人B7-H1-Fc融合分子的构建及其在CHO细胞中的表达与鉴定

目的利用基因工程手段构建hB7-H1-Fc重组cDNA,用真核表达系统制备有活性的hB7-H1-Fc融合蛋白.方法 PCR方法从活化的人T细胞cDNA文库中扩增编码人B7-H1膜外区的cDNA序列, 将其与人IgG1Fc和pCI-neo片段连接,构建成hB7-H1-Fc重组表达载体.用脂质体法转染CHO细胞, 夹心ELISA法检测上清中融合蛋白hB7-H1-Fc的表达,经Protein A 亲合层析纯化,SDS-PAGE、免疫印迹鉴定表达产物. 结果 PCR扩增得到编码人B7-H1膜外区的727 bp基因片段,与hIgG1Fc的cDNA片段一起连接并插入pCI-neo表达质粒.重组质粒转染CHO细胞后, 夹心ELISA法检测显示培养上清中有hB7-H1-Fc蛋白表达.纯化后的hB7-H1-Fc蛋白经SDS-PAGE和免疫印迹鉴定其分子质量约51.76×103,与理论预测值相符. 结论成功构建了hB7-H1-Fc重组表达载体,利用哺乳动物细胞CHO表达出有活性的hB7-H1-Fc融合蛋白,为进一步研究B7-H1分子在免疫耐受、自身免疫性疾病中的作用奠定了基础.     

幽门螺杆菌cagA蛋白的克隆表达与鉴定

目的　构建表达幽门螺杆菌 (Hp)毒素相关基因A蛋白 (cagA)的重组质粒 ,并在大肠杆菌中表达获得基因重组蛋白 ,为检出幽门螺杆菌致病株和运用于临床检测Hp感染奠定基础。 方法　PCR扩增出编码毒素相关基因蛋白DNA片段后构建出重组质粒 pET -cagA ,并经质粒酶切筛选、DNA测序、IPTG诱导DE3 表达融合蛋白和Western blot予以证实。表达的融合cagA蛋白经过纯化和凝血酶酶切验证cagA蛋白抗原性。 结果　克隆的cagA核苷酸序列与GeneBank(AB116 74 4 )公布的序列相比较 ,同源性达 99.34% ,推定氨基酸序列同源性为 99.0 1%。SDS -PAGE和Western blot检测到带有His tag的约 4 0kD融合蛋白中表达。融合蛋白酶切后能与抗cagA人抗血清发生阳性反应。 结论　重组cagA的原核表达质粒构建正确 ,蛋白表达成功 ,具有反应原性     

人重组CD137-Fc分子的构建与真核表达

目的构建人CD137-Fc基因的真核表达质粒，并表达有生物学活性的纯化人CD137-Fc融合蛋白。方法从cDNA文库中用PCR扩增cD137全长编码基因，并导入真核表达载体pcDNA3中。测序证实后，继续用PCR扩增其膜外区cDNA，酶切后与hIgGIFc基因一起装入真核表达载体pcDNA3中，转染293T细胞瞬时表达，用夹心ELISA检测其表达情况，经蛋白A亲和纯化，用SDS-PAGE与免疫印迹进行鉴定。结果测序证实构建的CD137与CD137-Fc cDNA阅读框完整，连接部位序列正确；ELISA证实cD137-Fc蛋白的表达；SDS-PAGE与免疫印迹证实其为人cD137-Fc蛋白。结论获得了纯化的hCD137-Fc融合蛋白，为探讨CD137在免疫自稳调节中的地位，以及探索CD137的其它生物学功能奠定了坚实的实验基础     

人sPD-1-Fc融合蛋白的构建及真核细胞的表达

目的：通过构建重组的人pSG5-Fc-hPD-1嵌合基因质粒,并在真核细胞进行表达,得到分泌性的sPD-1-Fc融合蛋白。为PD-1的生物学活性研究奠定基础。方法：根据人PD-1胞外区的基因序列,设计特异性引物,以人淋巴细胞cDNA为模板PCR扩增得到人PD-1胞外区片段。以pSG5-Fc真核表达质粒为载体,构建得到重组质粒pSG5-Fc-hPD-1。脂质体瞬时转染猴肾成纤维细胞（Cos-7）,收取72小时的细胞上清。westernBlot方法鉴定,并与原核表达的人PD-L1蛋白免疫共沉淀检测生物学活性。结果：通过EcoR1/BamH1双酶切及测序证实构建的重组质粒pSG5-Fc-hPD-1正确。重组质粒在Cos-7细胞中高效表达并分泌融合蛋白sPD-1-Fc到细胞上清,应用westernblot测定到上清中的融合蛋白,且得到的sPD-1-Fc融合蛋白具有与PD-L1结合的生物学活性。结论：通过基因重组方法在真核细胞里得到高效分泌型表达的sPD-1-Fc重组蛋白,为研究PD-1生物学活性奠定了实验基础。     

重组人p75NTR169-Fc抗酶裂嵌合体在大肠杆菌中的表达、纯化及活性鉴定

目的制备重组人p75NTR169-Fc融合蛋白,其是一种潜在的抗凋亡和止痛的候选药物。方法 (1)应用PCR法,以本组保存的pUC12-NGFR和人肝cDNA为模板,扩增出p75NTR(1～169氨基酸),IgG Fc(216～433氨基酸)基因顺序,再按照重叠PCR的原则和方法,将两组扩增产物混合变性、复性后再扩增,得到"p75NTR(1～169)-IgG Fc(216～433)"融合基因,缩写为p75NTR169-Fc。(2)应用DNA重组技术将p75NTR169-Fc融合DNA片段经NcoⅠ、EcoRⅠ酶切插入到pET28a(+)原核表达载体中,获得pET28a-p75NTR169-Fc重组质粒。(3)利用pET28a(+)/BL21(DE3)原核表达系统诱导表达目的蛋白,经protein A亲和层析纯化,得到纯度约96%的p75NTR169-Fc重组蛋白质。(4)用MTT方法,以PC12细胞检验不同剂量重组蛋白抗β-淀粉样肽(Aβ25～35)细胞毒的作用。结果 (1)成功构建了pET28a-p75NTR169-Fc/BL21(DE3)表达系统,其高效表达可溶性重组蛋白。实验表明:该重组蛋白p75NTR169-Fc稳定性好,不再被蛋白酶降解,为单一条带。亲和层析纯化后,分子质量均一。(2)p75NTR169-Fc与p75NTR竞争结合Aβ(25～35),拮抗Aβ(25～35)对PC12的细胞毒作用。结论重组人抗酶裂嵌合体蛋白p75NTR169-Fc具有生物学活性,在临床治疗阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)上具有应用前景,系针对神经退行性疾病的新的候选药物。     

外源性CYR61基因转染与整合素分子表达的关系

目的探讨外源性CYR61在人外周血单个核细胞(PBMC)中表达后诱导其配体——整合素表达上调的生物学特性。方法构建人源全长CYR61真核重组表达质粒pcDNA-CYR61-Fc,经DNA测序确认其序列正确后,将该质粒转染COS7细胞并用蛋白免疫印迹实验检测其蛋白的表达;用脂质体法转染人PBMC,实时定量PCR检测CYR61表达量和相关整合素的表达格局。结果测序显示所构建的CYR61重组表达质粒序列正确;将该质粒转染COS7细胞后,免疫印迹实验表明转染的细胞胞浆和营养液上清中都含有CYR61-Fc融合蛋白;将该质粒转染人PBMC,经植物凝集素刺激后,外源性CYR61迅速表达,24 h后表达量达到高峰,然后迅速下降,48 h后基本回落,整合素分子αv、αM、β3及β5表达明显上调(P<0.05),以β5最为显著(P<0.01)。结论成功构建的pcDNA-CYR61-Fc真核表达质粒能有效地表达和分泌CYR61-Fc融合蛋白;表达的融合蛋白通过自分泌或旁分泌途径上调PBMC整合素分子的表达。     

外源性CYR61基因转染与整合素分子表达的关系

目的 探讨外源性CYR61在人外周血单个核细胞(PBMC)中表达后诱导其配体--整合素表达上调的生物学特性. 方法 构建人源全长CYR61真核重组表达质粒pcDNA-CYR61-Fc,经DNA测序确认其序列正确后,将该质粒转染COS7细胞并用蛋白免疫印迹实验检测其蛋白的表达;用脂质体法转染人PBMC,实时定量PCR检测CYR61表达量和相关整合素的表达格局. 结果 测序显示所构建的CYR61重组表达质粒序列正确;将该质粒转染COS7细胞后,免疫印迹实验表明转染的细胞胞浆和营养液上清中都含有CYR61-Fc融合蛋白;将该质粒转染人PBMC,经植物凝集素刺激后,外源性 CYR61迅速表达,24 h后表达量达到高峰,然后迅速下降,48 h后基本回落,整合素分子αv、αM、β3及β5表达明显上调(P＜0.05),以β5最为显著(P＜0.01). 结论 成功构建的pcDNA-CYR61-Fc真核表达质粒能有效地表达和分泌CYR61-Fc融合蛋白;表达的融合蛋白通过自分泌或旁分泌途径上调PBMC整合素分子的表达.     

东亚钳蝎钙通道样毒素的克隆与其在大肠杆菌中的表达

目的:克隆东亚钳蝎钙通道样毒素(BmCa)基因,并构建原核表达质粒,在大肠杆菌中重组表达该毒素蛋白.方法:以东亚钳蝎尾毒腺的总RNA为模板,通过RT-PCR技术,扩增并克隆BmCa的cDNA基因,并将该基因重组到PET-GST表达载体中,转化入大肠杆菌BL21并诱导表达,采用Ni-SuperChelating Resin柱亲和层析纯化,用小白鼠毒性实验检测融合蛋白的活性.结果:成功克隆BmCa基因并构建原核表达质粒,IPTG诱导后表达分子质量约为33KD的融合蛋白,含量为大肠杆菌总蛋白的25%,经亲和层析得较高纯度的融合蛋白,小白鼠毒性实验表明融合蛋白具有活性.结论:在大肠杆菌中成功表达了有活性的东亚钳蝎钙通道样毒素蛋白,为其功能研究奠定基础.     

泡球蚴18基因的克隆、原核表达质粒的构建及其初步表达的研究

目的：克隆、分析泡球蚴18(Em18)抗原基因,构建pET41a-Em18原核表达质粒．并初步诱导表达Em18重组蛋白。方法：DNAman软件设计引物．RT-PCR法克隆Em18 cDNA并构建pMD18-T／Em18质粒，测序确定序列，利用DNAman和BLAST软件．对其进行基因序列分析。构建pET41a-Em18原核表达质粒，测序鉴定插入序列正确性。IPTG初步诱导和表达rEm18-GST重组蛋白。SDS-PAGE电泳检测。结果：测序结果显示Em18抗原基因长度为486bp，编码161个氨基酸。BLAST比对分析表明为一新序列并被GenBank收录(AY513691)。构建的pET41a-Em18原核表达质粒．经IPTG诱导后．SDS-PAGE检测表明rEm18-GST重组蛋白得到成功表达，在相对分子量为50KDa处有表达条带。结论：成功克隆并构建了pET41a-Em18原核表达质粒．初步诱导表达出rEm18-GST重组蛋白，为新一代包虫病诊断试剂盒的研制莫定基础。     

肿瘤抗原基因MAGE-3的克隆、原核表达与纯化

目的: 克隆人MAGE-3基因并进行原核表达和分离纯化. 方法: 通过RT-PCR从人黑色素瘤细胞株中扩增MAGE-3全长cDNA,经PCR扩增MAGE-3基因3′端324 bp片段,克隆入pGEX-4T-1载体,构建重组原核表达质粒pGEX/MAGE-3,对含有该质粒的大肠杆菌DH5α进行诱导表达和分离纯化.结果: 经RT-PCR扩增出大小约950 bp的基因片段,以此为模板经PCR扩增出约320 bp片段,测序结果与GenBank公布的MAGE-3序列一致,成功构建了pGEX/MAGE-3原核表达质粒,经IPTG诱导在大肠杆菌中表达Mr约42 000的GST融合蛋白,纯化的蛋白纯度为89%.结论: 成功克隆了人MAGE-3基因全长cDNA并对其3′端324 bp片段编码的108个氨基酸的蛋白进行了原核表达和分离纯化,为该蛋白应用于肿瘤免疫治疗奠定了基础.     

奥硝唑对映体对小鼠中枢抑制作用研究

探讨左旋和右旋奥硝唑静脉注射(iv)对小鼠中枢神经系统抑制作用的机制,以及奥硝唑光学对映体之间神经毒性的差异,为临床用药提供指导。左旋及右旋奥硝唑(40,60,80 mg/kg,iv)给药30 min后,用转棒实验测定小鼠运动协调能力,以评价药物对小鼠中枢抑制作用的强弱。测定并比较对小鼠给药30 min后全脑Na⁺,K⁺-ATP酶、Ca²⁺-ATP酶、琥珀酸脱氢酶（SDH）活性的影响。右旋奥硝唑可使小鼠呈现中枢抑制状态,影响其运动协调能力,并呈剂量相关性地抑制脑内Na⁺,K⁺-ATP酶、Ca²⁺-ATP酶、SDH活性。左旋奥硝唑组则均与对照组无显著性差异。右旋奥硝唑的中枢抑制作用可能与抑制脑内Na⁺,K⁺-ATP酶、Ca²⁺-ATP酶活性,抑制呼吸链关键酶SDH有关。     

p57kip2 基因在子痫前期患者胎盘表达的研究

目的 探讨p57kip2基因的核酸及蛋白水平在正常孕妇和子痫前期患者胎盘上的表达,探索p57kip2基因与子痫前期发病之间的关系.方法 运用免疫组织化学SP法对p57kip2基因在胎盘组织中的表达进行定位检测;通过逆转录聚合酶链反应法(RT-PCR)对37例重度子痫前期、22例轻度子痫前期及53例正常妊娠胎盘组织中的p57kip2基因的核酸水平进行检测;通过免疫印迹法对纳入对象的p57kip2蛋白表达水平进行检测.结果 免疫组化结果显示p57kip2基因选择性表达于胎盘滋养细胞的细胞核中.RT-PCR结果显示:与正常妊娠组比较,轻、重度子痫前期组p57kip2基因mRNA表达无明显变化(P＞0.05),重度子痫前期组p57kip2基因的mRNA表达水平低于轻度子痫前期组[P＜0.05,95％CI:(-0.736 9,-0.095 8)].免疫印迹结果显示:与正常妊娠组比较,轻、重度子痫前期组p57kip2蛋白表达无明显变化(P＞0.05),但重度子痫前期组p57kiP2蛋白的表达水平低于轻度子痫前期组[P＜0.05,95％CI:(-1.441 7,-0.162 4)].结论 p57kip2基因的核酸和蛋白在重度子痫前期患者胎盘中的表达水平均低于轻度子痫前期患者,提示p57kip2基因可能参与子痫前期的病理过程.     

王不留行中王不留行黄酮苷的分离与鉴定

目的 分离鉴定王不留行药材中的特征成分。方法 利用硅胶柱色谱、葡聚糖凝胶柱色谱进行分离,通过理化常数、核磁共振、变温核磁共振和质谱等多种技术鉴定化合物。结果 分离得到一个化合物,鉴定为王不留行黄酮苷。结论 王不留行黄酮苷在王不留行中的量较高,可以作为王不留行及其炮制品质量控制的指标性成分;首次报道了王不留行黄酮苷的¹³C-NMR数据及其旋转异构现象。     

胡颓子叶对豚鼠离体气管平滑肌收缩功能的影响

目的 研究胡颓子叶乙醇提取物正丁醇部位（胡颓子叶正丁醇部位）对正常及多种致痉剂诱导的豚鼠气管平滑肌收缩功能的影响。方法 制备豚鼠离体气管平滑肌螺旋条,在其正常状态下以及用乙酰胆碱、组胺、氯化钾、无钙下乙酰胆碱诱导细胞内钙释放和高钙下诱发细胞外钙内流条件下,观察胡颓子叶正丁醇部位对离体气管张力的影响。结果 胡颓子叶正丁醇部位对静息状态下的豚鼠离体气管平滑肌有明显的舒张作用,使乙酰胆碱和组胺的量效曲线发生明显右移,抑制加入高钾或高钙后引发细胞外钙内流导致的收缩。结论 胡颓子叶正丁醇部位能明显抑制正常状态及多种致痉剂诱发的豚鼠气管平滑肌收缩。     

Changes in Ca2+-ATPase in a guinea pig endolymphatic hydrops model

ObjectiveTo investigate the localization of Ca(2+)-ATPase (Ca(2+) pump) in the cochlear and its change afterendolymphatic hydrops, and to study the relationship between compound action potential (CAP) threshold and the Ca(2+)-ATPase activety.MethodsThe left endolymphatic sac was ablated to induce endolymphatic hydrops in fourteen healthy guinea pigs with normal action potential thresholds measured after asliver ball electrode placed on the round window.Ca(2+)-ATPase activity was studied cytochemically using a lead citrate reaction in control and hydropic ears.The reaction product was lead phosphate particles as an expression of Ca(2+) -ATPase activity, observed with an eletron microscope.ResultsCa(2+)-ATPase activity is mainly found on the endolymphatic surface of Reissner’s membrane, the stereocilia and cuticular plate of inner and outer hair cells, and along the infolded plasma membrane ofstrial marginal cells.CAP thresholds of filtered click are increased and Ca(2+)-ATPase activity significantly decreased after endolymphatic hydrops in the mentioned locations.ConclusionsCAP thresholds are increased and Ca(2+)-ATPase activity are significantly decreased in the cochlea after endolymphatic hydrops.These results suggest that there is a negative correlation between them.      

Shkbp1缺失对小鼠T淋巴细胞系亚群的影响

目的探讨Shkbp1缺失小鼠(Shkbp-1~(-/-))的血液、骨髓、脾脏中血液细胞分类和T细胞亚群的变化。方法采用Shkbp-1~(-/-)转基因小鼠,经PCR鉴定基因型;利用全自动血液检测仪测定血液细胞分类;采用流式细胞仪检测Shkbp-1~(-/-)和对照组小鼠血液、骨髓、和脾脏中T淋巴细胞亚群。结果血常规结果:中性粒细胞和嗜酸性粒细胞有增高趋势,且有显著差异。淋巴细胞未见显著差异。流式结果显示:对照组血液中CD4~+CD8~+双阳性细胞降低,骨髓中CD3~+、CD4~+升高。但脾脏组织中,其CD3~+、CD4~+、CD8~+、CD4~+CD8~+双阳性细胞均呈下降趋势。结论 Shkbp1参与血液细胞的成熟分化,影响了免疫细胞数量,本研究为探索Shkbp1如何参与血液细胞的分化奠定了研究基础。     

卡立泊来德预处理对肺缺血再灌注损伤的保护作用

目的 探讨选择性Na+/H+交换-1拮抗剂卡立泊来德预处理对兔肺缺血再灌注损伤的作用。方法 将24只新西兰大白兔随机分为假手术组（Sham组）、缺血再灌注组（IR组）、低钾右旋糖酐组（LPD组）和卡立泊来德组（HOE组）,每组6只。麻醉后开胸,游离左肺门绕过阻断带,分别于30 min内经静脉泵入等量生理盐水、LPD液或含卡立泊来德的新型器官保护液,除Sham组观察180 min外,余3组均结扎左肺门60 min后,再开放观察120 min,建立在体兔肺缺血再灌注损伤模型。于结扎前（即缺血期前）,开放即刻（即再灌注即刻）,再灌注后15、30、60、90和120 min分别抽取股动脉血进行血气分析。再灌注结束后取左肺组织测定肺含水量（lung water content,LWC）、丙二醛（malondialdehyde,MDA）含量、超氧化物歧化酶（super oxide dismutase,SOD）活性、白细胞介素-6（interleukin-6,IL-6）含量、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）含量和钠氢转运体-1（natrium hydrogen exchanger-1,NHE1）表达量,并进行肺组织病理学观察。结果 同IR组相比,LPD组和HOE组氧合指数（再灌注开始后）和肺组织SOD活性升高,肺组织LWC、MDA含量、IL-6含量、TNF-α含量、NHE1表达量（P<0.05）和肺组织病理学评分降低（P<0.008）;除肺组织病理学评分外（P>0.008）,HOE组余各项指标均较LPD组改善明显（P<0.05),但仍未恢复至Sham组水平（P<0.05）。结论 卡立泊来德可通过减少NHE1蛋白表达以减轻缺血再灌注期间氧化应激和炎症反应,并同时增强组织抗氧化能力,从而有效减轻在体兔肺缺血再灌注损伤。     

基于植物代谢组学技术的远志不同炮制品质量控制研究

目的 运用基于¹H-NMR和UPLC的植物代谢组学技术对生远志、蜜远志及甘草制远志进行代谢组学分析。方法 首先采用基于¹H-NMR及UPLC代谢组学技术对生远志及两种炮制品进行分析,指认初级代谢产物21种,次级代谢产物8种,并采用UPLC技术测定三者中细叶远志皂苷的量。结果 生远志与蜜远志、甘草制远志化学成分明显不同;与蜜远志相比,生远志与甘草制远志化学成分更加接近;三者中部分氨基酸、有机酸及糖类等的量变化较大;与生远志相比,蜜远志中总皂苷量几乎不变,甘草制远志则有所上升;糖酯类化合物3, 6′-二芥子酰基糖酯在甘草制远志中其量降低,蜜远志中最低,同时部分次级代谢产物的量也有所不同。结论 从代谢组学整体角度来看,生远志及其蜜制、甘草制品化学成分差异明显,说明炮制可改变药性,导致其功效可能各有不同。     

健脾清化方对阿霉素肾病大鼠免疫炎症损伤的作用机制

目的 从细胞免疫介导的炎症损伤角度,探讨健脾清化方对阿霉素致局灶节段硬化（focal segmental glomurular sclerosis,FSGS）模型大鼠FSGS的影响。方法 左侧肾切除加尾静脉注射阿霉素致大鼠肾脏FSGS,观察健脾清化方对模型大鼠脾淋巴细胞CD4+/CD8+比值,肾小管间质纤维连接蛋白（FN）mRNA、Ⅲ型胶原（Col Ⅲ）mRNA、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL）6表达的影响。结果 健脾清化方能明显降低模型鼠脾淋巴细胞CD4+/CD8+比值,肾小管间质FN mRNA、Col Ⅲ mRNA、TNF-α、IL6水平。结论 健脾清化方对阿霉素肾病模型大鼠肾脏FSGS有一定的改善作用,该机制可能与健脾清化方抑制细胞免疫介导的炎症损伤有关。     

蒙药草乌芽中药效组分的电喷雾串联质谱分析

目的 分析蒙药草乌芽的药效组分。方法 利用电喷雾串联质谱技术对蒙药草乌芽的乙醇提取液进行了直接分析鉴定。结果 ESI-MS可以给出相对分子质量信息,ESI-MSⁿ方法则可以从复杂体系中获得结构信息,在草乌芽中发现乌头碱、中乌头碱、次乌头碱及它们的水解产物和脂类生物碱等15种二萜类生物碱。结论 草乌芽中的药效组分二萜类生物碱为首次报道,这些生物碱的结构相似,在电喷雾串联质谱中碎裂方式相同,因此根据电喷雾串联质谱结果确定了这些生物碱的结构。