骨髓间充质干细胞生物特性及其构造组织工程软骨研究进展

干细胞是一种具有多分化潜能和自我复制功能的早期未分化细胞，它能在人体内分化成任何细胞类型。具有高度的自我更新能力和多向分化潜能，已成为组织工程中首选的种子细胞。早在1867年，德国病理学家Cohnheim通过实验推测骨髓内存在有非造血功能的干细胞，但直到20世纪60年代末才有了直接的证据。Friedenstein等将整个骨髓标本放于塑料培养瓶上，4h后倒掉非贴壁细胞，剩下少量贴壁的细胞外观多呈纺锤形。     

定向诱导骨髓间充质干细胞-藻酸盐复合物构建软骨组织

目的研究骨髓间充质干细胞(M SC s)经向软骨细胞定向诱导后,与藻酸盐复合,构建组织工程软骨的可能性。方法取大鼠股骨骨髓,经梯度离心法和贴壁法分离M SC s,经鉴定后用含转化生长因子1β10 ng/m l、地塞米松1-0 7m o l/L、转铁蛋白3 m g/m l、胰岛素2 m g/m l的诱导因子培养基对M SC s进行诱导,14 d后免疫组化检测Ⅱ型胶原分泌情况,将诱导后和未经诱导的M SC s以1×106/m l细胞密度与藻酸钙复合接种于裸鼠,分别于4周、8周后行组织学检测。结果经诱导的M SC sⅡ型胶原免疫组化阳性,与藻酸盐复合4周,HE染色可见软骨样细胞、软骨陷窝形成,阿辛蓝染色和M asson染色可见新生的软骨细胞和细胞外胶原,8周后软骨细胞明显增多,软骨细胞分泌胶原丰富,而未经诱导的M SC s无明显软骨细胞生成。结论M SC s经定向诱导后,可与藻酸钙复合在体内形成软骨样组织,可能发展为临床修补软骨缺损的一条有效途径。     

骨髓间充质干细胞研究进展及在软骨组织工程中的应用

130年前．德国病理学家Cohnhein在研究创口愈合过程中首次提出骨髓中存在充质干细胞（BMSCs）的观点。近年发现，BMSCs具有向多种细胞系转化的潜能，自体获取的骨髓MSCs回输后不会发生免疫排斥反应．体外基因转染率高，因此BM—SCs已成为组织工程、细胞治疗、基因治疗等方面的研究热点。随着组织干细胞研究的兴起．特别是对组织干细胞可甥性的深入研究使得间充质干细胞的发育潜能。体外诱导分化、分离、筛选方法等的研究有了突破性进展。同时由于间充质干细胞在体内分布广泛，易于获得。并能在体外大量扩增。因此成为一种特别的组织细胞越来越引起人们的关注。     

体外构建可注射性组织工程软骨的初步研究

目的利用关节软骨细胞复合壳聚糖-磷酸甘油(chitosan/glycerophosphate, C/GP)凝胶,体外构建可注射性组织工程软骨,为微创方式治疗关节软骨缺损提供依据.方法以体外培养扩增的兔关节软骨细胞为种子细胞,以自制温固化可注射C/GP凝胶为支架,按5×107/ml细胞浓度复合体外培养.于倒置显微镜下观察细胞形态与分布,四甲基偶氮唑盐(MTT)法计算培养1周时种子细胞存活率,培养4周时样本进行组织学及扫描电镜观察.结果软骨细胞在7:1(体积分数)C/GP凝胶中保持球形,细胞存活率95%以上;HE染色可见软骨较为典型的陷窝样结构、软骨囊及同源细胞群等现象;甲苯胺蓝异染及免疫组化Ⅱ型胶原染色呈强阳性.结论软骨细胞在C/GP凝胶中可存活并保持分泌软骨基质的功能,形成类软骨组织.温固化可注射性C/GP凝胶能作为软骨组织工程的载体材料.     

骨髓间充质干细胞的生物学特性及在骨软骨组织工程中的作用

骨髓间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells MSCs)是一类具有自我更新与多向分化能力的成体干细胞，存在于骨髓基质系统中，因其能分化为骨、软骨、脂肪、纤维组织祖细胞和骨髓支持基质等多种间充质组织而得名。MSCs在正常情况下大多处于休眠状态，在病理状态或外因诱导下可以表现出不同程度的再生和更新能力。正常情况下，MSCs可以分化为与其组织来源一致的细胞，但有时也不遵守该规律，表现出横向分化能力。MSCs在体外培养亦表现出多向分化潜能，在不同的诱导条件下可以向成骨、成软骨、成肌肉、成脂肪、分化及中胚层以外的细胞，如神经元等。     

人脐带间充质干细胞在软骨组织工程中的应用

目的人脐带间充质干细胞是一成体干细胞,其具有自我更新及多向分化潜能的特点,而且对供者没有影响,所以具有丰富的来源。它还具有以下优点,如采集和运输方便,无异体排斥反应,无伦理争议等,在体外可成功诱导分化成软骨细胞,是软骨组织工程中理想的种子细胞。     

人骨髓间充质干细胞体外成软骨诱导研究

目的:研究人骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)在体外培养过程中的增殖和成软骨分化现象和规律。方法:以密度梯度离心法分离健康成人髂骨MSCs,观察体外培养过程中细胞形态、生长和增殖现象。取第三代细胞给予地塞米松,维生素C和不同剂量转化生长因子β1(transforming growth factorβ1,TGF-β1)行成软骨细胞诱导。3周后行阿利新蓝及甲苯胺蓝染色蛋白多糖,免疫荧光检测II型胶原,阿利新蓝比色法检测葡萄糖氨基聚糖。结果:体外培养条件下MSCs生长旺盛。在TGF-β1作用下MSCs向软骨骨细胞分化,TGF-β110μg/L组软骨细胞标志物表达最强。结论:MSCs有旺盛的增殖能力。MSCs在一定诱导条件下可以向软骨细胞分化,转化生长因子β1(TGF-β1)是诱导MSCs向软骨分化的关键性因素,10μg/L是其最佳诱导剂量。     

骨髓间充质干细胞的成软骨分化机制及其临床应用

骨髓间充质干细胞具有向软骨分化的能力,并且来源方便、没有免疫排斥等优点,已作为新型种子细胞倍受关注。同时,利用该干细胞进行软骨再造也是近年来软骨组织工程主要的发展方向之一。现将近年来该干细胞向软骨的分化机制及临床应用的研究进展作一综述。     

壳聚糖/亚磷酸壳聚糖海绵复合人脐带间充质干细胞构建组织工程骨修复骨缺损的实验研究

目的:探索壳聚糖/亚磷酸壳聚糖海绵复合人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,HUMSCs)构建的组织工程骨植入动物骨缺损处的成骨能力?方法:体外构建组织工程骨;健康新西兰大白兔构造骨缺损模型兔后随机分为3组,即A:组织工程骨植入组;B:支架材料植入组;C:空白对照组,于术后4?8?12 周取骨缺损标本,进行大体标本?影像学?组织学观察成骨情况?结果:术后12周,3种检测手段均发现A组新生骨已经完全将骨缺损填充,并有部分皮质骨将骨缺损两端连接?B组虽有部分骨痂形成,但无连续骨质?C组术后仅有少量骨痂形成?A组成骨能力明显强于B?C组?结论:本实验构建的组织工程骨能修复大段的骨缺损,具有良好的成骨能力,可以作为骨移植的替代材料?     

骨髓间充质干细胞在软骨组织工程的应用

骨髓间充质干细胞具有优良的增殖特性和多向分化潜能,同时它对体外培养条件特别敏感,多种生长因子可以调节其向软骨细胞的分化,而生物材料作为细胞外基质的组成成份之一,在软组织工程介导细胞间信号传导和细胞间相互作用方面起着重要作用.软骨组织损伤后修复能力有限,以骨髓间充质干细胞为种子细胞的软骨组织工程为软骨组织缺损的修复带来希望.本文就骨髓间充质干细胞在软骨组织工程中的应用做一综述.     

骨髓间充质干细胞-支架复合体向软骨诱导分化的实验研究

目的:以骨髓间充质干细胞作为种子细胞,探索组织工程化软骨的构建.方法:分离、获取、扩增骨髓间充质干细胞,通过将扩增的骨髓间充质干细胞接种于聚羟基乙酸(PGA)上,在成软骨诱导因子作用下在体外诱导培养3周后,将实验组和对照组的标本转植入自体兔腹腔内,进行体内培养6～12周后,再进行检测,评估工程化软骨的形成.结果:骨髓间充质干细胞接种于PGA支架上后,经过体外诱导培养和体内培养后,获得标本(7/10)出现软骨组织外观,进行组织学切片可见软骨陷窝,进行Ⅱ型胶原蛋白的免疫组化、Ⅱ型胶原mRNA原位杂交均为阳性.结论:兔骨髓间充质干细胞在成软骨诱导剂作用下,经体外和体内培养后,可生成组织工程化类软骨.     

BrdU标记胎兔骨髓间充质干细胞及对细胞生物学行为影响的体外研究

目的:通过用5-溴脱氧尿苷(5- bromodeoxyuridine,BrdU)标记胎兔骨髓间充质干细胞(bone marrow rnesenchymal stem cells,BMSCs),探讨BrdU作为干细胞标记示踪方法的可行性.方法:取胎兔骨髓组织密度梯度离心法分离培养BMSCs.取P3代细胞以终浓度分别为5,...     

大鼠骨髓间充质干细胞的培养及其向神经元样细胞诱导分化的实验研究

目的：探讨在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的方法。方法：分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞并用β-巯基乙醇诱导分化为神经元样细胞,使用免疫组化方法鉴定其神经元特异性巢蛋白（nestin）的表达,同时应用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL法）对神经元样细胞的凋亡情况进行定性检测。结果：β-巯基乙醇诱导后MSCs分化为具有典型的神经元形态的细胞,免疫组化实验显示Nestin呈强阳性反应,表明MSCs在体外诱导分化为神经元样细胞。但该细胞在诱导5小时后开始死亡,形态学观察和TUNEL法均确定该死亡为细胞调亡,提示MSCs诱导为神经元样细胞后出现凋亡现象。结论：大鼠MSCs在体外可定向诱导分化为神经元样细胞,其随后发生的细胞死亡属细胞凋亡。     

嗅鞘细胞和骨髓基质细胞的联合培养研究

目的探讨体外联合培养嗅鞘细胞(OECs)和骨髓基质细胞(BMSCs)的可行性及形态学观察。方法将原代培养的OECs和BMSCs消化制成细胞悬液,以相同比例接种,接种密度为104/ml。10 d后将联合培养的细胞置于倒置相差显微镜下进行形态学观察,并于鉴定前2 d加入细胞掺入剂BrdU,应用P75抗体和BrdU抗体对联合培养的细胞进行免疫荧光鉴定。结果联合培养的细胞在24 h内均完全贴壁,培养5 d后镜下可见细胞形态主要有3种:①双极、三极或多极形;②短梭形,突起较短;③扁圆形或不规则形。到第10天时部分细胞相互编织成网,部分细胞生长呈条索状,相互平行。荧光鉴定显示:荧光双标阳性者(既发红色荧光又发绿色荧光)为OECs,只发红色荧光而不发绿色荧光者为BMSCs。结论OECs与BMSCs在体外可以很好的联合培养,生物学特性均保持不变,为体内联合移植奠定了基础。     

骨髓间充质干细胞体外诱导为神经元及其死亡现象的研究

目的:探索大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSCs)在体外定向分化为神经元样细胞的方法并研究其死亡的影响因素.方法:分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞并用2-巯基乙醇诱导分化为神经元样细胞,使用免疫组化方法鉴定其神经元特异性巢蛋白(Nestin)的表达,通过MTT、免疫组化及形态学方法观察丝裂原活化蛋白激酶激酶1/2(mitogen-activated protein kinase kinase 1/2,MEK1/2)阻断剂U0126及缩胆囊肽(cholecystokinin,CCK)对细胞转化及活性的影响.结果:诱导后MSCs分化为具有典型的神经元形态的细胞,免疫组化实验显示Nestin呈强阳性反应,同时免疫组化及MTT方法显示U0126可以显著提高细胞Nestin的表达强度和神经元样细胞的活性,CCK虽可轻度增强神经元样细胞的活性,且CCK可延长已分化神经元的存活时间,但其作用不具统计学意义.结论:大鼠MSCs在体外可定向诱导分化为神经元样细胞,且通过阻断MEK1/2信号通路可以提高其阳性分化率和细胞活性,提示大鼠MSCs诱导分化的神经元样细胞的死亡机制可能涉及MEK1/2信号通路.CCK可能具有对已分化神经元的保护作用.     

骨髓间充质干细胞在心肌梗死中的研究进展

冠心病心肌梗死(M I)在我国发病率正逐年提高,而传统的以药物、介入、手术为主的治疗手段只能改善心脏的血液供应,对坏死心肌无再生修复功能。骨髓间充质干细胞作为一种多功能干细胞,经动物实验证实其可分化为心肌细胞,并经临床实验显示具有改善梗死后心功能,减小瘢痕面积的作用。     

成人脂肪源间充质干细胞培养上清对人脐血间充质干细胞体外培养及扩增的支持作用

目的：研究人脂肪间充质干细胞培养上清对人脐带血（HUCB）中所含有间充质干细胞（MSCs）的影响。方法：取脐带血,肝素抗凝,Percoll淋巴细胞分离液分离出单个核细胞,低糖DMEM培养获得贴壁细胞层。与人脂肪源间充质干细胞培养上清共孵育。流式细胞仪检测表面抗原。结果：脐带血的单个核细胞与人脂肪源间充质干细胞培养上清共孵育经体外培养贴壁后出现形似纤维状细胞形态并表达与MSCs相关的抗原（CD13,CD44,CD71,CD166）,但不表达造血细胞抗原（CD34,CD45）,这与源于骨髓的MSCs一致。结论：人脐血间充质干细胞与脂肪源间充质干细胞培养上清共孵育,对脐血间充质干细胞体外分离培养及扩增有支持作用。     

玻璃粘连蛋白对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化影响

目的体外分离纯化培养大鼠骨髓间充质干细胞(rMSC),研究玻璃粘连蛋白(VN)在rMSC向成骨方向分化过程中的作用。方法贴壁分离培养法分离纯化rMSC,观察第1、3、5、8、10代细胞的增殖情况,并绘制出生长曲线。选第3代细胞用以VN包被的培养板培养,每4d检测碱性磷酸酶活性及钙结节的形成。结果经贴壁筛选法分离的rMSC生长曲线呈S形,第3、4、5代细胞排列具有典型的漩涡状结构;细胞表达CD44、CD90,而不表达CD34。用以VN包被的培养板培养12d,碱性磷酸酶染色呈阳性,硝酸银染色显示有钙结节形成。结论VN有诱导rMSC向成骨方向分化的作用。     

hBMP-2真核表达载体的构建及转染兔骨髓间充质干细胞的表达

目的:构建pcDNA3.1-hBMP2真核表达质粒并检测其在兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)中的表达.方法:采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从人骨肉瘤中扩增出人骨形成蛋白-2(hBMP2)基因片段,构建成pcDNA3.1-hBMP2重组质粒.转染兔骨髓间充质干细胞并通过RT-PCR和免疫组化检测其表达.结果:本实验构建的重组质粒目的基因片段为hBMP2-cDNA.经RT-PCR和免疫组化证实,转染pcDNA3.1-hBMP2后的兔骨髓间充质干细胞内有大量hBMP2 mRNA的转录和蛋白的表达.结论:本实验成功构建hBMP2真核表达质粒并在骨髓间充质干细胞中得到表达,为进一步研究用BMP2基因转染的方法来加速牵张成骨新骨形成奠定了基础.     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定

目的:培养符合实验要求的大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)并进行鉴定,为进一步的研究打基础.方法:分别采用全骨髓贴壁培养法和密度梯度离心法培养大鼠骨髓间充质干细胞,对细胞的形态及生长特性进行观察,并应用流式细胞术对细胞表面抗原CD34、CD44、CD45、CD29、CD90以及CD11b进行表型鉴定.结果:两种方法培养的细胞均为成纤维样细胞,呈集落式生长,全骨髓培养法培养的BMSCs表达CD34-(95.4%),CD44+(94.2%),CD45-(91.6%),CD29+(93.8%),CD90+(98%),CD11b-(87.6%),梯度离心法培养的BMSCs表达CD34-(96.9%),CD44+(97.3%),CD45-(97.5%),CD29+(99.4%),CD90+(99.8%),CD11b-(96%).结论:两种方法均可分离培养出较纯化的BMSCs,但全骨髓贴壁培养法简单易行,原代培养周期较短.