体外拼装凋亡素基因

目的 以凋亡素基因为例,探讨用寡核苷酸片段体外拼装基因的方法。方法 按已知的凋亡素基因序列(GeneBank登录号:AY171617),设计40bp的凋亡素基因寡核苷酸片段,并将其中的172位(BglII,agatct→agatcc)和306位碱基(HindIII,aagctt→aatcct)进行同义突变,Taq消除这两个酶切位点。在pfu酶的PCR系统中,对寡核苷酸片段进行拼装和扩增。产物稀释后进一步纯化扩增,在Tag酶存在的条件下对产物两末端加T,然后TA克隆于pGEM-Teasy载体中。阳性克隆经测序鉴定。结果 凋亡素基因寡核苷酸片段第1次PCR拼装后,产物呈拖尾状。但产物经进一步稀释,并用两未端引物进行2次扩增后,即可见明确的产物带及其他梯形带状产物。目的产物TA克隆后,筛选得到阳性克隆,其经测序鉴定,与设计的凋亡素基因序列完全一致。结论 体外基因拼装法是一种非常有效的基因克隆方法,可用于基因或载体的合成,及一次性对基因进行广泛的突变。     

凋亡素基因的原核表达构建与提纯

目的 构建凋亡素原核表达系统，制备提纯抗原物质凋亡素融合蛋白。方法 用PCR的技术。以pcDNA—VP3质粒为模板，扩增出凋亡素VP3基因。将其克隆到原核表达载体pET—DsbA的多克隆位点，构建成凋亡素的高效原核表达载体pET—DsbA-VP3，将该质粒转化到大肠杆菌EcoliBL21（DE3）plysS中，以异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（isopropylthio-β-D-galactoside，IPTG）对其进行诱导表达，固化Ni离子金属鏊合纯化带6X组氨酸标签的凋亡素融合蛋白，聚丙烯酰胺凝胶电泳分析目的蛋白。结果 转化有凋亡素基因的原核表达载体pET—DsbA—VP3的大肠杆菌E．coliBL21（DE3）plysS经IPTG诱导，固化Ni离子金属鏊合亲和层析纯化凋亡素融合蛋白，聚丙烯酰胺凝胶电泳获得分子量为38.3KD的目的蛋白条带。结论 凋亡素原核表达载体pET—DsbA—VP3能高效表达出凋亡素融合蛋白。     

重组腺病毒载体携带凋亡素基因对肝癌细胞的作用

目的 探讨带有AFP启动子的重组腺病毒载体介导凋亡素基因对肝癌细胞的作用.方法 测定腺病毒AdAFPvp3滴度,并以MOI=100感染Hepal-6肝癌细胞(AFP ),HEK293细胞(AFP-),Lewis肺癌细胞(AFP-),24 h后Hoechst 33258染色观察凋亡形态学改变,RT-PCR检测vp3基因的表达.腺病毒AdAFPvp3以MOI=100感染hepal-6肝癌细胞,FCM检测肝癌细胞不同时段凋亡率.结果 腺病毒AdAFPvp3滴度为5×10(9)PFU/ml.Hoechst 33528染色显示甲胎蛋白阳性的Hepal-6肝癌细胞出现凋亡形态学改变,RT-PCR检测只有甲胎蛋白阳性的Hepal-6肝癌细胞表达vp3mRNA.FCM表明凋亡素基因能有效诱导肝癌细胞凋亡.结论 带有特异性甲胎蛋白启动子的重组腺病毒载体.介导凋亡素基因导入肝癌细胞后,对于能合成甲胎蛋白的肝癌细胞,具有特异性靶向性致凋亡作用.     

E-选择素基因多态性与冠心病相关性研究

目的探讨E-选择素基因多态性与中国人群冠心病发病的关系.方法93例年龄≤60岁的冠心病患者和97例年龄性别匹配的非冠心病对照者,运用聚合酶链式反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)和直接测序技术对E-选择素基因全部外显子及其两翼的部分内含子进行筛查.结果发现3个E-选择素基因多态性:2号外显子5'非翻译区存在G98→T所致的G98T多态性(G/T等位基因);4号外显子EGF结构域中存在A561→C所致的Ser128Arg多态性(A/C等位基因);11号外显子膜结构域中存在一个新的A1856→G所致的A1856G多态性(A/G等位基因).在冠心病组中,T和C等位基因频率显著高于对照组(P=0.01,P=0.03).结论T和C等位基因可能是中国人群中年龄≤60岁冠心病患者的遗传危险因素.     

腺病毒载体携带凋亡素基因对人胃癌细胞的致凋亡作用

目的 探讨带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记的重组腺病毒载体介导的凋亡素(VP3)基因对人胃癌细胞的致凋亡作用.方法 在HEK293细胞中包装Ad-EGFP-VP3和Ad-EGFP两种腺病毒,大量扩增,并测定两种腺病毒滴度.以MOI=20感染人胃癌细胞,12,24,48 h后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达;用Hoechst33258试剂盒染色,观察凋亡形态学改变.24 h后用RT-PCR检测VP3基因的表达.6,12,24,48,72 h后用FCM检测胃癌细胞的凋亡率.结果 Ad-EGFP-VP3滴度为2.4×108 pfu/ml,Ad-EGFP滴度为2.1×108pfu/ml.Hoechst33528染色显示Ad-EGFP-VP3感染的胃癌细胞出现凋亡形态学改变.RT-PCR检测仅有Ad-EGFP-VP3感染的胃癌细胞表达VP3基因的mRNA.FCM检测Ad-EGFP-VP3感染人胃癌细胞12 h后凋亡率达51.7%.结论带有EGFP标记的重组腺病毒载体介导VP3基因导入胃癌细胞后,能有效诱导胃癌细胞凋亡.     

可经四环素调控表达凋亡素基因的逆转录病毒载体的构建

目的 构建可经四环素调控表达凋亡素(apoptin)基因的逆转录病毒载体。方法 双酶切真核表达质粒pCDA3-vp3，游离出凋亡素基因(vp3)片段，相继定向克隆入质粒载体pET-28a( )和pBacPAK8，使vp3片段两侧获得BamHⅠ位点，pBacPAK8-vp3经BamHⅠ酶切后，将vp3片段连入经BamHⅠ酶切后线性化的pRevTRE，得到pRevTRE-vp3，经酶切选取连接正确的重组子并测序鉴定。结果 经XhoⅠ酶切，琼脂糖凝胶电泳及vp3基因序列测定，证明vp3片段连接正确，vp3片段序列与已报道的凋亡素基因序列同源性为100％。结论 构建可经四环素调控表达凋亡素基因的逆转录病毒载体，对凋亡素作用机制的研究及将来的临床应用有较大意义。     

体外基因扩增制备艾滋病毒核酸探针

作者利用DNA合成仪合成艾滋病毒ARV—2前病毒序列6 310～6 328,6 666～6 684及HT_LV-Ⅲ前病毒序列6339～6374,6385～6419两对寡核苷酸引物,应用体外基因扩增(Polymerase chainreaction,PCR),以pARV-2/7A质粒为模板扩增出两个DNA片段。~(32)P标记后,以pCP10(含HBV基因)、M56(含出血热汉坦株M片段cDNA)、人染色体DNA乙型脑炎病毒(JEV)为对照,经Southern杂交及斑点杂交,证明PCR扩增制备HIV核酸探针特异性强、敏感性高。     

凋亡素与肿瘤

有关肿瘤发病机制的研究以前通常只关注细胞的过度增殖,近来,随着对凋亡现象的认识和深入研究,人们开始从细胞死亡的角度来分析.研究发现,调亡受到抑制后细胞表现出生长优势,这是肿瘤发生的重要因素.而诱导细胞调亡即可治疗肿瘤.因此,积极寻找开发促调亡因子有重要意义.近年研究显示,来自鸡贫血病毒(CAV)的凋亡素(apoptin),能选择性出现在肿瘤细胞和转化细胞核内,诱导其凋亡,但不杀伤正常细胞[1],它可能为肿瘤的诊治提供新的途径.     

阴道加德纳菌四环素耐药基因tetM的体外扩增及其产物的序列测定

利用聚合酶链式反应对５株耐四环素阴道加德纳菌的耐药基因ｔｅｔＭ进行体外扩增。核甙酸序列测定证实，一株耐四环素阴道加德纳菌的ｔｅｔＭ核苷酸序列与另四株ｔｅｔＭ的序列不同。     

血管紧张素转换酶基因I／D多态性在云南省彝族人群中的分布

目的 研究云南省晋宁县彝族人群ACE基因插入/缺失(I/D)多态性分布的情况.方法 采用聚合酶链式反应(PCR)技术,检测居住在云南省晋宁县129例彝族健康人的ACE基因I/D多态性,计算DD、ID、II基因型频率和D、I等位基因频率.结果 云南省晋宁县彝族ACE基因的DD、ID、II基因型频率分别为17.1%、42.6%和40.3%,D、I等位基因频率分别为38.4%和61.6%.和不同种族人群比较,云南彝族人群ACE基因I/D多态性分布与古巴黑人、古巴白人和美国黑人差异有统计学意义(P<0.01),而与日本人接近(P>0.05).与我国其它民族比较,除云南彝族人群的II基因型频率和I等位基因频率高于维吾尔族(P<0.05)、D等位基因频率低于维吾尔族(P<0.05)外,云南彝族人群ACE基因I/D多态性分布接近汉族、黎族、哈萨克族、蒙古族和藏族(P>0.05).结论 ACE基因型频率和基因频率存在种族差异.     

携带凋亡素、内皮抑素双基因腺病毒载体的构建

目的构建携带有凋亡素(Apoptin、VP3)、内皮抑素(Endostatin)双基因的重组腺病毒载体,为其在肿瘤治疗的应用研究打下基础。方法将VP3基因和Endostatin基因克隆入腺病毒穿梭质粒pDC316中,将该穿梭质粒与腺病毒骨架质粒pBHGloxE1,3Cre共转染HEK293细胞,包装出重组腺病毒颗粒Ad-vp3-IRES-sEndo-his。其后挑选病毒空斑获取克隆进行小剂量扩增并提取病毒DNA进行PCR、RT-PCR检查以筛选和鉴定毒种,之后大剂量扩增所选得的病毒克隆并进行纯化、测定病毒的滴度。结果所得腺病毒经PCR、RT-PCR检测表明重组腺病毒Ad-vp3-IRES-sEndo-his包装成功。测定病毒50%组织培养感染剂量(TCID50)为5.7×109/ml,病毒颗粒滴度(VP)为1.9×1011/ml。结论成功构建携带凋亡素、内皮抑素双基因腺病毒载体并对其进行了大剂量扩增及提纯,达到了细胞及动物实验使用的标准。     

Construction of adenovirus vector carrying apoptin gene and endostatin gene.

目的 构建携带有凋亡素(Apoptin、VP3)、内皮抑素(Endostatin)双基因的重组腺病毒载体,为其在肿瘤治疗的应用研究打下基础.方法 将VP3基因和Endostatin基因克隆入腺病毒穿梭质粒pDC316中,将该穿梭质粒与腺病毒骨架质粒pBHGloxE1,3Cre共转染HEK293细胞,包装出重组腺病毒颗粒Ad-vp3-IRES-sEndo-his.其后挑选病毒空斑获取克隆进行小剂量扩增并提取病毒DNA进行PCR、RT-PCR检查以筛选和鉴定毒种,之后大剂量扩增所选得的病毒克隆并进行纯化、测定病毒的滴度.结果 所得腺病毒经PCR、RT-PCR检测表明重组腺病毒Ad-vp3-IRES-sEndo-his包装成功.测定病毒50％组织培养感染剂量(TCID.)为5.7×109/ml,病毒颗粒滴度(VP)为1.9×1011/ml.结论 成功构建携带凋亡素、内皮抑素双基因腺病毒载体并对其进行了大剂量扩增及提纯,达到了细胞及动物实验使用的标准.     

凋亡素融合蛋白的基因克隆、表达与体外活性分析

来源于HIV1病毒（47～57位氨基酸）的TAT小肽具有跨膜功能,可以将外源蛋白进行跨膜转运。通过聚合酶链反应(PCR)的方法扩增了TAT凋亡蛋白序列,与载体pET28b连接后在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了高表达,以包涵体形式表达的TAT凋亡蛋白在变性条件下进行了NiNTA纯化,纯化的蛋白经MTT法证明具有诱导HeLa细胞凋亡的能力。     

腺病毒携带凋亡素基因导入对小鼠胃癌的影响

目的 研究携带凋亡素(VP3)基因的腺病毒对小鼠胃癌的作用.方法 将小鼠前胃癌细胞接种于昆明小鼠腋部皮下成瘤,实验组瘤内注射AdCMV-VP3,两对照组分剐注射等量的AdCMV和PBS,每隔1d测量各组肿瘤体积,治疗15 d后,比较3组肿瘤体积的变化并计算抑瘤率.将小鼠脱颈处死,用TUNEL法检测肿瘤组织凋亡情况,用RT-PCR检测VP3基因的表达.将荷瘤小鼠按肿瘤直径分组,实验组均注射等量AdCMV-VP3,对照组均注射等量PBS,治疗15d后,计算抑瘤率.再将同直径肿瘤的荷瘤小鼠按AdCMV-VP3不同注射量分组,对照组注射等量PBS,治疗15d后,计算抑瘤率.结果 实验组的抑瘤率为88.4%,AdCMV对照组的抑瘤率为6.5%,3组肿瘤体积变化的差异有统计学意义(P＜0.05).癌组织中细胞死亡方式以凋亡为主,VP3基因仅在实验组表达.不同肿瘤直径抑瘤率分别是88.4%、73.5%、68.9%,不同剂量抑瘤率分别是63.5%、74.4%、80.5%、88.4%.结论 腺病毒携带VP3基因导入时小鼠实验性胃癌有较好的抑癌作用.肿瘤体积越小,腺病毒用量越大,疗效越好.     

含报告基因的凋亡素基因真核表达载体构建研究

目的构建含报告基因的凋亡素基因真核表达载体。方法对pMD18T-VP3质粒进行EcorI和BamHI双酶切,回收366 bp（含凋亡素基因完整序列）片段。对增强型绿荧光蛋白pEGFP-C2质粒酶切,回收载体大片段。将凋亡素基因通过连接反应,连接到增强型绿荧光蛋白（EGFP）基因C末端的终止密码前,并使两者读框不移位,构建成pEGFP-VP3质粒,并对其进行酶切分析和测序鉴定载体结构。结果通过对构建的pEGFP-VP3质粒酶切、电泳,出现了366 bp的电泳条带,与凋亡素基因片段一致。凋亡素基因真核表达载体测序鉴定结果表明,本研究合成的凋亡素基因与Genbank中报告的凋亡素基因序列一致,同源性为100%。结论将凋亡素基因连接于增强型绿荧光蛋白的C末端,成功构建了凋亡素—增强型绿荧光蛋白表达载体pEGFP-VP3。     

人抵抗素基因全长的体外拼接及真核表达载体的构建

目的:利用合成的寡核苷酸片段,在体外拼接人抵抗素(Resistin,Retn)基因的全长,并构建其真核表达载体。方法:根据已知抵抗素基因(GenBank:AF323081),设计并合成10条寡核苷酸片段,采用降落PCR方法进行拼接,获得预期大小的PCR产物后将其克隆入pSecTag2B载体进行测序确认。结果:降落PCR法扩增的特异条带与目的基因的大小一致。克隆载体测序结果与GenBank中已知序列完全符合。结论:降落PCR成功地拼接和扩增了人抵抗素全长基因,并构建了含有该基因的真核表达载体,为进一步研究该基因的功能奠定了实验基础。     

凋亡素原核表达载体的构建、表达与抗体制备

目的 构建凋亡素基因的原核表达载体,进行表达并制备表达蛋白的多克隆抗体.方法 构建凋亡素 pGEM-T/Apoptin载体,并将凋亡素基因亚克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,将该质粒转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)受体菌中,以IPTG对其进行诱导表达,聚丙烯酰胺凝胶电泳分析目的蛋白.用表达蛋白常规免疫Balb/c小鼠,间接ELISA检测小鼠血清中抗体的滴度.结果 凋亡素基因被成功的克隆至pET-28a(+),表达产物经SDS-PAGE分析,在相对分子量约17 000的位置出现目的蛋白条带,大小与预期结果一致,Balb/c小鼠经5次免疫后,得到了滴度为1:5×10~5血清抗体.结论 凋亡素原核表达载体的成功构建和多克隆抗体的制备为进一步研究凋亡素的功能和凋亡素的应用研究奠定了基础.

Abstract：

Objective To construct a prokaryotic expression vector for apoptin and prepare polyclonal antibody of apoptin.Methods Apoptin gene amplified from pGEM-T/Apoptin plasmid by PCR was cloned into pET-28a(+).E.coli BL21(DE3) was transformed by the recombinant plasmid,and apoptin protein expression induced by IPTG was analyzed by SDS-PAGE.BALB/c mice were immunized with the protein and the titer of the antibody was determined using indirect enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).Results Apoptin gene was successfully cloned into pET-28a(+),and the expression of a protein with relative molecular mass of about 17 000 was identified by SDA-PAGE.After 5 immunizations of the mice with the protein,the blood antibody titer reached 1:5×10~5.Conclusion The prokaryotic expression vector for apDptin is successfully conslructed and the polyclonal antibody of apoptin is Obtailled.which allows further functional study of apoptin.     

荷兰弱毒株凋亡素基因的克隆及真核表达载体的构建

目的 克隆鸡贫血病毒荷兰弱毒株的凋亡素基因,比较来自不同毒株的凋亡素的分子结构差异.方法 经过两次PCR,将含VP2、VP3 DNA片段粘端连接克隆到pUC119质粒中,再将VP3 DNA片段平端连接克隆到pUC119质粒中.结果 成功克隆到荷兰弱毒株凋亡素基因,并构建了其真核表达载体.结论 荷兰弱毒株的凋亡素与26P...     

腺病毒载体介导凋亡素基因联合阿霉素与顺铂对种植性肝癌的治疗研究

目的探讨腺病毒介导凋亡素基因联合阿霉素(ADM)与顺铂(CDDP)对种植性肝癌的治疗。方法建立c57BL/6小鼠皮下荷肝细胞癌模型(n=64),计算成瘤率,观察肿瘤内注射含凋亡素基因的重组腺病毒、ADM及CDDP后种植瘤的体积变化、毒副作用和组织学变化,同时计算抑瘤率。结果在治疗7d后腺病毒AdAFPvp3联合ADM与CDDP治疗组的种植瘤体积、重量均显著低于对照组,比较差异均具有统计学意义,在治疗期间没有观察到毒副作用。结论携带凋亡素基因的重组腺病毒联合ADM与CDDP对肝细胞癌具有治疗作用。