可注射型纤维蛋白凝胶转化生长因子β1复合骨髓间充质干细胞移植治疗椎间盘退变☆

摘要 背景：纤维蛋白凝胶主体胶与催化剂未混合前为液态,具有可注射的优点,注射混合后凝固成凝胶状,与髓核相似,并且凝固时间可控性强,作为间充质干细胞的载体植入到椎间盘内有诸多优点。 目的：观察可注射型纤维蛋白凝胶转化生长因子β1复合骨髓间充质干细胞移植抑制椎间盘退变的可行性。 方法：将新西兰大白兔随机分为退变模型组、纤维蛋白凝胶组,骨髓干细胞+纤维蛋白凝胶组。3组采用针刺法诱导建立退变模型后,纤维蛋白凝胶组及干细胞+纤维蛋白凝胶组分别移植入纤维蛋白凝胶转化生长因子β1复合物及骨髓间充质干细胞纤维蛋白凝胶转化生长因子β1复合物,于植入后2,6,10周行CR、MRI及病理检查。 结果与结论：退变模型组与纤维蛋白凝胶组椎间隙高度下降明显,并与时间呈正相关,干细胞+纤维蛋白凝胶组下降较缓慢(P < 0.01)。免疫组织化学及组织学检查显示,退变模型组髓核细胞的数量及Ⅱ型胶原含量进行性减少,细胞凋亡率明显增加,纤维蛋白凝胶组与退变模型组相似,干细胞+纤维蛋白凝胶组髓核细胞数量及Ⅱ型胶原含量较退变模型组及纤维蛋白凝胶组明显增多,细胞凋亡率下降。说明骨髓间充质干细胞联合纤维蛋白凝胶转化生长因子β1能很好抑制椎间盘退变,而单纯纤维蛋白凝胶转化生长因子β1移植不能抑制椎间盘退变。 关键词：纤维蛋白凝胶;骨髓间充质干细胞;转化生长因子β1;椎间盘退变;兔 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2011.03.024     

兔椎间盘移植人骨髓间充质干细胞的实验观察

背景：国内外动物实验多是研究同种异体骨髓间充质干细胞的移植,但对人骨髓间充质干细胞在活体椎间盘内的存活情况还知之甚少。 目的：观察人骨髓间充质干细胞在兔椎间盘内的存活情况。 方法：选取新西兰大白兔15只,每只兔子的椎间盘被分为3组,即空白组(L1~2)、生理盐水组(L2~3)、绿色荧光蛋白标记的人骨髓间充质干细胞移植组(L3~4,L4~5,L5~6)。空白组不注射,生理盐水组髓核内注射生理盐水25 μL,绿色荧光蛋白标记的人骨髓间充质干细胞移植组注射1×109 L-1绿色荧光蛋白标记的人骨髓间充质干细胞生理盐水混悬液25 μL。移植后1,2,4,6,8周取材,荧光显微镜观察荧光细胞的分布情况及其数量。 结果与结论：绿色荧光蛋白标记的人骨髓间充质干细胞移植组移植后1,2,4,6,8周标本切片,髓核内均可见绿色荧光细胞。移植后6,8周的荧光细胞数量明显少于移植后1,2,4周(P < 0.001)。提示移植后8周以内,人骨髓间充质干细胞可在兔椎间盘内存活。     

SPIO标记脂肪干细胞移植退变椎间盘内的MRI活体示踪*◆

背景：国内外动物实验多是荧光标记骨髓间充质干细胞的移植,以SPIO标记脂肪干细胞移植后活体示踪对退变椎间盘修复作用的研究较少。 目的：活体监测SPIO标记的脂肪干细胞在退变椎间盘内的存活、迁移和转归,以及脂肪干细胞对退变椎间盘的修复及延缓退变作用。 方法：新西兰大白兔20只,兔椎间盘被分为4组,即正常对照组(L1/2),脂肪干细胞组(L2/3),PBS组(L3/4),SPIO-脂肪干细胞组(L4/5)。透视引导下用18G穿刺制作退变模型后2周行SPIO标记的脂肪干细胞移植。 结果与结论：SPIO-脂肪干细胞移植后即刻T2WI/FFE序列上可见椎间盘内明显低信号,8周后仍可检测到低信号。脂肪干细胞移植组与同时间点PBS组比较,椎间盘退变程度轻。提示SPIO-脂肪干细胞移植至椎间盘后,可通过MRI进行监测;脂肪干细胞椎间盘内移植有助于修复退变椎间盘和延缓椎间盘退变。     

构建兔髓核细胞诱导人骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化的体外模型

背景：目前尚缺乏诱导骨髓间充质干细胞向髓核细胞转化的体外模型。 目的：建立兔髓核细胞诱导人骨髓间充质干细胞分化为类髓核细胞的体外模型,为髓核细胞体内移植培养种子细胞提供实验依据。 设计、时间及地点：对比观察,于2008-08/2009-03在青岛大学医学院附属医院骨科研究所和中心实验室完成。 材料：8周龄新西兰大白兔2只用于兔髓核细胞的分离培养;人椎间盘髓核组织为术中取自16岁先天性脊柱侧弯患者T12L1、L1,2椎间盘髓核组织,患者家属知情同意。人骨髓间充质干细胞株为广州赛业生物科技有限公司产品。 方法：将人骨髓间充质干细胞和兔髓核细胞新式分层共培养(应用去掉挂臂、膜孔为0.4 μm的小室,膜底与贴壁细胞相接触,膜上下两种细胞比例为50%∶50%)7 d,同时设立传统的分层培养(带有挂臂的小室)组、单独人骨髓间充质干细胞培养组和髓核细胞培养组为对照。 主要观察指标：反转录-聚合酶链反应和Western blot检测蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的表达。 结果：传统分层培养组及单独人骨髓间充质干细胞培养组不表达蛋白聚糖和Ⅱ型胶原。新式分层培养组、单独髓核细胞培养组Ⅱ型胶原和蛋白聚糖mRNA表达均高于传统分层培养组、单独人骨髓间充质干细胞培养组(P < 0.01)。新式分层培养组与单独髓核细胞培养组比较及传统分层培养组与单独人骨髓间充质干细胞培养组比较,差异无显著性意义(P > 0.05)。 结论：新式分层培养人骨髓间充质干细胞能较高的表达蛋白聚糖和Ⅱ型胶原,接近椎间盘未退变人的髓核细胞表达水平,表明成功建立兔髓核细胞诱导人骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化的体外模型,为椎间盘退变的细胞治疗奠定了基础。     

骨髓间充质干细胞与髓核细胞的体外共培养

背景：细胞移植治疗椎间盘退行性变目前尚处在实验室研究阶段。 目的：通过SD大鼠骨髓间充质干细胞与退行性改变的髓核细胞体外共培养,探索骨髓间充质干细胞能否通过直接接触促进髓核细胞外基质的表达以及髓核细胞能否诱导骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化。 方法：取已自然退变的第6代髓核细胞与生长良好的第4代骨髓间充质干细胞按不同比例(75∶25,50∶50和25∶75)体外共培养7 d,单独髓核细胞(100∶0)与单独骨髓间充质干细胞(0∶100)分别作为阳性对照和阴性对照。 结果与结论：RT-PCR检测显示共培养组(75∶25和50∶50)蛋白多糖和Ⅱ型胶原蛋白条带均明显亮于单独髓核细胞培养组(100∶0),吸光度值比较差异有显著性意义;免疫组织化学检测显示Ⅱ型胶原蛋白在共培养组(75∶25和50∶50)胞浆内的表达明显高于单独髓核细胞培养组(100∶0)。共培养组中可见骨髓间充质干细胞由长梭形向多角形、类圆形转变,胞浆内异染颗粒增多。提示通过体外直接接触共培养,骨髓间充质干细胞能逆转髓核细胞退变,而且髓核细胞能诱导骨髓间充质干细胞向类髓核细胞转换。     

藻酸盐凝胶支架在生物学修复椎间盘退行性变中的应用

目的：藻酸盐凝胶不仅在体外培养细胞使用，还可应用于体内组织工程修复。实验以藻酸盐凝胶为支架复合骨髓间充质干细胞，观察修复兔腰椎间盘退行性变的能力。 方法：实验于2006-03/2007-03在解放军第二军医大学长海医院骨科实验室完成。①密度梯度分离法分离培养兔骨髓间充质干细胞，配制1.2% 藻酸钠水溶液，进行体外骨髓间充质干细胞/藻酸盐复合物的制备，观察细胞生长。②18只新西兰大白兔手术建立腰椎间盘退行性变模型，随机分为3组：对照组、空白组和治疗组。在手术建立椎间盘退行性变模型结束时，在治疗组椎间隙，注射干细胞复合藻酸盐凝胶支架, 对照组注射骨髓间充质干细胞，空白组不予任何干预。③应用核磁共振观察椎间盘手术前后高度和T2信号变化；术后12周取材大体观察组织结构；免疫组织化学检测Ⅱ型胶原含量，分光光度法测量蛋白多糖的含量，观察椎间盘退行性变修复效果。 结果：18只新西兰大白兔均进入结果分析。①镜下观察支架陷窝内为干细胞，生长良好；将支架行冰冻切片，观察细胞位于网络内，形态良好。②术后12周治疗组MRI测量椎间隙高度和T2信号与术前相比变化最小，与空白组和对照组比较差异有显著性意义（P < 0.05）。③术后12周取材大体观察，空白组和对照组的椎间盘，髓核与纤维环不清，中央区域的髓核为纤维组织所替代。而治疗组的椎间盘轻度退行性变，组织结构尚可分清，周围未发现炎症反应，藻酸盐完全降解。④术后12周治疗组蛋白多糖含量高于空白组和对照组（P < 0.05），Ⅱ型胶原含量低于空白组和对照组（P < 0.05）。 结论：动物实验证实藻酸盐支架复合骨髓间充质干细胞具有修复退行性变椎间盘能力，藻酸盐可以做为修复椎间盘退行性变研究的生物学材料。     

细胞移植及髓核组织工程重建修复椎间盘退变

背景：通过细胞组织工程将细胞或细胞支架复合体植入退变缺损的椎间盘内,使退变的椎间盘再生可能是治疗椎间盘退变性疾病最为理想的方法。 目的：评价组织工程髓核体内移植抑制腰椎间盘退变的临床疗效及应用前景。 方法：由第一作者检索1990/2010 PubMed数据、中国知网及万方数据库有关组织工程髓核、组织工程材料及骨髓间充质干细胞治疗腰椎间盘退变方面的文献。 结果与结论：目前常用的细胞支架主要包括胶原支架、琼脂糖支架、藻酸盐支架、聚乙醇酸支架与壳聚糖支架以及复合材料等。通过自体椎间盘细胞或间充质干细胞结合基因技术筛选种子细胞,进行细胞和/或细胞支架复合体移植恢复或再生相关细胞外基质的合成,通过逆转和修复椎间盘细胞病理性改变,为退变的椎间盘组织和功能恢复提供了全新的治疗策略。     

藻酸钠微球介导髓核细胞对骨髓间充质干细胞诱导分化的影响

背景：椎间盘退行性变的理想治疗方法是利用组织工程技术修复退行性变的椎间盘，而修复所需的髓核细胞来源十分有限。 目的：观察在藻酸盐微球的介导下，髓核细胞与骨髓间充质干细胞非接触共培养时，髓核细胞对骨髓间充质干细胞的诱导作用。 设计、时间及地点：细胞学体外观察，实验于2007-10/2008-08在华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科实验室和中心实验室进行。 材料：4月龄健康新西兰大耳白兔5只，取髓核细胞与骨髓间充质干细胞原代培养，利用传代法分离纯化。 方法：①将纯化的骨髓间充质干细胞经胰蛋白酶消化、收集，并与适量的藻酸钠溶液混合，形成109 L-1的单细胞悬液，将混合好的单细胞悬液经注射器滴加至35 g/L的CaCl2溶液中，形成海藻酸钙凝胶珠。②将海藻酸钠凝胶微球与髓核细胞共培养。在7 d和15 d时，分组溶解海藻酸钙凝胶珠，收集骨髓间充质干细胞。 主要观察指标：利用免疫组化技术、RT-PCR技术和Western blot技术检测骨髓间充质干细胞中Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达，用以判断髓核细胞对骨髓间充质干细胞在非接触条件下的诱导作用。 结果：在骨髓间充质干细胞的细胞爬片免疫组化染色中可见，Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖染色阳性，RT-PCR和Western blot结果显示经诱导后骨髓间充质干细胞中已有Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖基因的表达，且诱导15 d组的目的条带明显亮于诱导7 d组的目的条带。 结论: 在藻酸盐微球的介导下，体外非接触共同培养时髓核细胞能够实现对骨髓间充质干细胞的诱导作用。     

新式分层共培养环境下人骨髓间充质干细胞诱导髓核细胞的分化

背景：诱导分化的骨髓间充质干细胞或髓核细胞移植都存在一定的局限性,抑制自体髓核细胞的退行性变有望成为未来治疗椎间盘退变的有效方法。 目的：通过建立骨髓间充质干细胞和髓核细胞分层共培养模型,观察骨髓间充质干细胞对髓核细胞分化的影响。 方法：取传至第4代的骨髓间充质干细胞,分为2组：新式分层培养组将髓核细胞接种于去掉挂臂的Transwell小室,膜孔0.4 μm,其与骨髓间充质干细胞比例为1∶1;传统分层培养组同法将髓核细胞接种于带有挂臂的Transwell小室。同时设立单独髓核细胞培养组,各组均培养7 d。免疫组织化学法检测Ⅱ型胶原的表达,35S放射标记渗入放免定量检测蛋白多糖的合成。 结果与结论：与单独髓核细胞培养组比较,传统分层培养组、新式分层培养组Ⅱ型胶原阳性细胞数、蛋白多糖合成量均明显增加(P < 0.05,P < 0.01),且新式分层培养组增高幅度大于传统分层培养组(P < 0.05)。提示骨髓间充质干细胞与髓核细胞接触共培养后,能显著增加髓核细胞分化增殖和特征性物质的表达,且新式分层培养环境优于传统分层培养。     

转化生长因子β1对骨髓干细胞分化类髓核细胞的影响**

背景：转化生长因子β1是骨髓间充质干细胞分化为类髓核细胞的首选生长因子,适当浓度能诱导骨髓间充质干细胞的增殖和分化。 目的：观察不同质量浓度转化生长因子β1对大鼠骨髓间充质干细胞体外向类髓核细胞分化的影响,优化骨髓间充质干细胞体外培养条件。 方法：取成年大鼠股骨骨髓,体外培养、纯化。取第3代成年大鼠骨髓间充质干细胞,实验组用加入不同质量浓度转化生长因子β1(0,1,10,20 μg/L)的HG-DMEM无血清培养液诱导3,7,14,21 d;对照组普通状态下用含体积分数为10%胎牛血清的HG-DMEM培养液自然分化。 结果与结论：10 μg/L转化生长因子β1诱导液诱导的骨髓间充质干细胞蛋白聚糖与Ⅱ型胶原蛋白水平明显高于其他实验组和对照组(P < 0.01)。各实验组14 d时蛋白聚糖的表达均较3,7,21 d时高(P < 0.01)。对照组各时间点蛋白聚糖Aggrecan及Ⅱ型胶原表达均呈阴性。提示10 μg/L的转化生长因子β1能提高大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化类髓核的数量,从而使骨髓间充质干细胞发挥更高的治疗效率。     

用于骨力生物学研究的加载装置

背景：关节软骨组织细胞对力学刺激产生反馈来维持它的形态和结构,进而适应环境。加载装置能提供研究关节软骨力生物学的合适的力学环境。 目的：根据组织工程仿生的原理,建立一种用于软骨力学生物学研究的双频加载装置。 方法：该力学环境采用双频加载方式实现,通过控制可调凸轮和压电陶瓷振幅和频率来实现低频-高幅载荷耦合高频-低幅载荷,同时使用有限元法对受载体进行力学分析。 结果与结论：按照仿真的原理,研制出用于软骨力生物学研究的加载装置。在双频加载的条件下,软骨浅表层受到的力学载荷最大,其次是中间层,深层受到的力学应力最小;在高频10 Hz和20 Hz与低频1 Hz和2 Hz叠加时,软骨表现出不同的力学响应,但是二者引起的差异很小。该力学环境的构建可能有助于组织工程的发展和临床医学的应用,未来将采用生物学实验进行检验。     

数字化外科：生物电阻抗测量技术辅助临床外科的操作**☆

生物电阻抗测量（Bioelectric Impedance Measurement Method，BEI）技术是生物医学工程学的一个飞速发展的领域，利用各种组织、器官不同的电导参数(阻抗、导纳、介电常数等)，提取相关的生物医学信息，识别不同组织、器官的无损伤检测技术[1]。这种技术具有无创、廉价、安全、无毒害、操作简单和信息丰富等特点，具有广泛的应用前景。国际上已经开发出了多种基于BEI技术的无创、实时的测量和监控手段，部分产品已成功应用于辅助临床操作，值得关注     

鹿茸多肽诱导骨髓间充质干细胞体外向软骨表型的分化*☆

背景：实验证实鹿茸多肽可以促进体外培养软骨细胞的增殖和细胞外基质糖胺多糖、Ⅱ型胶原、Aggrecan蛋白的表达。 目的：通过对体外培养的兔骨髓间充质干细胞在特定培养液作用下向软骨细胞表型分化的研究,探讨鹿茸多肽对其软骨分化的影响。 方法：将第3代兔骨髓间充质干细胞随机分为空白对照组、诱导组、鹿茸多肽组,分别采用普通培养液、诱导培养液、含10 mg/L鹿茸多肽的诱导培养液于离心管内进行培养;并取兔的关节软骨细胞作为关节软骨组。分别于1,2,3周后取材,通过组织学、生物化学和RT-PCR技术,对离心管内构建的软骨组织进行形态学和细胞功能状态的观察。 结果与结论：空白对照组培养2周后,细胞团块逐渐崩解,无法进行苏木精-伊红染色。诱导组、鹿茸多肽组细胞团块除有轻度收缩外,呈白色半透明状;苏木精-伊红染色发现部分细胞为圆形或卵圆形,表层细胞密度大;诱导组、鹿茸多肽组糖胺多糖含量及Ⅱ型胶原mRNA表达随培养时间延长而增多,各时间点诱导组、鹿茸多肽组含量均高于空白对照组(P < 0.05);各时间点鹿茸多肽组糖胺多糖含量及Ⅱ型胶原mRNA表达均高于诱导组,但低于关节软骨组 (P < 0.05)。提示骨髓间充质干细胞在特定培养条件下能向软骨细胞表型分化,且鹿茸多肽对其定向软骨分化有明显促进作用。虽然在体外可以构建出软骨组织,但其与关节软骨质量相比仍有很大差距。