RNA干扰抑制Snail表达对A549细胞上皮-间充质转分化及体外侵袭的影响

目的:研究用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术抑制转录因子Snail表达后,对人肺腺癌A549细胞上皮-间充质转分化表型和体外侵袭能力的影响.方法:构建能表达针对Snail的小干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA)的RNA干扰载体(Snail siRNA vector)和表达不针对任何已知mRNA的siRNA的阴性对照RNA干扰载体(control siRNA vector),分别转染A549细胞,新霉素抗性筛选得到Snail表达受抑制的A549-siSnail细胞和Snail表达未受影响的A549-siControl细胞.针对非转染(A549-nontransfection)、A549-siSnail、A549-siControl三组细胞,分别采用RT-PCR和Western blot技术检测Snail、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和E-钙粘素表达,用Boyden chamber模型检测细胞侵袭能力.结果: A549-nontransfection组:Snail和α-SMA表达强阳性,E-钙粘素表达弱阳性；A549-siSnail组:和A549-nontransfection组相比,Snail和α-SMA表达显著减弱(P<0.01),E-钙粘素表达显著增强(P<0.01),Boyden chamber穿膜细胞数显著减少(P<0.01)；A549-siControl组:Snail、α-SMA和E-钙粘素表达,及Boyden chamber穿膜细胞数和A549-nontransfection组无显著差异(P>0.05).结论: 通过RNA干扰阻滞Snail表达能有效地抑制A549细胞上皮-间充质转分化及体外侵袭能力.Snail可能在肺腺癌上皮-间充质转分化及侵袭过程中扮演重要角色,抑制Snail表达可能成肺腺癌治疗的可行策略.     

缺氧/放射活化Epo/e9增强子调控layilinsiRNA表达以抑制人肺腺癌A549细胞侵袭的研究

背景与目的:Layilin是一种新发现与肺腺癌侵袭转移有密切联系的特异性透明质酸受体.本研究旨在观察缺氧/放射条件下活化缺氧/放射双敏感性增强子(Epo/e9),调控针对layilin的小干扰RNA (small interfering RNA,siRNA)表达,探讨其对人肺腺痛A549细胞受透明质酸诱导侵袭的影响.方法:构建携带Epo/e9增强子和U6启动子且表达针对layilin的siRNA的RNA干扰载体(Epo/e9-siLay plasmid)和阴性对照RNA干扰载体(Epo/e9-siCtrl plasmid),分别转染A549细胞,新霉素抗性筛选得到layilin表达受抑制的A549Epo/e9-siLay细胞和layilin表达未受影响的A549Epo/e9-siCtrl细胞.针对非转染A549(A549untransfected)、A549EPo/e9-SiLay、A549Epo/e9-siCtrl三组细胞,在缺氧/放射处理下,分别采用RT-PCR和Western blot检测layilin mRNA和蛋白表达,用Transwell模型检测细胞侵袭能力.结果:与A549untransfected组相比,A549Epo/e9-siLay组layilin表达显著减弱(P＜0.01),Transwell穿膜细胞数显著减少(P＜0.01);A549Epo/e9-siCtrl组layilin表达、Transwell穿膜细胞数皆和A549untransfected组无显著差异(P＞0.05).缺氧/放射处理能进一步增加RNA干扰的上述效应(P＜0.01).结论:在缺氧/放射条件下,Epo/e9增强子调控layilin siRNA表达能明显抑制A549细胞侵袭行为.     

针对layilin的shRNA抑制透明质酸诱导人肺腺癌A549细胞体外黏附和侵袭

背景与目的 透明质酸参与了多种肿瘤细胞黏附侵袭行为。layilin是一种新发现的与细胞骨架有密切联系的透明质酸受体。本研究的目的是观察针对layilin的短发夹RNA（shorthairpinRNA，shRNA）对体外培养的人肺腺癌A549细胞layilin表达及受透明质酸诱导黏附侵袭行为的影响。方法 设计和构建带有U6启动子的能产生针对layilin的shRNA的RNA干扰质粒，转染至A549细胞，以RT—PCR、Westernblot和免疫荧光检测A549细胞转染前后layilin表达，以平板黏附模型和Boyden小室模型检测A549细胞转染前后黏附和侵袭能力。结果和转染前相比，转染了RNA干扰表达质粒的A549细胞layilin表达明显减少（P〈0．01），而且受透明质酸诱导而黏附于平板和穿过Boyden小室隔膜的A549细胞数皆明显减少（P〈0．01）。结论 针对layilin的shRNA能明显抑制透明质酸诱导的人肺腺癌A549细胞体外黏附和侵袭能力。     

针对CD44V3的短发夹RNA抑制肺癌A549细胞体外增殖

目的：研究针对CD44V3的短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）对体外培养的人肺腺癌A549细胞CD44V3表达及增殖能力的影响。方法：设计和构建带有U6启动子的、能产生针对CD44V3的shRNA的RNA干扰表达质粒，转染至A549细胞，以RT—PCR和Western blot检测A549细胞转染前后CD44V3表达，以MTT实验和软球脂细胞集落形成实验比较A549细胞转染前后增殖能力。结果：和转染前相比，转染了RNA干扰表达质粒的A549细胞CD44V3 mRNA和蛋白表达、以及增殖能力皆明显降低。结论：针对CD44V3的短发夹RNA能明显抑制人肺腺癌A549细胞体外增殖能力。     

CD44v3在透明质酸诱导人肺腺癌A549细胞体外粘附和侵袭中的作用

目的:研究CD44v3在透明质酸诱导A549细胞体外粘附和侵袭中的作用。方法:设计和构建能产生针对CD44v3的短发夹RNA(shorthairpinRNA,shRNA)的RNA干扰质粒,转染A549细胞,以RT-PCR和Westernblot检测A549细胞转染前后CD44v3表达,以平板粘附模型和波登氏小室模型检测A549细胞转染前后粘附和侵袭能力。结果:和转染前相比,转染了RNA干扰质粒的A549细胞CD44v3mRNA和蛋白表达以及受透明质酸诱导而粘附于平板和穿过波登氏小室隔膜的细胞数皆明显减少(P<0.01)。结论:CD44v3介导了透明质酸诱导人肺腺癌A549细胞体外粘附和侵袭行为。     

HuR siRNA对肺腺癌A549 细胞增殖、迁移及侵袭的影响

目的：探讨HuR siRNA 对人肺腺癌A549 株细胞增殖、迁移及侵袭的影响及其可能机制。方法：HuR siRNA 瞬时转染肺腺癌A549 细胞24 h 后,CCK-8 实验、集落形成实验检测细胞的增殖能力,划痕实验检测细胞迁移能力,Transwell 实验检测细胞侵袭能力,qPCR和Western blotting 检测HuR及基质金属蛋白酶（MMP）-9 基因mRNA和蛋白质表达。结果：HuR siRNA能够抑制人肺腺癌A549 细胞的增殖、迁移及侵袭;HuR siRNA 显著降低A549 细胞HuR、MMP-9 mRNA和蛋白表达（P＜0.01）。结论：下调HuR能抑制肺腺癌A549细胞增殖、迁移及侵袭,其机制与下调MMP-9 有关。     

Layilin的RNAi对透明质酸诱导人肺腺癌A549细胞体外增殖的影响

目的：研究RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术抑制透明质酸受体layilin表达,对透明质酸(hyaluronan,HA)诱导人肺腺癌A549细胞体外增殖的影响。方法：构建能表达针对layilin的短发夹RNA(shRNA)的阳性RNA干扰(posi- tive RNAi,Pi)质粒和表达不针对任何已知mRNA的shRNA的阴性RNAi(negative RNAi,Ni)质粒,分别转染至A549细胞,以RT-PCR和Western blot检测A549细胞转染前后layilin表达,并用新霉素抗性筛选得到layilin表达受抑制的阳性RNAi(Pi)细胞和layilin表达未受影响的阴性RNAi(Ni)细胞。分别在存在或不存在外源性透明质酸的培养条件下,以MTT实验和软琼脂细胞集落形成实验比较正常(control,C)、Pi、Ni组细胞体外增殖能力。结果：在不存在外源性透明质酸的培养条件下,C、Pi、Ni组A549细胞体外增殖能力无显著差异(P＞0．05),在存在外源性透明质酸的培养条件下,Pi和C组相比,体外增殖能力显著降低(P＜0．01),Ni和C组相比,体外增殖能力无显著差异(P＞0．05)。结论：抑制layilin表达能抑制透明质酸诱导人肺腺癌A549细胞体外增殖。     

靶向 siRNA 沉默 NF -κB/p65对肺腺癌细胞株 A549增殖与凋亡的影响

目的：研究运用 RNA 干扰（RNA interference,RNAi）技术抑制 NF -κB/ p65基因的表达对人肺腺癌细胞株 A5492细胞增殖、周期及凋亡的影响,探讨 NF -κB/ p65基因在肺腺癌发生发展中的作用。方法：利用阳离子脂质体 LipofectamineTM2000将人 NF -κB/ p65的小干扰 RNA 转染入肺腺癌细胞株 A549中。运用 real time - PCR 和 Western blot 技术检测 A549细胞内 NF -κB/ p65、增殖相关基因 Cyclin D1和凋亡相关基因 Bcl-2、Bax 的 mRNA 的转录水平和蛋白的表达情况,MTT 法检测细胞的增殖活力,显微镜下观察细胞的生长情况。结果：NF -κB/ p65 siRNA 能有效地抑制 A549细胞中 NF -κB / p65基因在 mRNA 水平上的表达（P﹤0.001）,同时下调 Cyclin D1和 Bcl -2的表达（均 P ﹤0.01）。上调 Bax 表达（P ﹤0.001）;蛋白表达也具同样趋势。MTT 实验证明 p65 siRNA 转染组中细胞增殖减慢;显微镜镜下观察显示,细胞生长减慢,凋亡形态改变明显。结论：体外实验初步证明 NF -κB/ p65基因在肺腺癌细胞株 A549增殖分化与凋亡方面扮演重要角色,通过沉默其表达可抑制肺腺癌细胞株 A549增殖并诱导其凋亡。进一步证实 NF -κB/ p65对 Cyclin D1、Bcl -2、Bax 具有调控作用,他们共同参与了肺腺癌的发生发展过程。     

circTADA2A在肺腺癌组织和细胞中的表达及其对A549细胞迁移及侵袭影响的实验研究

目的:研究环状RNA TADA2A（circular RNA TADA2A，circTADA2A）在肺腺癌（lung adenocarcinoma，LAD）组织和细胞中的表达及其对A549细胞迁移及侵袭的影响。方法:在Gene Expression Omnibus（GEO）数据库中下载非编码RNA阵列分析文件GSE101586，并通过在线分析软件GEO2R分析GSE101586中5例肺腺癌及配对的癌旁组织中差异表达的环状RNA（circular RNAs，circRNAs）；筛选差异表达的circRNAs并绘制热图；检测circTADA2A在GSE101586的5例肺腺癌及配对的癌旁组织中的差异性表达；qRT-PCR法检测circTADA2A在非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）细胞系A549及人支气管上皮细胞系16HBE中的差异表达；在A549细胞中转染特异性circTADA2A干扰寡核苷酸（circTADA2A small interfering RNA,sicircTADA2A），同步转染错义对照寡核苷酸（small interfering scramble，siSCR），qRT-PCR法检测circTADA2A的差异表达；Transwell迁移及侵袭实验检测不同circTADA2A表达水平对A549细胞迁移及侵袭能力的影响。结果:在GSE101586中，相比于癌旁组织，在肺腺癌组织中差异表达显著的circRNAs有39个（筛选标准:P<0.05且|logFC|≥1.2），其中上调的circRNAs有22个，下调的circRNAs有17个；相比于癌旁组织，circTADA2A在肺腺癌组织中表达升高；相比于16HBE细胞，circTADA2A在A549细胞中表达升高；转染sicircTADA2A可明显敲低A549细胞内circTADA2A的表达水平；下调circTADA2A的表达水平可明显抑制A549细胞的迁移及侵袭能力。结论:circTADA2A在肺腺癌组织和细胞中表达增高，下调其表达可明显抑制A549细胞的迁移及侵袭能力。     

慢病毒介导的稳定沉默nm23-H1基因的肺癌细胞株的建立及生物学行为改变

背景与目的 nm23-H1基因是重要的肿瘤转移抑制基因。前期研究发现利用化学合成的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)抑制nm23-H1基因的表达可明显增强肺癌细胞的侵袭力。为了进一步研究nm23-H1基因沉默后的分子生物学机制,本研究利用慢病毒介导的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)建立nm23-H1基因稳定沉默的肺癌细胞株。方法将表达特异性抑制nm23-H1基因shRNA的慢病毒转染人大细胞肺癌细胞株NL9980和肺腺癌细胞株A549,通过嘌呤霉素筛选出稳定转染细胞株。逆转录PCR、定量PCR及Western blot法检测nm23-H1基因表达,并通过shRNA抵抗的nm23-H1基因重组质粒转染拯救实验验证,侵袭小室实验检测侵袭力改变。结果逆转录PCR、定量PCR和Western blot法检测稳定转染细胞株NL9980-99和A549-99中nm23-H1基因在mRNA和蛋白水平表达均明显降低;shRNA抵抗的nm23-H1基因重组质粒转染拯救实验重现nm23-H1的正常表达;侵袭小室实验显示NL9980-99和A549-99细胞侵袭力明显增强。结论成功建立nm23-H1基因稳定沉默的人大细胞肺癌细胞株NL9980-99和人肺腺癌细胞株A549-99,nm23-H1基因沉默后使NL9980-99和A549-99细胞的侵袭力明显增强。     

Inhibitory Effects of Syk Transfection on Lung Cancer Cell Invasion

Objective: Spleen tyrosine kinase (Syk) is closely related to tumor invasion and metastasis, and has been shownto have potential inhibitory effects in tumors. In this study, we constructed a eukaryotic expression vector forSyk and analyzed its effects on invasive ability of the A549 non-small cell lung cancer cell line in vitro. Methods:A fragment of Syk was obtained by RT-PCR from human lung cancer cells and cloned into the expression vectorpLNCXSyk. After restriction endonuclease digestion, PCR and DNA sequencing confirmation, the recombinantSyk expression plasmid was transfected into A549 human lung cancer cells using lipofectamine protocols. Afterselection, the cells stably expressed Syk. Detection of Syk expression of the cells by RT-PCR, and invasive abilitywere examined. Results: The eukaryotic expression plamid pLNCXSyk was constructed and expressed stablyin the A549 human lung cancer cells. The RT-PCR results showed that Syk mRNA expression was upregulatedsignificantly (P<0.05). Lower invasion through a basal membrane were apparent after transfection (P<0.05).Conclusions: A eukaryotic expression plasmid to cause Syk expression in lung cancer cells can obviously inhibittheir invasive ability in vitro.     

非小细胞肺癌患者血清MMP-9表达及siRNA靶向抑制A549细胞侵袭与转移的研究

目的:探讨非小细胞肺癌患者血清中MMP-9表达与肿瘤转移的关系;MMP-9siRNA对肺腺癌细胞系A549中MMP-9表达及细胞侵袭与转移抑制作用的影响。方法:ELISA法检测32例非小细胞肺癌(NSCLC)患者及20名健康者空腹血清MMP-9浓度,同时设计合成针对MMP-9的特异性siRNA,采用oligofectamine转染A549细胞,RT-PCR法检测转染细胞后MMP-9mRNA的表达,Transwell实验检测细胞侵袭情况。结果:NSCLC患者血清中MMP-9浓度〔(63.44±7.84)ng/mL〕比正常对照组〔(21.57±3.29)ng/mL〕明显升高(P<0.01),且浓度随病理分期增加而增强〔Ⅰ/Ⅱ:(45.40±5.30)ng/mL,Ⅲ/Ⅳ:(89.80±5.02)ng/mL,P<0.01〕,发生淋巴结转移的患者血清MMP-9浓度〔(82.26±5.09)ng/mL〕明显高于未发生淋巴结转移〔(35.92±4.68)ng/mL〕的患者P<0.01;RT-PCR法显示,转染MMP-9siRNA后,细胞中MMP-9mRNA表达较阴性对照组和空白组明显降低,P<0.05。RNA干扰MMP-9基因后A549细胞的侵袭能力也有明显下降,P<0.01。结论:MMP-9可作为NSCLC患者有无发生浸润转移的良好预测指标,靶向MMP-9的siRNA不仅能特异性的降低MMP-9mRNA及蛋白的表达,且能抑制人A549细胞的侵袭和迁移。     

大肿瘤抑制激酶2在非小细胞肺癌中的表达及临床意义

目的:检测大肿瘤抑制激酶2（large tumor suppressor kinase 2，LATS2)在非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC)组织和细胞中的表达水平，对NSCLC细胞增殖、侵袭和患者临床特征的影响。方法:收集2017年6月-2019年6月在我院接受手术治疗的NSCLC患者260例，免疫组化实验检测NSCLC和癌旁组织中LATS2的表达水平；卡方检验分析LATS2的表达与患者临床特征的关系；qRT-PCR检测NSCLC组织和癌旁组织中LATS2 mRNA的相对表达水平；转染实验将LATS2质粒转染至A549细胞中；MTT实验检测LATS2对A549细胞增殖的影响；Transwell实验检测LATS2对A549细胞侵袭的影响。结果:LATS2在癌组织中的表达低于癌旁组织；LATS2的高表达率为72.3%（188/260），低表达率为27.7%（72/260）；LATS2高表达组与低表达组患者在性别、肿瘤类型、胸膜侵犯、血管侵犯、淋巴管侵犯和T分期之间无统计学差异，在年龄、肿瘤直径、淋巴转移和病理分级之间有统计学差异（P＜0.05）；NSCLC组织和细胞中LATS2 mRNA的相对表达水平显著低于癌旁组织和人正常肺上皮细胞HPAEpiC；LATS2质粒转染至A549细胞中使其表达水平升高，LATS2高表达组细胞的OD值和发生侵袭的细胞数显著降低。结论:LATS2与患者的年龄、肿瘤直径、淋巴结转移和病理分级有关，其表达水平增加后可显著抑制NSCLC细胞的增殖和侵袭，有可能成为NSCLC治疗的新作用靶点。     

TOB1高表达抑制肺癌A549细胞体外迁移和侵袭

目的:探讨TOB1 (transducer of ErbB 2,1)高表达对人肺癌A549细胞体外迁移和侵袭的影响.方法:应用RT-PCR法检测人支气管上皮细胞HBE和10种肺癌细胞中TOB1、PTEN (phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten)、乳腺癌转移抑制基因1(breast cancer metastasis suppressor 1,BRMS1)、RHOC(ras homolog gene family,member C)和NME1 (non-metastatic cells 1)mRNA的表达水平;将重组表达载体质粒pcDNA3.0-TOB1和“空载体”质粒pcDNA3.0转染到A549细胞中,建立TOB1高表达的A549/TOB1细胞和对照组A549/PC3细胞,应用体外划痕和Transwell实验检测细胞的体外迁移和侵袭能力,RT-PCR法检测细胞中PTEN、BRMS1、RHOC和NME1 mRNA的表达,蛋白质印迹法检测细胞中α-N-catenin、β-catenin、γ-catenin、基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2,MMP2)和MMP9蛋白的表达.结果:10种肺癌细胞中TOB1 mRNA的表达水平明显低于HBE细胞(P＜0.05),不同细胞株中TOB1 mRNA与PTEN、BRMS1和NME1 mRNA的表达水平间呈正相关(P＜0.05).A549/TOB1细胞的体外迁移和侵袭能力明显低于A549细胞(P＜0.05).A549/TOB1细胞中PTEN、BRMS1和NME1 mRNA的表达水平明显高于A549细胞(P＜0.05),而RHOC mRNA的表达水平明显低于A549细胞(P＜0.05); A549/TOB1细胞中α-N-catenin、β-catenin、γ-catenin、MMP2和MMP9蛋白的表达水平明显低于A549细胞(P＜0.05).结论:外源性TOB1高表达可以明显抑制肺癌A549细胞的体外转移和侵袭,其机制可能与TOB1调控PTEN、BRMS1、RHOC和NME1的表达,进一步下调α-N-catenin、β-catenin、γ-catenin、MMP2和MMP9蛋白的表达水平有关.     

FasL基因siRNA表达载体的构建及其在肺癌A549细胞中的表达

背景与目的Fas/FasL是肿瘤坏死因子超家族成员,与肿瘤细胞的凋亡有关。激活的淋巴细胞由于FasL表达上调对于Fas/FasL凋亡途径非常敏感,从而可能被肿瘤细胞反杀伤攻击,使激活的淋巴细胞被清除掉。为研究FasL基因的功能及肺癌的基因治疗,构建了针对FasL基因的siRNA的表达载体,观察转染细胞A549后其对激活的T淋巴细胞的反杀伤作用。方法利用网站选择适当位点设计并合成针对FasL基因mRNA的寡核苷酸序列,插入质粒pGCsi-U6中形成重组载体pSi-FasL。重组载体经测序鉴定后转染肺癌细胞A549,Western blot检测转染前后FasL蛋白的表达情况。结果测序结果与所合成的寡核苷酸完全一致,证实成功构建了针对FasL基因的siRNA表达载体。Western blot检测显示转染肺癌细胞A549后有效抑制了FasL基因的表达。结论针对FasL基因的siRNA表达载体成功构建,并能有效的抑制肺癌细胞A549中FasL基因的表达。     

RNAi抑制肾癌细胞MDR1基因表达及对顺铂化疗耐药的逆转

目的:研究RNA干扰(RNA interference,RNAi)对肾癌细胞多药耐药基因1(multidrug resistance,MDR1)表达的抑制作用,并分析干扰前后肾癌细胞对顺铂(cisplatin)敏感度的变化.方法:根据MDR1基因序列设计3条小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),转染肾癌A498细胞;RT-PCR法检测转染前后MDR1 mRNA表达水平的变化,筛选出干扰效率最高的siRNA序列;进而利用慢病毒包装siRNA重组质粒,感染A498细胞,RT-PCR法筛选沉默效果最好的细胞株进行克隆;Western印迹法检测MDR1蛋白表达水平;MTT法检测干扰前后顺铂对半数细胞抑制浓度(half inhibitory concentration,IC_(50))的变化.结果:3条siRNA序列均能不同程度地抑制细胞MDR1基因的表达,其中siRNA-1序列能更有效地封闭MDR1基因,使MDR1 mRNA表达水平下降67%;筛选得到稳定转染的细胞株与未干扰细胞株相比,MDR1蛋白表达量明显下降(P<0.01),并使顺铂对细胞的IC_(50)值降低约83.37%(P<0.01).结论:RNAi能有效抑制肾癌A498细胞MDR1基因的表达,并可显著增加其对顺铂的敏感度,从而使肾癌细胞化疗耐药逆转成为可能.