脂联素依赖p38-MAPK途径抑制衣霉素诱导的内质网应激致心肌细胞凋亡

目的通过原代培养SD大鼠的乳鼠心肌细胞建立衣霉素心肌细胞内质网应激损伤模型,观察脂联素对心肌细胞内质网应激致细胞凋亡的作用及其机制。方法采用酶消化法原代培养乳鼠心肌细胞,倒置相差显微镜下观察细胞生长,通过α-肌动蛋白免疫荧光法对培养的心肌细胞进行鉴定。选用原代培养3～4天的心肌细胞,随机分为五组:对照组、1 mg/L衣霉素组、1 mg/L衣霉素+100 mg/L脂联素组、1 mg/L衣霉素+3μmol/LSB203580组及1 mg/L衣霉素+3μmol/L SB203580+100 mg/L脂联素组。实验终止后,在倒置相差显微镜下观察心肌细胞形态变化,通过流式细胞术检测心肌细胞凋亡,用qRT-PCR及免疫荧光法检测内质网应激指标GRP78和CHOP的mRNA及蛋白表达。结果与对照组相比,给予衣霉素后,细胞凋亡率显著增加,GRP78和CHOP的mR-NA及蛋白表达增加。脂联素预处理后给予衣霉素,可较大程度地逆转上述指标变化,细胞凋亡率显著下降,GRP78和CHOP的mRNA及蛋白表达减少;而加用p38-MAPK抑制剂SB203580后脂联素的保护作用明显减弱,凋亡率显著增加,GRP78和CHOP的mRNA及蛋白表达增高,但较单纯衣霉素处理组凋亡率低,GRP78和CHOP的mRNA及蛋白表达也减少。结论衣霉素可使GRP78和CHOP表达增强,启动内质网应激,导致心肌细胞凋亡,脂联素可以通过减轻内质网应激逆转衣霉素所致的心肌细胞凋亡作用,对心肌细胞有保护作用,且这种保护作用部分是通过p38-MAPK途径实现的。     

磷酸肌酸钠对慢病毒介导Calumenin蛋白沉默阿霉素损伤心肌细胞内质网应激信号通路的作用

目的:探讨磷酸肌酸钠对网腔钙结合蛋白(Calumenin)沉默阿霉素损伤心肌细胞内质网应激信号通路作用。方法:培养乳鼠心肌细胞,构建稳定的慢病毒——Calumenin质粒,转染乳鼠培养心肌细胞,实验分为4组:对照组(正常细胞+3mg/L阿霉素)、模型组(慢病毒感染细胞+3mg/L阿霉素)、磷酸肌酸钠1组(正常细胞+阿霉素+磷酸肌酸钠)、磷酸肌酸钠2组(转染细胞+阿霉素+磷酸肌酸钠)。采用Western blotting技术检测各组心肌细胞Calumenin蛋白、内质网应激伴侣蛋白GRP78及内质网应激信号通路因子PERK、PATF-4PERK、eIF2ɑ、ATF-4、IRE1、CHOP表达。结果:1与对照组比较,模型组及磷酸肌酸钠2组心肌细胞Calumenin蛋白表达明显减少(P0.01)。2与对照组相比,模型组内质网应激伴侣蛋白GRP78及内质网应激信号通路因子PPERK、eIF2ɑ、ATF-4、IRE1、CHOP表达明显增多(P0.01)。3与模型组相比较,磷酸肌酸钠1组及磷酸肌酸钠2组内质网应激伴侣蛋白GRP78及内质网应激信号通路因子P-PERK、eIF2ɑ、ATF-4、IRE1、CHOP表达减少(P0.01)。结论:阿霉素损伤可能诱发ERS,并通过ERS凋亡信号通路PERK→P-PERK→eIF2a→ATF-4→CHOP/IRE1→CHOP引起心肌细胞凋亡;磷酸肌酸钠可抑制阿霉素损伤所诱导内质网应激介导的心肌细胞凋亡,这一作用机制可能是通过Calumenin蛋白抑制ERS及其凋亡信号通路PERK→P-PERK→eIF2a→ATF-4→CHOP/IRE1→CHOP实现的。     

替米沙坦对腹主动脉缩窄大鼠内质网应激相关的心肌细胞凋亡的影响

目的 探讨血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂替米沙坦对腹主动脉缩窄术后大鼠内质网应激相关的心肌细胞凋亡的影响.方法 30只雄性SD大鼠随机分为假手术组(n=10),腹主动脉缩窄组(n=10),腹主动脉缩窄+替米沙坦组(n=10).术后10周各组大鼠用导管法测量血液动力学指标并留取心肌标本测左心室质量指数,心肌细胞凋亡用TUNEL法检测,心肌内质网应激信号通路分子GRP78、CHOP用免疫印迹法和免疫组化法检测.结果 (1)腹主动脉缩窄组左心室质量指数(3.29±0.19)mg/g明显高于假手术组(2.17±0.22)ms/g(P<0.01),左心室舒张末压(9.71±0.52)mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)亦明显高于假手术组(2.79±0.13)mm Hg,左心室收缩末压(105.61 ±6.66)mm Hg明显低于假手术组(135.02 ±5.95)mm Hg(P<0.01),而腹主动脉缩窄+替米沙坦组上述指标分别为(2.34 ±0.08)mg/g、(4.70±0.36)mm Hg、(127.62 ±4.99)mm Hg,明显优于腹主动脉缩窄组(P<0.01).(2)腹主动脉缩窄+替米沙坦组心肌细胞凋亡指数(13.42 ±0.74)%显著低于腹主动脉缩窄组(35.51 ±0.65)%(P<0.01).(3)腹主动脉缩窄组内质网应激信号分子GRP78、CHOP蛋白表达RGRP78/β-actin 0.436 ±0.007、RCHOP/β-actin 0.747±0.034显著高于假手术组RGRP78/β-actin 0.144±0.009、RCHOP/β0.316 ±0.007(P<0.01),而腹主动脉缩窄+替米沙坦组GRP78、CHOP(RGP78/β-actin 0.213±0.007、RCHOP/β0.451 ±0.019),明显低于腹主动脉缩窄组(P<0.01).结论 内质网应激参与了腹主动脉缩窄术后大鼠心肌细胞凋亡,替米沙坦对内质网应激相关的心肌细胞凋亡有保护作用.     

丹参酮ⅡA对血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞凋亡的抑制作用

目的 在大鼠心肌细胞系H9c2中,观察丹参酮ⅡA对血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞凋亡和内质网应激及其特异的凋亡分子表达的影响,探讨丹参酮ⅡA抑制血管紧张素Ⅱ(AgⅡ)诱导的心肌细胞凋亡的内质网应激机制.方法 H9c2在CO2孵箱37 ℃常规培养,同步化后进行实验.细胞分为4组.正常对照组.AgⅡ组:10-6 mol/L的AgⅡ孵育48 h.AgⅡ+0.5 μg/mL TSA组同时加入10-6 mol/L的AgⅡ和0.5 μg/mL TSA培养48 h.AgⅡ+1 μg/mL TSA组同时加入10-6 mol/L的AgⅡ和1 μg/mL TSA培养48 h.培养结束,收集细胞进行Hoechst染色检测细胞凋亡的发生,实时荧光定量PCR测定GRP78、CHOP、Caspase-12 mRNA的表达.结果浓度为1 μg/mL TSA可以显著抑制AgⅡ诱导的细胞凋亡(P<0.01).内质网应激通路分子GRP78、CHOP mRNA在给以AgⅡ培养48 h表达较正常培养细胞显著增加,而同时给以0.5 μg/mL TSA可以抑制表达增加(P<0.05),当TSA为1 μg/mL时,抑制作用更明显(P<0.01).结论 TSA可以抑制AgⅡ诱导的心肌细胞系H9c2的凋亡,以及AgⅡ诱导的GRP78,CHOP mRNA表达的增加.     

微小核糖核酸-6216对过氧化氢诱导的心肌细胞氧化应激损伤的保护及机制研究

目的:探讨微小核糖核酸-6216(miR-6216)对过氧化氢(H_2O_2)诱导的心肌细胞氧化应激损伤的保护作用及机制。方法:正常体外培养AC16心肌细胞,建立H_2O_2氧化应激损伤模型,分为对照组、H_2O_2组、H_2O_2+miR-6216组、H_2O_2+miR-con组、H_2O_2+miR-6216+pc DNA-control组、H_2O_2+miR-6216+pc DNA-E2F1组。qRT-PCR检测心肌细胞miR-6216表达量; MTT法测定各组心肌细胞存活率;流式细胞数检测心肌细胞凋亡率;应用试剂盒检测CK-MB、MDA、SOD;双荧光素酶报告基因实验miR-6216与E2F1的靶向作用; Western blot法检测Bax、Bcl2、E2F1蛋白表达。结果:H_2O_2不同剂量组心肌细胞存活率显著降低(P<0. 05),miR-6216表达量显著降低(P<0. 05),与H_2O_2+miR-con组相比,H_2O_2+miR-6216组心肌细胞存活率显著升高(P<0. 05);与control组相比,H_2O_2组心肌细胞CK-MB、MDA含量及Bax蛋白表达水平显著升高(P<0. 05),心肌细胞凋亡率显著升高(P<0. 05),而SOD水平、Bcl2蛋白表达水平显著降低(P<0. 05),上调miR-6216表达能够显著逆转H_2O_2对心肌细胞凋亡率及氧化损伤的作用;miR-6216可负向调控靶基因E2F1表达; E2F1过表达可逆转上调miR-6216表达对H_2O_2诱导的心肌细胞氧化应激损伤的保护作用。结论:上调miR-6216表达可通过下调E2F1表达而减轻H_2O_2诱导的心肌细胞氧化应激损伤。     

黄芪总黄酮通过抑制内质网应激对小鼠病毒性心肌炎保护作用的实验研究

目的:探讨黄芪总黄酮对病毒性心肌炎小鼠心肌细胞内质网应激凋亡的作用。方法:将60只雄性Balb/c小鼠均分为病毒性心肌炎组、正常组及黄芪总黄酮组。病毒性心肌炎组与黄芪总黄酮组腹腔内无菌注射含0.1ml 10-9 50TCIDCVB3,正常组不注射CVB3病毒。黄芪总黄酮组小鼠每日腹腔注射20mg·L-1黄芪总黄酮0.2ml,观察小鼠的一般情况,7d时行血流动力学检查后处死取心脏标本,用TUNEL法检测各组小鼠心肌细胞凋亡情况,RT-PCR检测各组小鼠心肌细胞内质网伴侣蛋白GRP78和GRP94的mRNA表达水平。结果:1与正常组相比,病毒性心肌炎组小鼠血流动力学指标明显降低(P0.05);与病毒性心肌炎组小鼠相比,黄芪总黄酮组小鼠血流动力学指标有显著改善(P0.05)。2TUNEL染色显示,与正常组相比,病毒性心肌炎组小鼠心肌细胞凋亡明显增多(P0.05);与病毒性心肌炎组小鼠相比,黄芪总黄酮组小鼠心肌细胞凋亡显著减少(P0.05)。3与正常组相比,病毒性心肌炎组小鼠内质网伴侣蛋白GRP78和GRP94的mRNA表达水平均明显升高(均P0.05),且其变化趋势与心肌细胞凋亡数相似;与病毒性心肌炎组小鼠相比,黄芪总黄酮组小鼠内质网伴侣蛋白GRP78和GRP94的mRNA表达水平明显下降(均P0.05)。结论:黄芪总黄酮对病毒性心肌炎心力衰竭小鼠内质网应激介导的心肌细胞凋亡有保护作用,这可能是黄芪总黄酮改善病毒性心肌炎心力衰竭小鼠血流动力学的作用机制之一。     

阿霉素损伤心肌细胞miRNA378＊与calumenin、GRP78、bax及bcl-2相关性研究

目的:研究阿霉素损伤心肌细胞miRNA378*与网腔钙结合蛋白(calumenin)、内质网应激伴侣蛋白GRP78、凋亡因子bax及bcl-2相关性。方法:实验分6组:对照组、阿霉素组、miRNA378*过表达对照组、miRNA378*过表达组、miRNA378*沉默对照组、miRNA378*沉默组。原代培养乳鼠心肌细胞,采用免疫组织化学方法检测培养乳鼠心室肌细胞α-SMA蛋白,慢病毒质粒转染心室肌细胞,实时荧光定量PCR技术检测各组心肌细胞miRNA378*、calumenin、GRP78、bax及bcl-2mRNA表达。结果:1与对照组相比较,阿霉素组心肌细胞calumenin mRNA表达明显减少(P0.01),GRP78 mRNA表达增加(P0.01),bax mRNA表达增加(P0.01),bcl-2mRNA表达明显减少(P0.01)。2与阿霉素组相比较,miRNA378*过表达组心肌细胞calumenin mRNA表达增加(P0.01),bcl-2mRNA表达增加(P0.01),而GRP78mRNA表达减少(P0.01),bax mRNA表达减少(P0.01)。与阿霉素组相比较,miRNA378*沉默组GRP78、bax mRNA表达增加(P0.01),bcl-2mRNA表达减少(P0.01)。结论:阿霉素损伤可能引起心肌细胞calumenin表达减少进而发生内质网应激;上调miRNA378*表达会增加阿霉素损伤心肌细胞calumenin表达缓解内质网应激,进而抑制心肌细胞凋亡;而沉默miRNA378加重阿霉素损伤心肌细胞内质网应激及促进心肌细胞凋亡。     

ω-3多不饱和脂肪酸对HepG2细胞胆固醇代谢的影响

目的通过培养SD大鼠乳鼠心室肌细胞建立缺氧/复氧(H/R)模型,以模拟在体心肌缺血再灌注损伤,观察脂联素(APN)对心肌细胞缺氧/复氧内质网应激所致心肌细胞损伤的保护机制,为心脏缺血/再灌注损伤的防护提供理论依据。方法采用胰蛋白酶消化法原代培养乳鼠心室肌细胞,通过心肌α肌动蛋白免疫荧光法进行鉴定。选用培养72 h的单层心肌细胞,实验分为5组:正常对照组、单纯H/R组、H/R+30 mg/L APN组、H/R+30 mg/L APN+5 mmol/L SB203580(p38 MAPK抑制剂)组、H/R+5 mmol/L SB203580组。实验终止后,在倒置相差显微镜下观察心肌细胞形态的变化,采用化学比色法测定乳酸脱氢酶(LDH)的释放,用RT-PCR和Western blot测定内质网应激指标GRP78、Caspase-12的表达。结果与空白对照组相比,单纯H/R后,细胞生长状态较差,内质网应激蛋GRP78、Caspase-12的蛋白和mRNA表达明显增高,LDH的释放量增加;APN预处理后进行H/R,可较大程度地逆转上述指标变化,与H/R组相比具有显著性差异(P<0.05);而与H/R+APN组相比,H/...     

吡格列酮对缺血再灌注大鼠心肌细胞内质网应激致凋亡途径的影响

目的 观察吡格列酮对大鼠心肌细胞缺血再灌注(I/R)损伤(MIRI)后GRP78和caspase - 12蛋白表达的影响,探讨吡格列酮内质网应激途径的心肌保护.方法 Wistar大鼠30只随机分为I/R+ Pio组[灌服5 mg/(kg·d)]、I/R组及假手术组,各10只.制作大鼠心肌再灌注损伤模型.TUNEL检测心肌细胞凋亡,免疫组织化学检测GRP78和caspase - 12表达变化.结果 吡格列酮预处理组大鼠心肌细胞凋亡及GRP78、caspase - 12蛋白表达水平明显比I/R组减少(P＜0.05).结论 通过内质网应激途径可能是吡格列酮对心肌再灌注损伤的保护作用机制之一.     

N-乙酰半胱氨酸对毒胡萝卜素诱导的HepG2细胞内质网氧化应激凋亡的影响

目的 了解N-乙酰半胱氨酸(NAC)对内质网氧化应激介导的肝细胞凋亡的阻抑作用.探讨其治疗肝细胞损伤的作用机制.方法 用毒胡萝卜素(TC)诱导HepG2细胞,建立内质网应激凋亡模型,用NAC进行干预.噻唑蓝(MTT)、流式细胞仪、DNA梯形电泳检测凋亡率及活性氧(ROS),Western印迹检测葡萄糖调节蛋白(GRP)78、Caspase-12酶原及ADP聚合酶(PARP)表达.多样本间均数采用方差分析.结果 用2μmol/L TG诱导HepG2细胞0、24、36和48 h,随诱导时间延长,细胞活力逐渐下降;GRP 78、Caspase-12酶原及PARP表达增高;凋亡率逐渐增加.分别是0.7%±0.5%、27.6%±6.3%、29.7%±3.03%和47.9%±3.5%(P<0.05);ROS产生逐渐增加,分别是14.0%±0.5%、36.1%±300%、38.2%±6.0%和48.3%±12.4%(P<0.05);诱导36、48 h后细胞出现典型DNA梯形条带.10 mmol/L、20 mmol/L NAC分别与2/μmol/L TG共同温育HepG2细胞后发现,NAC可明显提高细胞活力;抑制GRP 78、Caspase-12酶原及PARP表达,细胞凋亡率分别降至14.0%±1.3%和11.0%±0.3%;细胞内ROS的产生减至34.7%±0.8%与31.5%±2.9%.结论 TG作为一种内质网特异的钙离子ATP酶抑制剂,能触发HepG2细胞内质网氧化应激凋亡;而NAC作为巯基合成的前体.直接抑制氧自由基反应,阻断内质网氧化应激介导的细胞凋亡,减轻肝细胞损伤,达到临床治疗肝功能衰竭的作用.     

脂联素通过减轻内质网应激介导的凋亡抑制心肌细胞钙化

目的通过培养SD大鼠乳鼠心室肌细胞并建立细胞钙化模型,观察脂联素对心肌细胞钙化的影响及其机制。方法采用Ⅱ型胶原酶消化法原代培养SD大鼠乳鼠心室肌细胞,α肌动蛋白免疫荧光法进行鉴定。选用培养72 h的单层心肌细胞,实验分为3组:对照组、钙化组、脂联素+钙化组。β-甘油磷酸钠和丙酮酸钠联合诱导制备心肌细胞钙化模型,茜素红和Von Kossa染色法对钙化心肌细胞进行鉴定,通过细胞钙含量、碱性磷酸酶活性和骨钙素的测定判断钙化程度。通过乳酸脱氢酶活性测定和流式细胞术检测心肌细胞凋亡。用定量实时聚合酶链反应测定骨保护素及内质网应激指标葡萄糖调节蛋白78、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶12的表达。结果与对照组相比,单纯心肌细胞钙化后,钙含量、碱性磷酸酶活性和骨钙素分泌量显著增加(P<0.01),骨保护素及内质网应激指标葡萄糖调节蛋白78和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶12在mRNA水平表达明显增高,乳酸脱氢酶活性和细胞凋亡率显著增加(P<0.01)。用脂联素进行干预后,可较大程度地逆转上述指标变化,与心肌细胞钙化组相比均具有显著差异(P<0.05),并且呈现一定的浓度依赖性。结论钙化心肌细胞可以诱导心肌细胞内质网应激介导的凋亡;脂联素可促进血管保护因子骨保护素的表达,并通过减轻内质网应激来减轻心肌细胞钙化及凋亡,对心肌细胞有保护作用。     

4,4′-二异硫氰基芪-2,2′-二磺酸对内质网应激诱导心肌细胞损伤的影响

目的探讨氯离子通道阻滞剂4,4′二异硫氰基芪2,2′-二磺酸(DIDS)对衣霉素诱导心肌细胞损伤以及内质网应激标记性分子糖调节蛋白78(GRP78)和CCAAT增强子结合蛋白样同源蛋白(CHOP)的影响。方法取乳鼠心肌细胞培养后,应用衣霉素构建心肌细胞内质网应激模型,随机分为对照组、衣霉素组、衣霉素+DIDS组、DIDS组。应用100ng/ml衣霉素处理24、48、72、96 h;另用DIDS 25、50、75和100μmol/L处理72 h,噻唑蓝法检测心肌细胞存活率,Western blot法检测GRP 78和CHOP蛋白表达水平。结果与对照组比较,衣霉素组48、72和96 h心肌细胞存活率明显降低(P<0.05);与衣霉素组比较,DIDS 50、75和100μmol/L处理明显增加心肌细胞存活率(P<0.05)。与对照组比较,衣霉素组GRP78和CHOP蛋白表达水平明显升高(P<0.05);与衣霉素组比较,衣霉素+DIDS组GRP78和CHOP表达水平明显下调(P<0.05)。结论 DIDS可以抑制衣霉素诱导的大鼠心肌细胞损伤,其机制可能与拮抗GRP78和CHOP的表达,减轻内质网应激有关。     

热休克蛋白70抑制c-Jun氨基末端激酶通路对H2O2诱导心肌细胞凋亡的保护作用

目的观察热休克蛋白70(HSP70)对H_2O_2诱导乳鼠心肌细胞凋亡的保护作用及其机制。方法培养大鼠心肌细胞,随机分为5组:对照组、H_2O_2组、热休克组、c-Jun氨基末端激酶(JNK)抑制剂组、热休克 JNK抑制剂组。生化法测定各组细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、肌酸激酶(CK)活性和丙二醛(MDA)水平,流式细胞仪分析心肌细胞凋亡,噻唑蓝(MTr)法测定心肌细胞相对活力,Western blot法检测JNK的表达。结果H_2O_2组LDH、MDA水平和CK活性明显高于其他组(P<0.01),而SOD活性则明显低于其他组(P<0.01)。细胞凋亡率H_2O_2组明显高于其他各组(P<0.01)。细胞活力H_2O_2组明显低于对照组(P<0.01),而热休克组、JNK抑制剂组、热休克 JNK抑制剂组的细胞活力明显高于H_2O_2组(P<0.01)。JNK只在H_2O_2组有表达。结论HSP70对H_2O_2诱导的心肌细胞凋亡具有保护作用,其机制可能是HSP70大量表达后抑制了JNK信号的转导。     

尾加压素Ⅱ在高糖诱导心肌细胞氧化应激、内质网应激中的作用及机制研究

目的:研究高糖刺激对心肌细胞中尾加压素Ⅱ及其受体表达的影响,并观察高糖刺激下尾加压素Ⅱ对心肌细胞氧化应激/内质网应激通路及其相关信号通路的影响.方法:本实验将原代培养的Wistar大鼠乳鼠心肌细胞培养36 h后,随机分为低糖组(5 mmol/L葡萄糖)、高糖组(25 mmol/L葡萄糖)、高渗组(5 mmol/L葡萄糖...     

番茄红素减轻H9C2心肌细胞缺氧/复氧致内质网应激的相关机制

目的 探讨番茄红素减轻H9C2心肌细胞缺氧/复氧(H/R)致内质网应激(ERS)的相关机制。方法 H9C2心肌细胞随机分为:①空白对照组、②番茄红素组、③H/R组、④番茄红素+H/R组、⑤4-苯基丁酸（4-phenyl butyric acid,4-PBA）+H/R组、⑥毒胡萝卜素内酯（thapsigargin,TG）组、⑦番茄红素+TG组。流式细胞术检测H9C2心肌细胞凋亡比例;Western blot检测葡萄糖调节蛋白(glucose-regulated proteins,GRP)78、C/EBP环磷酸腺苷反应元件结合转录因子同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun-N-terminal protein kinase,JNK)、磷酸化JNK（p-JNK）及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Casepase)-12的表达。结果 与对照组相比,H/R组及TG组细胞的细胞凋亡比例、GRP78、CHOP、p-JNK和Caspase-12蛋白表达量明显增加（P<0.01）;与H/R组相比,细胞凋亡比例及上述蛋白表达在番茄红素+H/R组与4-PBA+H/R组明显下降（P<0.01）;与TG组相比,细胞凋亡比例及上述蛋白表达在番茄红素+TG组也明显下降（P<0.01）;而番茄红素+H/R组与4-PBA+H/R组相比差异不具有统计学意义。JNK蛋白总量表达无明显变化。结论 番茄红素通过抑制ERS致凋亡的相关信号通路CHOP、p-JNK和Caspase-12对H/R H9C2心肌细胞起到保护作用。     

过表达肌浆网钙ATP酶治疗实验性慢性缺血性心力衰竭

目的 研究肌浆网钙ATP酶2a(SERCA2a)基因过表达对慢性缺血性心力衰竭(心衰)心功能及心肌内质网应激(ERS)相关凋亡的影响.方法采用ameroid环束扎小型猪前降支制备慢性缺血性心衰模型.开胸心肌内注射重组腺相关病毒以过表达SERCA2a或对照报告基因绿色荧光蛋白.60 d后检测血流动力学、SERCA2a的表达和活性、心肌凋亡及ERS标志蛋白-分子伴侣GRp78、凋亡蛋白caspase-12的表达.结果基因转导后60 d,与心衰对照及报告基因组相比,转基因组SERCA2a蛋白表达和活性显著增高,心功能参数改善,心肌凋亡指数降低,伴GRP78和活化caspase12表达下降.结论过表达SERCA2a可改善慢性缺血性心衰的心脏功能,其机制可能涉及减轻ERS相关的心肌细胞凋亡.

Abstract：

Objective Chronic myocardial ischemia (CMI) has become the most importat cause of heart failure (HF) all over the world. The aim of the current study was to investigate the effects of Sarcoendoplasmic reticulum calcium ATPaee 2a (SERCA2a) gene transfer on cardiac function and endoplasmic reticulum stress (ERS) associated myocardial apoptosis in a minipig HF animal model induced by CMI. Methods HF was induced in minipigs by implantation of ameroid constrictor in the initial segment of left anterior descending (LAD) branch of coronary artery. After confirmation of myocardial perfusion defects and cardiac function impairment by myocardial perfusion imaging and echocardiography, animals were divided into 4 groups (n =4 each): HF group, HF + enhanced green fluorescent protein (EGFP) group,HF + SERCA2a group, and shamed animals as control group. A total amount of 1×1012 v.g. Of rAAV1EGFP or rAAV1-SERCA2a were injected intramyocardially to each animal of HF + EGFP and HF +SERCA2a groups. Sixty days after gene transfer, protein level and activity of SERCA2a were examined,cardiac functions and changes of serum inflammatory and neuro-hormonal factors were determined. Apoptotic index of the ischemic myocardium, protein levels of ER stress marker glucose regulated protein 78 ( GRP 78) and ER stress specific apoptotic marker caspase-12 were also assayed. Results At the study end,echocardiographic and hemodynamic measurements indicated a significant improvement of both cardiac systolic and diastolic function in HF + SERCA2a group compared with HF/HF + EGFP groups [LVEF (60.2±8.6)%vs (44.2±7.1)% and (46.8±6.7)%, Ev/Ay 1.28±0.24 vs 0.77 ±0.17 and 0.80±0.21, +dp/dtmax(2713.9 ±434.0) mm Hg/s ( 1 mm Hg =0.133 kPa) vs (1892.3 ±434.2) mm Hg/s and (1931.2±397.4)mm Hg/s, -dp/dtmax (1422.1±334.4) mm Hg/s vs (848.3±308.3) mm Hg/s and (849.5±278.3)mm Hg/s, P＜0.05], along with increase in both SERCA2a protein level (1.13±0.26 vs 0.73 ±0.17 and 0.64±0.18, P＜0.05) and activity [(16.2±5.5) IU/ml vs (7.9±3.1) IU/ml and (7.5 ±2.8)IU/ml, P ＜0.05] compared with HF/HF + EGFP groups. Serum concentrations of inflammatory factor tumor necrotic factor α [(382.3±114.4) ng/L vs (732.3±201.4) ng/L and (689.8±192 5) ng/L, P＜0. 05], neural-hormonal factors brain natriuretic peptide [(142.6±45.3) ng/L vs (422.3±113.6) ng/L and(393.7 ±103.3)ng/L, P＜0.01], endothelin-1 [(111.4 ±37.5)ng/L vs (193.5 ±54.3)ng/L and (201.0±72.1)ng/L,P＜0.05] and angiotensin Ⅱ[(189.7±65.2)μg/L vs (538.3 ± 135.2) μg/L and ( 525.5±144.1)μg/L, P＜0.01] were also significantly decreased in HF + SERCA2a group compared with HF/HF + EGFP groups. The apoptotic index [(12.71±4.11)% vs(23.22±7.23) % and (24.31±6.38)%, P＜0.05], protein levels of GRP78 (1.27±0.33 vs 3.23±1.14 and 4.18±1.13, P＜0.05)and protein level ratios of cleaved caspase-12 to total caspase-12[(4.62±1.93)% vs (9.71±2.70)% and (10.14±2.81)%, P＜0.05] were also significantly reduced in the ischemic myocardium of HF+SERCA2a group compared with the HF/HF + EGFP groups. Conclusion Overexpression of SERCA2a significantly improved cardiac systolic and diastolic function in this HF model partly through attenuation of ER stress related myocardial apoptosis, suggesting its therapeutic potential for CM1 related heart failure.     

PDE5抑制剂对异丙肾上腺素诱导乳鼠心肌细胞肥大的作用

目的 探讨磷酸二酯酶5（PDE5）抑制剂对异丙肾上腺素（Iso）所致的乳鼠心肌细胞肥大的保护作用。 方法 分离大鼠乳鼠心肌细胞,分为对照（Con）组,Iso组及异丙肾上腺素+西地那非（Iso+Sil）组,通过检测各组细胞活力及乳酸脱氢酶（LDH）含量,确定Sil的后续实验浓度,通过RT-PCR检测心肌肥大指标心房钠尿肽(ANP)和β-肌球蛋白重链(β-MHC) mRNA含量、流式细胞计数检测凋亡情况及Western blot检测内质网应激相关蛋白葡萄糖调节蛋白78（GRP78）和CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白（CHOP）水平。 结果 与Con组相比,Iso组细胞活力降低（P<0.01）,LDH的释放增加（P<0.05）。与Iso组相比,一定浓度Sil预处理可以提高细胞活力及减少LDH的释放（P<0.05）,在5 μmol/L Sil预处理时达到最大效应。与Con组相比,Iso组增加ANP和β-MHC mRNA的表达、上调凋亡比率以及增加GRP78和CHOP的蛋白水平。与Iso组相比,Sil预处理可以降低ANP和β-MHC mRNA的表达,下调凋亡比率以及抑制GRP78和CHOP的蛋白表达。 结论 PDE5抑制剂Sil可以有效抑制Iso诱导的乳鼠心肌细胞肥大,其机制可能与凋亡和内质网应激的下调有关。     

内源性sestrin2参与抑制心肌梗死后内质网应激所诱导细胞凋亡

目的 探讨sestrin2在心梗（MI）后内质网应激中的变化及作用。 方法 结扎大鼠前降支制作MI模型建立MI组,仅开胸建立Sham组;应用衣霉素刺激新生大鼠心肌细胞建立细胞内质网应激模型（衣霉素组）应用磷酸盐缓冲溶液（PBS）为对照组。原位切口末端标记法（TUNEL）评估组织水平细胞凋亡,流式细胞仪检测细胞凋亡率。蛋白免疫印迹法检测葡萄糖调节蛋白（GRP）78、CCAAT-增强子结合蛋白（CHOP）、sestrin2表达水平。 结果 与Sham组相比,MI大鼠心脏组织中内质网应激激活,GRP 78及CHOP表达水平增加（均P < 0.01）,心肌细胞凋亡增加（P < 0.01）,伴随内源性sestrin2蛋白表达水平上调（P < 0.01）。与对照组相比,衣霉素刺激新生大鼠心肌细胞激活内质网应激,GRP 78及CHOP蛋白表达水平增加（P < 0.01,P < 0.05）,心肌细胞凋亡表型增加（P < 0.01）。在此基础上,转染sestrin2-siRNA抑制心肌细胞sestrin2表达后,CHOP蛋白表达上调（P < 0.05）,心肌细胞凋亡增加（P < 0.05）。 结论 内源性sestrin2参与抑制心肌缺血后内质网应激诱导心肌细胞凋亡。