利用Cre/loxp技术构建血管内敲除cdc42基因杂合子小鼠

目的:利用Cre/loxp条件性基因敲除技术构建血管内敲除ede42基因杂合子小鼠,并进行鉴定,为进一步在整体动物水平研究edc42在维持微血管屏障中的作用提供研究平台.方法:将引进的edc42fkxx/fkxx小鼠和血管内皮细胞特异性表达Cre重组酶的小鼠分别进行繁殖和鉴定,然后两种小鼠进行杂交,并对其子代小鼠的基因型进行鉴定,其子代基因型为Cdc42fkx/+Cre+/-的小鼠即为本实验所构建的血管内敲除edc42基因杂合子小鼠.结果:从引进这两种小鼠开始繁殖5个月,共繁殖edc42fkxx/fkx小鼠40只,取其21只进行鉴定,均为edc42flox纯合的子小鼠.血管内皮细胞特异性表达Ere重组酶的小鼠和野生型C57小鼠杂交后繁殖,共得到子代小鼠36只,其中表达Cre重组酶的小鼠17只,基因型为edc42fkxx/flox与表达Cre重组酶的杂合子小鼠杂交并繁殖,得到基因型为Cde42 fkxx/+Cre+/-的小鼠10只,基因型为Cde42fkox/Cre+/-13只.这两种基因型小鼠其身高、体重无明显差异.结论:本研究利用Cre/loxp技术成功构建了血管内敲除ede42基因杂合子小鼠.为进一步构建血管内敲除cdc42基因小鼠奠定基础,为在整体动物水平研究cdc42在维持微血管屏障中的作用提供研究平台.     

成骨细胞条件性FKBP8基因敲除小鼠模型构建

目的建立成骨细胞条件性FKBP8基因敲除小鼠模型、为研究FKBP8基因在骨质疏松症中的作用机制提供动物模型。方法设计基因敲除策略,获得纯合子小鼠和野生型对照小鼠。提取鼠尾DNA,PCR扩增之后琼脂糖凝胶电泳鉴定小鼠基因型。提取小鼠原代成骨细胞蛋白质,利用Western blot技术检验FKBP8基因的表达。结果成功构建成骨细胞条件性FKBP8小鼠敲除模型,PCR结果显示基因型为BGLAP-Cre/FKBP8flox/flox,Western blot结果显示FKBP8基因蛋白表达敲除效果明显。结论基于Cre/loxp重组酶系统,成功构建出FKBP8基因敲除鼠,为探究FKBP8在骨质疏松症的作用机制提供动物模型。     

BALB/C小鼠胚胎干细胞的分离培养及初步鉴定

目的从BALB/C小鼠的早期胚胎中分离和培养胚胎干细胞(ES细胞),并对其生物学特性进行初步鉴定.方法收集BALB/C小鼠3.5d胚龄的囊胚,分离内细胞团(ICM)细胞进行培养,以小鼠原代胚胎成纤维细胞(PMEF)作为饲养层,细胞扩增传代,观察集落的生长情况并通过碱性磷酸酶(AKP)染色对细胞集落进行初步鉴定.结果ES细胞呈集落样生长,AKP染色阳性,符合小鼠ES细胞的一些特性.结论BALB/C小鼠囊胚在原代小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上可以发育成ES细胞.     

BALB／C小鼠胚胎干细胞的分离培养及初步鉴定

目的从BALB／C小鼠的早期胚胎中分离和培养胚胎干细胞（Es细胞），并对其生物学特性进行初步鉴定。方法收集BALB／C小鼠3．5d胚龄的囊胚，分离内细胞团（ICM）细胞进行培养，以小鼠原代胚胎成纤维细胞（PMEF）作为饲养层，细胞扩增传代，观察集落的生长情况并通过碱性磷酸酶（AKP）染色对细胞集落进行初步鉴定。结果ES细胞呈集落样生长，AKP染色阳性，符合小鼠ES细胞的一些特性．结论BALB／C小鼠囊胚在原代小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上可以发育成ES细胞。     

TSC1转基因敲除小鼠动物模型的构建及敲除效果的初步研究

目的为探讨mTOR信号通路在骨骼发育过程中的机制作用,建立骨骼发育相关的TSC1转基因小鼠,提供稳定的动物模型。方法取8周龄健康清洁级TSC1flox/flox小鼠分别与肢芽干细胞特异性重组酶(Prx-1-Cre)小鼠、软骨细胞特异性重组酶(Col2al-Cre)小鼠及成骨细胞特异性重组酶(Osx-Cre)小鼠进行杂交。将繁殖出的小鼠继续与TSC1flox/flox小鼠回交,并对其子代小鼠的基因型进行鉴定及mTOR活性检测。结果杂交后分别获得肢芽干细胞特异性TSC1敲除小鼠、软骨细胞特异性TSC1敲除小鼠和成骨细胞特异性TSC1敲除小鼠各8只。与正常组比较,上述3种转基因小鼠p-S6均比正常组升高(P0.05)。结论本实验成功应用Cre/loxP系统构建肢芽干细胞特异性TSC1敲除小鼠、软骨细胞特异性TSC1敲除小鼠、成骨细胞特异性TSC1敲除小鼠,均提示mTOR活性增高,有明显TSC1敲除效果,为mTOR信号通路研究骨与软骨发育的机制作用提供实验基础。     

延胡索酰乙酰乙酸水解酶基因敲除大鼠胚胎干细胞株的建立

背景:小鼠肝损伤模型已被广泛应用,大鼠肝损伤模型能在发病机制,肝移植环境等方面更好地模拟人,建立大鼠延胡索酰乙酰乙酸水解酶(fuarylacetoacetat hydrolase,Fah)基因敲除的胚胎干细胞株是大鼠肝损伤模型建立的重点和难点。目的:建立Fah基因缺失的大鼠胚胎干细胞株。方法:根据Genbank检索出的大鼠Fah基因序列构建带有正负双向筛选系统的Fah基因敲除载体pKO-Fah,并进行大鼠胚胎干细胞制备与培养,通过电穿孔转染将线性化质粒转入大鼠胚胎干细胞中,用嘌呤霉素和增强型绿色荧光进行克隆的筛选,再对筛选出来的阳性克隆进行PCR验证。结果与结论:电穿孔转染后观察到绿荧光胚胎干细胞克隆,经过3轮嘌呤霉素药物筛选后约有90%的胚胎干细胞克隆表达绿荧光,成功挑取到2个稳定表达绿荧光的胚胎干细胞克隆,重组胚胎干细胞-Fah,通过PCR鉴定为正确同源重组的阳性克隆。提示大鼠胚胎干细胞稳定建系后,能通过传统的同源重组方法来建立基因敲除胚胎干细胞,并为后期基因敲除动物的建立奠定基础。     

延胡索酰乙酰乙酸水解酶基因敲除大鼠胚胎干细胞株的建立

背景：小鼠肝损伤模型已被广泛应用,大鼠肝损伤模型能在发病机制,肝移植环境等方面更好地模拟人,建立大鼠延胡索酰乙酰乙酸水解酶（fuarylacetoacetat hydrolase,Fah）基因敲除的胚胎干细胞株是大鼠肝损伤模型建立的重点和难点。目的：建立Fah基因缺失的大鼠胚胎干细胞株。方法：根据Genbank检索出的大鼠Fah基因序列构建带有正负双向筛选系统的Fah基因敲除载体pKO-Fah,并进行大鼠胚胎干细胞制备与培养,通过电穿孔转染将线性化质粒转入大鼠胚胎干细胞中,用嘌呤霉素和增强型绿色荧光进行克隆的筛选,再对筛选出来的阳性克隆进行PCR验证。结果与结论：电穿孔转染后观察到绿荧光胚胎干细胞克隆,经过3轮嘌呤霉素药物筛选后约有90%的胚胎干细胞克隆表达绿荧光,成功挑取到2个稳定表达绿荧光的胚胎干细胞克隆,重组胚胎干细胞-Fah,通过PCR鉴定为正确同源重组的阳性克隆。提示大鼠胚胎干细胞稳定建系后,能通过传统的同源重组方法来建立基因敲除胚胎干细胞,并为后期基因敲除动物的建立奠定基础。     

hGfap基因启动子介导的Cre重组酶在小鼠小脑中表达模式的研究

目的:探讨以人胶质纤维酸性蛋白(hGfap)基因启动子介导的Cre重组酶在小鼠小脑中的表达。方法:将hGfapcre转基因小鼠与Rosa26R转基因鼠杂交得到hGfapcre/Rosa26R基因型小鼠,分别在胚胎12.5、13.5、14.5、16.5 d和出生后3周,取小脑组织切片行X-gal染色观察Cre重组酶分布;另外,出生后3周的小脑组织切片同时使用细胞种类特异性抗体Blbp(星形胶质细胞标记物)、NeuN(颗粒细胞标记物)、Calbindin(浦肯野细胞标记物)进行免疫组织化学染色鉴定X-gal染色阳性细胞类型。结果:胚胎13.5 d,小脑菱唇开始出现X-gal染色阳性细胞;此后Cre重组酶表达范围进一步扩大,至胚胎16.5 d,X-gal染色阳性细胞可覆盖整个小脑;在出生后3周,X-gal染色阳性细胞可以和Blbp及NeuN共标记,和Cal-bindin不能共标记。结论:以hGfap基因启动子介导的Cre重组酶最早在胚胎13.5 d的菱唇开始表达,并且Cre重组酶主要表达于星形胶质细胞(包括Bergmann胶质细胞)和颗粒细胞,不表达于浦肯野细胞,表明在小脑发育过程中以GFAP为标记物的胶质细胞主要向星形胶质细胞(包括Bergmann胶质细胞)和颗粒细胞分化,不向浦肯野细胞分化。     

成年新生神经元NMDA受体NR2B亚型基因条件性敲除模型建立

目的:建立成年神经发生中新生颗粒细胞N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体NR2B亚型基因条件性敲除模型。方法:运用逆转录病毒基因标记技术,结合Cre-1oxp重组酶系统,在ROSA26-LacZ基因报告小鼠体内研究逆转录病毒RSV-pGFP:T2aCre的Cre酶重组的发生以及其转化效率。在NR2Bfl/fl转基因小鼠中建立成年新生颗粒细胞NR2B基因敲除模型。结果:在逆转录病毒注射后14 d,观察到LacZ标记的神经元及β-gal和Cre免疫荧光双标阳性细胞,在海马齿状回颗粒下层、颗粒层以及hilus区表达;同时在嗅球颗粒层也可见LacZ表达。28 dCre转化效率高达98.3%。在NR2Bfl/fl转基因小鼠,14 d时分别在嗅球和齿状回的颗粒细胞层,观察到GFP和Cre同时标记的阳性新生颗粒细胞。结论:成年神经发生中起源于海马齿状回颗粒下层和侧脑室旁脑室管膜下区的新生颗粒细胞NR2B基因敲除模型建立。     

平滑肌细胞纯化载体构建及在小鼠胚胎干细胞中的表达

背景:胚胎干细胞是平滑肌细胞重要的来源之一,但是胚胎干细胞分化细胞的异质性导致难以获得较纯的平滑肌细胞.目的:为进一步纯化胚胎干细胞来源的平滑肌细胞,拟在体外构建平滑肌特异性SM22α启动子驱动的嘌呤霉素抗性(puromycin acetyltransferase,pac)基因与增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein,EGFP)基因双表达载体,即pSM22-PAC-IRES2-EGFP载体,并在胚胎干细胞中检测其有效性及特异性.设计、时间及地点:基因水平细胞观察实验,于2007-05/2008-09在解放军沈阳军区总医院全军心血管病研究所完成.材料:小鼠胚胎干细胞系R1购自美国ATCC公司,编号SCRC-1011~(TM).pSM22α-EGFP载体由本实验室构建;pIRES2-EGFP载体、pSM2C载体、pSuper.basic载体购自Invitrogen公司.方法:用聚合酶链反应方法从pSM22α-EGFP中扩增SM22α启动子,然后用该启动子替换pIRES2-EGFP载体中的CMV启动子,构建pSM22-IRES2-EGFP.再从pSM2C中用HindⅢ/Cla Ⅰ酶切获得pac基因,将pac基因片段亚克隆到pSuper.basic中,构建pSuper-PAC.最后BgⅢ/Acc Ⅰ双酶切pSuper-PAC获得pac基因片段,将其插入到pSM22α-IRES2-EGFP,构建成pSM22α-PAC-IRES2-EGFP.将pSM22α-PAC-IRES2-EGFP用脂质体法转染胚胎干细胞,G418筛选阳性克隆.诱导胚胎干细胞阳性克隆分化,RT-PCR扩增pac基因鉴定阳性克隆.对分化细胞行平滑肌细胞标志物SMα-actin免疫荧光染色.主要观察指标:①pSM22α-PAC-IRES2-EGFP测序结果.②pac基因扩增.③荧光显微镜下同时观察分化细胞EGFP的表达及SMα-actin染色情况.结果:HindⅢ/Cla Ⅰ双酶切得到261 bp,664 bp,5 000 bp 3个片段,与预期结果一致,测序结果证实pSM22α-PAC-IRES2-EGFP构建成功.Pac基因扩增证实有4株胚胎干细胞克隆转染成功.转染成功的胚胎干细胞被诱导分化后,部分细胞表达EGFP,且这些细胞SMα-actin染色呈阳性.结论:实验成功构建了平滑肌细胞筛选载体pSM22α-PAC-IRES2-EGFP.成功转染这一载体的胚胎干细胞表达pac基因及EGFP基因,且EGFP表达具有平滑肌特异性.     

昆明鼠胚胎干细胞系的建立及其特性

背景:到目前为止,国际上通用的动物胚胎干细胞细胞系大多是从129品系和C57BL/6系小鼠中获得的,少部分来自BALB/C系,来自于中国昆明鼠则鲜有报道.目的:分离培养昆明系小鼠胚胎干细胞,并对其生物学特性进行初步鉴定.设计、时间及地点:以细胞为对象的观察性实验,于2006-05/2007-06在南昌大学第一附属医院泌尿外科研究所完成.材料:昆明小鼠3.5 d胚龄的囊胚.方法:自昆明系小鼠3.5 d胚龄的囊胚分离内细胞团细胞,接种于小鼠原代胚胎成纤维细胞饲养层上,对分离的内细胞团细胞进行扩增、传代培养.主要观察指标:观察胚胎干细胞集落的生长情况,对其碱性磷酸酶表达进行染色分析,采用免疫荧光法检测其阶段特异性胚胎抗原1表达,以反转录-聚合酶链反应检测其特异性表达因子c-Myc,Nanog,Oct3/4和Sox2的基因表达情况,并对其体内外分化能力对进行鉴定分析.结果:分离、培养自内细胞团的细胞呈典型的胚胎干细胞集落样生长,碱性磷酸酶染色及阶段特异性胚胎抗原1荧光染色阳性,细胞表达c-Myc,Nanog,Oct3/4和Sox2等基因,细胞在体内外均能分化成来源于不同胚层的多种细胞类型.结论:成功从昆明小鼠囊胚中分离并建立一株胚胎干细胞系,其生物学特性与其他胚胎干细胞株相符.     

Prdm1基因敲除小鼠的繁育和基因型鉴定

本研究目的是繁育和鉴定prdm1基因敲除的小鼠,为进一步研究Blimp-1蛋白的功能奠定基础。将所引进的2种转基因纯合子小鼠B6.prdm1flox/flox和B6.Lck-Cre进行饲养并繁殖,繁殖成功后获得第1代小鼠,将第1代小鼠再次进行交配获得基因型为:B6.prdm1wild/wild.Lck-Cre、B6.prdm1wild/wild、B6.prdm1flox/flox.Lck-Cre、B6.prdm1flox/wild.Lck-Cre、B6.prdm1flox/flox、B6.prdm1flox/wild。提取第2代小鼠基因组DNA,应用聚合酶链反应(PCR)扩增Cre和loxp基因片段后琼脂糖凝胶电泳分别检测cre和loxp基因组DNA的大小。取基因型为B6.prdm1flox/flox.Lck-Cre即为条件性基因prdm1敲除小鼠,选择B6.prdm1flox/wild.Lck-Cre、B6.prdm1flox/flox、B6小鼠作为对照,应用磁珠分选脾脏T淋巴细胞和B淋巴细胞,并应用Western blot方法检测Blimp-1目的蛋白。结果表明,2种转基因纯合子小鼠均有繁殖能力,其子代相互繁殖后第2代小鼠分离比例基本符合孟德尔遗传规律,亦可以成功获得较多的prdm1基因敲除小鼠。结论:应用Cre-loxp系统可以成功地获得prdm1基因敲除的小鼠。     

RNA结合蛋白Mbnl1调控小鼠胚胎造血干细胞发育功能的研究

目的:分析小鼠胚胎造血干细胞(HSC)发育全程的单细胞RNA结合蛋白(RBPs)动态分子表达特征,筛选获得功能研究靶标RNA剪接因子——Mbnl1,并阐明Mbnl1参与调控小鼠胚胎HSC发育的功能。方法:生物信息学深入分析小鼠胚胎HSC发育全程的单细胞转录组数据,获得HSC发育全程的单细胞RBP动态分子表达图谱。结合差异分析以及文献调研筛选获得Mbnl1。利用CRISPER/Cas9技术构建Mbnl1基因敲除小鼠模型,采用甲基纤维素半固体培养体系,针对E11.5的Mbnl1~(+/+)和Mbnl1~(-/-)两种基因型小鼠胚胎的主动脉-性腺-中肾区(AGM)以及卵黄囊(YS)组织进行体外造血集落培养实验,7 d后统计造血集落的数量和类型;进一步通过尾静脉分别移植E11.5的Mbnl1~(+/+)和Mbnl1~(-/-)供体小鼠的整个AGM组织细胞,并通过检测受体小鼠4、8周的外周血移植嵌合率,依据小鼠造血系统重建的动力学实验来评价Mbnl1基因敲除后,AGM区HSC的功能是否受到影响。结果:体外造血集落培养实验结果初步提示,E11.5时Mbnl1~(+/+)和Mbnl1~(-/-)两种基因型小鼠胚胎AGM区和YS的造血集落数量并无显著差异,表明Mbnl1基因敲除后,AGM和YS组织中的造血祖细胞功能并未发生异常;Mbnl1~(+/+)及Mbnl1~(-/-)小鼠胚胎AGM区细胞的尾静脉移植实验结果显示,两者造血重建嵌合率并无显著差异,提示Mbnl1基因敲除后AGM组织中的HSC功能并未发生异常。结论:体内外的功能实验证实Mbnl1敲除后并不影响小鼠胚胎AGM区造血干祖细胞的发育。     

昆明种小鼠胚胎干细胞的分离、培养与鉴定

目的探讨昆明种小鼠胚胎干细胞的分离、培养和鉴定。方法收集小鼠14—16d胚龄的囊胚,以小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层,形成的胚胎干细胞（ES）细胞样集落,分离隆起生长的胚胎内细胞团并继续培养,观察集落的生长状态,通过碱性磷酸酶染色进行的分析鉴定,并对其体外分化能力进行检测。结果共培养收集74个昆明小鼠的囊胚,其中有53个囊胚的内细胞团（ICM）离散程度较强;ES细胞集落的特征呈鸟巢状,其细胞圆小,细胞核大,排列紧密,边缘清晰,细胞之间的界限不清楚;碱性磷酸酶（AKP）染色呈阳性,集落呈红棕色或蓝色,成纤维细胞或分化细胞呈淡黄色或无色;体外悬浮培养时,Es细胞集落能够形成简单拟胚体,且EBs外向性生长,周围分化的细胞形态成多样性。结论昆明小鼠是我国应用最多的实验小鼠,建立昆明小鼠的Es细胞系有利于其转基因动物的获得,能够为我国的科研工作更好地服务。     

内皮细胞特异性缺失PTEN基因对小鼠胚胎AGM区血液血管干细胞发育的影响

本研究探讨内皮细胞特异性缺失PTEN基因能否影响小鼠胚胎AGM区血液血管干细胞(hemangioblast)的发育。基于Cre/loxP系统,获得Tie2CrePtenloxp/loxp和Tie2CrePtenloxp/wt基因型小鼠胚胎。采用PCR方法进行基因型鉴定;分离E10-E10.5胚胎AGM区,用胶原酶消化成单细胞,在甲基纤维素半固体体系里进行BL-CFC(blastcolony-forming cell)培养,4-5天后计数BL-CFC数目。将单个BL-CFC挑出进行扩增培养,悬浮细胞进行造血集落培养,贴壁细胞在Matrigel上进行体外成血管实验,鉴定其双向分化功能。结果表明:内皮细胞特异性缺失PTEN基因,小鼠胚胎AGM区BL-CFC数量下降;同时,BL-CFC的造血分化能力增强,但BL-CFC来源的内皮细胞体外成血管能力下降。结论:内皮细胞特异性缺失PTEN基因,可以在血液血管干细胞水平影响造血和内皮细胞的分化。     

小鼠囊胚细胞凋亡和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达与维甲酸的诱导作用

背景：细胞凋亡是维甲酸导致早期胚胎异常发育的原因之一,而半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3介导的细胞凋亡是细胞凋亡的主要途径。目的：观察维甲酸对体外培养小鼠囊胚细胞凋亡的影响,以及对囊胚细胞中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的改变。方法：获取妊娠3.5d小鼠囊胚,分别在含0,1和10μmol/L维甲酸的M199培养基中培养24h,用带有荧光标记的原位末端标记法观察维甲酸对小鼠囊胚细胞凋亡的效应;并用免疫组织化学S-P法检测维甲酸对小鼠囊胚半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达。结果与结论：所有组均观察到囊胚细胞凋亡和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达,高剂量维甲酸组中囊胚细胞凋亡荧光值,半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的平均吸光度值和阳性面积率均显著升高（P〈0.01）。结果提示维甲酸可促进体外培养小鼠囊胚细胞凋亡和及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达,证实了维甲酸对小鼠胚胎的发育的细胞毒性作用。     

小鼠囊胚细胞凋亡和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达与维甲酸的诱导作用

背景:细胞凋亡是维甲酸导致早期胚胎异常发育的原因之一,而半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3介导的细胞凋亡是细胞凋亡的主要途径。目的:观察维甲酸对体外培养小鼠囊胚细胞凋亡的影响,以及对囊胚细胞中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的改变。方法:获取妊娠3.5d小鼠囊胚,分别在含0,1和10μmol/L维甲酸的M199培养基中培养24h,用带有荧光标记的原位末端标记法观察维甲酸对小鼠囊胚细胞凋亡的效应;并用免疫组织化学S-P法检测维甲酸对小鼠囊胚半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达。结果与结论:所有组均观察到囊胚细胞凋亡和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达,高剂量维甲酸组中囊胚细胞凋亡荧光值,半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的平均吸光度值和阳性面积率均显著升高(P<0.01)。结果提示维甲酸可促进体外培养小鼠囊胚细胞凋亡和及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达,证实了维甲酸对小鼠胚胎的发育的细胞毒性作用。     

混合嵌合体与移植耐受

大量实验已在受者体内成功诱导了混合嵌合体形成,且证实其较完全供者嵌合体具有更强的免疫力。混合嵌合状态下的供者特异性反应细胞的克隆消失,使移植物在受者体内得以长期存活。这一研究结果无疑为临床诱导混合嵌合体所采用的预处理方案提出了新思路,诱导混合嵌合体形成以获得移植耐受将成为临床切实可行的策略。     

特异性针对大鼠甲状旁腺激素受体1基因siRNA表达载体构建及鉴定

目的:构建并筛选携带针对大鼠甲状旁腺激素受体1基因的pSUPERretro-GFP/Neo干扰逆转录病毒载体及鉴定。方法:根据Genbank筛选甲状旁腺激素受体1基因3个阳性克隆及1个阴性克隆序列,定向克隆入逆转录病毒载体pSUPERretro-GFP/Neo,并用RT-PCR和测序鉴定,将其转染至胰岛素-1细胞中,Westernblot观察甲状旁腺激素受体1基因表达,鉴定其转染效率。结果:菌落RT-PCR及基因测序鉴定结果表明序列正确,并能成功转染到胰岛素-1细胞株中,Western blot筛选最佳抑制基因。结论:成功构建并筛选出特异性沉默大鼠甲状旁腺激素受体1基因的pSUPERretro-GFP/Neo干扰逆转录病毒载体,为深入探讨大鼠甲状旁腺激素受体1基因的抗凋亡作用奠定了试验基础。