯化表达产物并进行免疫活性分析,为探索Tp0751重组蛋白在梅毒致病过程中的作用奠定基础.方法 通过生物信息学分析,去除Tp0751信号肽序列,构建原核表达体进行诱导表达;Ni亲和层析柱纯化重组蛋白,Western blot检测其免疫反应性,用重组蛋白免疫新西兰家兔,评价其免疫原性.结果 成功构建了pET-28a(+)-0751原核表达载体,经表达、纯化后获得了相对分子质量约为26×103的融合蛋白;Western blot检测其能与梅毒患者阳性血清发生特异性反应;利用纯化的Tp0751重组蛋白免疫新西兰家兔,能诱导家兔产生特异性免疫应答,ELISA法测定免疫血清中特异性抗体滴度在1∶10 240以上.结论 重组表达的Tp0751黏附蛋白具有良好的免疫活性,为进一步研究其在梅毒致病过程中的作用和生物学功能奠定了基础.     

HIV-1 gag基因p17+24重组抗原表达、纯化及抗原性分析

目的获得HIV-1型gag基因p17＋2，4重组抗原，分析其免疫原性和探讨开发诊断试剂的可能性。方法采用PCR技术扩增HIV-1gag基因p17＋p24核酸片段，并克隆入pTreHis2A表达质粒，在大肠杆菌BL21（DE3）株中表达。用Ni—NTA金属螯合层析法纯化目的蛋白，并用免疫印迹法分析纯化蛋白的抗原特异性。结果重组质粒在BL21（DF3）菌株中经IPm诱导表达一个相对分子质量（肘，）约为51×10^3的融合重组蛋白，重组蛋白经HIV-1p17、p24抗原单克隆抗体鉴定，具有抗原特异性。25份HIV阳性血清、180份HIV阴性血清标本初步经l临床验证，具有较高的检出敏感性和特异性。结论成功构建HIV-1型gag基因p17＋24抗原表达载体，表达纯化的p17＋24重组抗原具有较好的抗原性，可用于诊断试剂的开发。     

梅毒螺旋体0751基因的克隆、表达及鉴定

目的构建梅毒螺旋体0751基因的原核表达质粒,诱导重组蛋白表达及进行免疫学鉴定。方法以梅毒螺旋体基因组DNA为模板,PCR扩增梅毒螺旋体0751基因,构建其重组原核表达载体,并采用Western-blot方法初步鉴定该蛋白的特异性。结果成功扩增出梅毒螺旋体0751基因,该基因在大肠杆菌表达系统中得到表达,并且特异性识别梅毒患者血清。结论在大肠杆菌中成功表达梅毒螺旋体0751基因,为梅毒螺旋体的诊断提供了新的特异性抗原。     

梅毒螺旋体TpN15抗原基因的扩增、克隆及表达

目的用基因工程技术表达梅毒螺旋体TpN15重组抗原,为进一步研制梅毒预防性疫苗和诊断试剂盒打下基础.方法采用PCR技术扩增梅毒螺旋体TpN15基因,然后克隆到原核表达载体pET28b中表达TpN15重组抗原蛋白.结果成功的构建了pET28b-TpN15重组表达载体,重组的TpN15蛋白在大肠杆菌BL21中得到稳定表达.结论梅毒螺旋体TpN15基因在大肠杆菌中的成功表达为建立梅毒血清学诊断的新方法奠定了基础.     

INHA基因的克隆表达以及多克隆抗体的制备

目的INHA的表达、纯化,以及多克隆抗体的制备。方法利用基因重组技术获得INHA基因以及去信号肽的INHA基因,将其都分别构建到原核表达系统并分离纯化得到相对分子质量为58000的带有组氨酸标签的重组INHA融合蛋白。用分离纯化后的INHA融合蛋白作为抗原免疫,获得抗INHA的多克隆抗体。结果成功地获得INHA基因,并且以包涵体的形式表达于大肠杆菌中,用间接酶联免疫吸附（ELISA）方法,Western blot检测结果显示．该抗体能特异性地与INHA的抗原以及胎盘组织产生明显免疫亲和反应。结论建立原核高效稳定INHA表达系统．获得具有生物学活性的蛋白,为进一步获得高特异性的抗体奠定基础。     

恙虫病东方体Sta56抗原的原核表达、纯化及其在间接ELISA中的应用

目的　构建含恙虫病东方体sta5 6基因的重组表达质粒 ,在E .coli中表达Sta5 6重组抗原 ,纯化后用于间接ELISA检测恙虫病。方法　从含有恙虫病东方体Karp株sta5 6基因的重组质粒TOPO sta5 6扩增出截短的sta5 6 ,定向插入pET30a载体 ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ,IPTG诱导表达 ,用SDS PAGE及Westernblot进行分析 ;采用电洗脱方法纯化重组抗原并应用于间接ELISA检测恙虫病。结果　以截短的sta5 6基因片段构建了重组表达质粒pETOt95 7,重组的Sta5 6抗原可在E .coli中以融合蛋白的形式有效表达 ,SDS PAGE显示了一条相对分子质量 (Mr)为 4 0 .3× 10 3 的蛋白表达带 ,West ernblot证实该融合蛋白能被恙虫病患者阳性血清所识别。电洗脱纯化的重组抗原应用于间接法ELISA检测恙虫病 ,与间接免疫荧光法IFAT比较 ,其敏感性和特异性分别为 91.7%和 76 .5 %。结论　在大肠杆菌中表达的Sta5 6重组抗原具有免疫反应性 ,纯化后可用作免疫诊断试剂。     

SARS冠状病毒膜蛋白膜内区的表达、纯化及抗原性初步研究

目的对SAILS冠状病毒膜蛋白膜内区基因片段进行克隆表达和表达产物的纯化复性,探讨该表达蛋白的抗原特性。方法克隆SAILS冠状病毒GD322株膜蛋白膜内区,在原核表达系统中表达His-融合蛋白,采用Western blot和酶联免疫吸附试验(ELISA)分析His-融合蛋白抗原特性。结果7份SARS临床诊断患者血清中5份血清能与His-融合蛋白反应,2份不与之反应。兔抗OCA3、229E血清及20份健康人血清皆不与His-融合蛋白反应。His-融合蛋白免疫动物可产生多克隆抗体。结论本研究获得的His-融合蛋白可与SARS临床诊断患者血清特异性结合,可免疫动物获得特异性多抗;但不与健康人血清及兔抗OCA3、229E血清发生特异性结合。     

带c-Myc标签的Mdfic基因真核表达载体构建及其在成肌细胞中的表达

目的构建新型转录因子Mdfic和c-Myc标签融合表达的真核表达载体pcDNA3.1-Mdfic-Myc,实现其在成肌细胞C2C12中的表达。方法 PCR方法扩增Mdfic的开放阅读框,酶切后的PCR扩增产物和退火后的人工合成的c-Myc标签共同克隆至pcDNA3.1（＋）真核表达载体中,构建pcDNA3.1-Mdfic-Myc融合表达质粒。重组质粒经过PCR、双酶切和测序鉴定后,脂质体法转染C2C12细胞。RT-PCR和Western blotting方法检测转染后细胞中Mdfic-Myc的表达。结果成功构建了pcDNA-Mdfic-Myc真核表达质粒;RT-PCR和Western blotting结果表明,Mdfic-Myc融合蛋白在成肌细胞C2C12中获得高效表达。结论 pcDNA3.1-Mdfic-Myc融合表达质粒的成功构建及其在成肌细胞中的表达为进一步体外研究Mdfic蛋白单独的功能及其与其他分子间功能性相互作用奠定了基础。     

人源受体相关蛋白的原核表达及功能检测

目的研究人源受体相关蛋白(RAP)的表达并鉴定表达产物的功能。方法用IPTG诱导培养含有人源RAP重组表达载体(pET-28 a( )-RAP)的BL21转化菌,利用融合蛋白中6个组氨酸纯化标签,经N i -NTA树脂亲和层析、SDS-PAGE分离鉴定表达产物,并经脱盐、浓缩、冻干处理获得RAP融合蛋白冻干品。将RAP融合蛋白与富含LDLR家族受体的巨噬细胞进行结合实验,分析RAP融合蛋白的功能。结果经亲和层析分离纯化后获得可溶性表达的RAP融合蛋白。实验显示,表达的RAP融合蛋白可竞争性抑制VLDL与巨噬细胞的结合。结论实验获得的RAP融合蛋白具有正常的结合活性,可用于相关研究,为RAP蛋白生产开发奠定了良好的基础。     

人骨形成蛋白2在昆虫杆状病毒表达系统中的表达及初步鉴定

目的:研究hBMP2在昆虫杆状病毒系统中的表达规律。方法:将编码hBMP2的全长cDNA克隆入转移载体PK8中,重组后的载体与线性化的病毒DNA经脂质体包裹转染昆虫细胞。重组病毒经蓝白筛选后,提取病毒DNA进行PCR扩增,鉴定目的基因。收集重组病毒感染4d的细胞,进行免疫荧光及电子显微镜观察。结果:含有目的基因的重组载体经酶切可切下相应大小的目的基因片段。PCR产物的电泳结果表明,有目的基因片段的扩增。免疫荧光染色呈阳性的颗粒分布在昆虫细胞的胞浆及胞膜。结论:初步证实,hBMP2在此套表达系统中获得了表达。     

麻疹病毒血凝素和融合蛋白基因的克隆与表达及其重组蛋白的免疫学评价

采用逆转录－多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）的方法从麻疹病毒Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ株基因组中扩增出血凝素Ｈ基因和融合蛋白Ｆ基因，并利用转移质粒将这两个基因分别重组到杆状病毒多角体蛋白启动子（ＰＨ）控制之下，获得重组病毒ｖＢＭＶＨ和ｖＢＭＶＦ。重组杆状病毒感染Ｓｆ９昆虫细胞，表达的重组蛋白分别具有血凝、血溶活性。红细胞吸附抑制试验、免疫印迹、酶联免疫试验结果显示重组蛋白在生物学、生化学特性与天然蛋白类似，并能被天然麻疹免疫血清（人、鼠、兔）所识别。动物实验表明，重组蛋白具有诱生中和抗体的能力。重组血凝素免疫血清还具有血凝抑制抗体活性。这些结果说明杆状病毒－昆虫细胞体系表达的麻疹病毒血凝素和融合蛋白具有较好的生物学活性及免疫原性和抗原性。     

分枝杆菌同源可控表达系统的建立及其应用

目的 构建分枝杆菌可控表达载体,利用其过表达结核分枝杆菌(Mycobacterium tu-berculosis,Mtb)的免疫保护性抗原,亲和层析纯化后分析免疫原性.方法 应用PCR扩增耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis,Ms)乙酰胺酶编码基因启动子(pACE),构建分枝杆菌可控表达载体pMF系列;克隆Mtb嵌合抗原编码基因并用乙酰胺进行诱导表达,以Ni~(2+)亲和层析纯化重组蛋白;并用该重组嵌合抗原Ag856A2对卡介苗(BCG)免疫的小鼠脾细胞进行体外刺激,以IFN-γ酶联免疫斑点技术(ELISPOT)分析其免疫原性.结果 成功构建了分枝杆菌可控表达载体pMF系列,利用0.02%乙酰胺进行诱导可实现目标抗原在Ms中的高水平表达;同时利用引入的6×His标签可方便实现重组抗原的一步纯化,且该同源表达重组抗原可诱导更高水平IFN-γ的分泌.结论 以Ms乙酰胺酶编码基因启动子pACE为基础构建的分枝杆菌可控表达系统可实现Mtb抗原在Ms中的高水平表达与纯化,与大肠杆萧异源表达相比,该同源表达重组抗原具有更好的免疫原性.     

食管癌及癌旁组织中基因表达的初步研究

目的　了解食管癌的基因表达概况,寻找在食管癌及癌旁组织中差异表达基因。方法　以癌及癌旁组织ｐｏｌｙ Ａ＋ Ｒ Ｎ Ａ 反转录合成的ｃ Ｄ Ｎ Ａ 为探针,与 Ａｔｌａｓ 微点阵表达分析膜进行差异杂交。结果放射自显影结果显示在所分析的５８８ 种已知基因中,ｃｄｃ２５ Ｂ、 Ｍ Ｍ Ｐ、 Ｍ Ｅ Ｔ 等６１ 个在食管癌组织中表达上调,ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ ４ 、 Ｂ Ａ Ｄ、 Ｉ Ｌ１ Ｒ Ｅ Ｃ Ｅ Ｐ Ｔ Ｏ Ｒ Ａ Ｎ Ｔ Ａ Ｇ Ｏ Ｎ Ｉ Ｓ Ｔ、 Ｉ Ｌ６ 等２２ 个表达下调,参与细胞增殖、凋亡、分化和转移调控的多种基因的表达水平发生了明显改变。结论　这些基因的表达改变组成了一个食管癌特异的基因表达谱,首次为食管癌细胞的恶性表型提供了分子遗传学参考数据,一些与肿瘤发生相关的差异表达基因为发展生物标记物或肿瘤早期诊断和治疗提供了线索。 Ａｔｌａｓ 微点阵表达分析滤膜的差异杂交为初步了解某一组织或细胞的表达状况提供了一个较好的方法。     

Decreased expression of Bax-interacting factor-1 (Bif-1) in invasive urinary bladder and gallbladder cancers

Aims: Mounting evidence indicates that deregulation of apoptosis is involved in the mechanisms of cancer development. Bax-interacting factor-1 (Bif-1) interacts with both Bax and Bak that are crucial for the intrinsic apoptosis signalling. Functionally, loss of Bif-1 expression has been proven to enhance tumorigenesis. The aim of this study was to explore whether loss of Bif-1 expression occurs in urinary bladder (UB) and gallbladder (GB) cancer tissues. Methods: We analysed Bif-1 protein expression in 41 transitional cell carcinomas of UB and 26 GB adenocarcinomas by immunohistochemistry. Results: In both UB and GB, normal mucosal epithelial cells strongly expressed Bif-1 protein. In the UB cancers, Bif-1 expression was strongly positive in 25 cases (61.0%), but the remaining 16 cases showed no (14.6%) or markedly decreased (24.4%) Bif-1 immunostaining compared with the normal mucosal epithelial cells. Similarly, in the GB cancers, Bif-1 immunostaining was strong in 17 cases (65.4%), while the remaining nine cases showed no (15.4%) or markedly decreased (19.2%) Bif-1 immunostaining compared with the normal mucosal epithelial cells. Conclusion: The decreased expression of Bif-1 in large fractions of both UB and GB cancers (39.0% and 34.6%, respectively) compared with their normal mucosal cells suggested that loss of Bif-1 expression might play a role in tumorigenesis in both UB and GB cancers, possibly by inhibiting apoptosis mediated by Bif-1.     

防御素的研究进展和应用前景

近年来,在植物、昆虫、两栖类、鸟类和哺乳动物体内发现了一组具有抵抗外界微生物侵害的小分子多肽,称为防御素（defensins）。自1984年从人中性粒细胞分离出HNP123以来,已有数十种防御素陆续被发现或报道。防御素具有十分广泛的抗菌谱,对细菌、真菌、病毒等多种微生物都具有杀伤作用,尤其是哺乳动物防御素,除了对细菌、真菌、被膜病毒具有杀伤作用外,还能杀伤支原体、衣原体、螺旋体以及一些恶性肿瘤细胞。由于防御素具有众多的生物活性,因此对于它们的研究目前也越来越受到人们的广泛关注。现本文就防御素的结构与类型、生物活性、应用及基因工程制备做一综述。