HIF-1α siRNA对非小细胞肺癌A549细胞TIMP1、MMP1表达的影响

目的 探讨HIF-1α基因沉默对非小细胞肺癌(NSCLC) A549细胞基质金属蛋白酶1(matrix metalloproteinase 1,MMP1)、基质金属蛋白酶抑制剂1(matrix metalloproteinase inhibitor,TIMP1)表达的影响。 方法 将siRNA-HIF-1α质粒载体稳定转染至A549细胞中,于缺氧环境下培养。应用MMT法和Transwell试验分别检测转染细胞的增殖、迁移和侵袭能力。应用qRT-PCR和蛋白免疫印迹分别检测转染细胞内TIMP1、MMP1 mRNA和蛋白表达水平。 结果 与Control组相比,A549组HIF-1α mRNA和蛋白表达显著增加(均P<0.05)。与Blank组和si-NC组相比,si-HIF-1α组HIF-1α mRNA表达水平显著降低(P<0.05)。与Blank组相比,si-HIF-1α组在转染24、48和72 h后细胞增殖率均显著降低(均P<0.05)。与Blank组相比,si-HIF-1α组A549细胞在转染24 h后的迁移和侵袭数量均显著降低(P<0.05)。与Blank组相比,si-HIF-1α组细胞内MMP1表达水平显著降低,而TIMP1表达水平显著增加(均P<0.05)。 结论 在缺氧状态下,HIF-1α siRNA靶向沉默HIF-1α在A549细胞内的表达,并可以通过下调MMP1表达和上调TIMP1的表达而抑制细胞的增殖、迁移和侵袭。      

HIF-1α在肺癌中的表达及临床意义

目的:研究缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)在低氧培养条件下肺癌细胞株及肺癌组织中的表达及临床意义.方法:采用Transwell侵袭小室测定法检测缺氧对肺癌细胞侵袭力的影响,分别采用RT-PCR法和免疫印迹(Western blot)、免疫组化法测定缺氧条件下人肺腺癌细胞株A549、小细胞肺癌细胞株H446及60例肺癌组织和20例癌旁正常肺组织中HIF-1α的mRNA和蛋白表达.结果:两种肺癌细胞系在缺氧下侵袭力较正常时增强.随着缺氧时间的延长,肺癌细胞的HIF-1αmRNA和蛋白水平呈升高趋势(P<0.05或P<0.01).肺癌组织中HIF-1α的mRNA和蛋白阳性表达率分别为90.0%、75.0%,明显高于癌旁正常肺组织的30.0%、20.0%(P<0.01),有淋巴结转移的表达高于无淋巴结转移者,中晚期(Ⅲ～Ⅳ期)肺癌组织中的表达高于早期(I-Ⅱ期)(P<0.05).结论:氯化钴诱导缺氧上调HIF-1α在肺癌细胞中的表达,使之进一步耐受缺氧.HIF-1α的过表达参与了肺癌的侵袭转移,HIF-1α可成为判断肺癌生物学行为的重要指标.     

miR-155-5p mimic靶向HIF-1α对非小细胞肺癌A549细胞生长和运动能力的调节作用和机制

【摘要】 目的 探讨miR-155-5p mimic靶向缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）对非小细胞肺癌A549细胞生长和运动能力的调节作用和机制。 方法 取对数期生长的A549细胞,将未经转染的细胞设为Control组,miR-155 mimic及HIF-1α分别转染至A549细胞,设为miR 155 mimic组和HIF-1α组;再将两者共同转染于A549细胞,设为mimic+HIF-1α组。采用荧光素酶报告基因检测miR 375与SLC7A11的靶向关系,利用RT PCR检测各组细胞miR 155-5p及HIF-1α mRNA表达水平,Edu染色检测细胞增殖,划痕实验检测细胞迁移,Transwell小室实验检测细胞侵袭,Western blot检测细胞中各蛋白表达。结果 HIF-1α是miR 155-5p-mimic的靶向基因。与Control组相比,miR-155-mimic组HIF-1α-mRNA水平、HIF-1α和Ki67蛋白表达量及增殖细胞数、侵袭细胞数及划痕愈合率均降低（P＜0.05）,HIF-1α组HIF-1α mRNA水平、HIF-1α和Ki67蛋白表达量及增殖细胞数、侵袭细胞数及划痕愈合率均升高（P＜0.05）。与HIF-1α组相比,mimic+HIF-1α组HIF-1α mRNA水平、HIF-1α和Ki67蛋白表达量及增殖细胞数、侵袭细胞数及划痕愈合率均降低（P＜0.05）。与Control组相比,miR-155-mimic组N cadherin、VEGF、VEGFR2、P38蛋白表达量降低,E cadherin蛋白表达量升高（P＜0.05）,HIF-1α组N cadherin、VEGF、VEGFR2、P38蛋白表达量升高,E cadherin蛋白表达量降低（P＜0.05）。与HIF-1α组相比,mimic+HIF-1α组N cadherin、VEGF、VEGFR2、P38蛋白表达量降低,E cadherin蛋白表达量升高（P＜0.05）。结论 miR-155-5p可通过靶向抑制HIF-1α表达抑制非小细胞肺癌A549细胞增殖、侵袭及迁移,其作用机制可能与抑制上皮间质转化及VEGF/P38通路相关。     

miR-185-5p靶向AKR1C1抑制肺癌细胞的迁移和侵袭

观察miR-185-5p对肺癌细胞迁移、侵袭的影响,分析酮还原酶1家族成员C1(AKR1C1)在miR-185-5p调控肺癌细胞迁移和侵袭中的作用。方法 RT-qPCR检测miR-185-5p在组织样本(人肺癌及对应癌旁组织)、细胞系(人肺上皮细胞系BEAS-2B和肺癌细胞系A549、H460)中的表达。按照处理方式不同将A549细胞分为miR-NC组(转染miR-NC)、miR-185-5p组(转染miR-185-5p)、miR-185-5p+pcDNA组(共转染miR-185-5p和pcDNA)、miR-185-5p+pcDNA-AKR1C1组(共转染miR-185-5p和pcDNA-AKR1C1);Transwell和划痕实验检测各组A549细胞迁移和侵袭;在线预测网站Starbase预测miR-185-5p的下游靶基因;双荧光素酶报告基因实验检测A549细胞荧光素酶活性;蛋白免疫印迹实验检测各组A549细胞中AKR1C1、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9的蛋白表达。结果 与癌旁组织比较,肺癌组织中miR-185-5p的表达显著降低(P<0.001);与BEAS-2B细胞比较,A549和H460细胞中miR-185-5p的表达亦显著降低(均P<0.001);与miR-NC组比较,miR-185-5p组A549细胞的miR-185-5p表达显著升高,迁移和侵袭细胞数及划痕愈合率均显著降低(均P<0.001),MMP-2、MMP-9蛋白的表达均显著降低(均P<0.001)。Starbase预测显示miR-185-5p与AKR1C1之间存在连续的互补结合序列;与miR-NC组比较,miR-185-5p组AKR1C1-WT细胞的荧光素活性显著降低(P<0.05)。与miR-NC组比较,miR-185-5p组细胞中AKR1C1蛋白表达显著降低(P<0.05);与anti-miR-NC组比较,anti-miR-185-5p组细胞中AKR1C1蛋白表达显著升高(P<0.05)。与癌旁组织比较,肺癌组织中AKR1C1 mRNA和蛋白表达均显著升高(均P<0.001);与BEAS-2B细胞比较,A549细胞中AKR1C1 mRNA和蛋白表达均显著升高(均P<0.001)。与miR-185-5p+pcDNA组比较,miR-185-5p+pcDNA-AKR1C1组miR-185-5p表达显著降低(P<0.001)、迁移和侵袭细胞数及划痕愈合率均显著升高(均P<0.001)、MMP-2和MMP-9的蛋白表达均显著升高(均P<0.001)。结论 miR-185-5p可抑制肺癌细胞的迁移、侵袭,该作用与miR-185-5p靶向负性调控AKR1C1有关。     

缺氧诱导因子1α调控人肺腺癌瘦素表达机制的初步研究

目的 探讨低氧条件下缺氧诱导因子1α(HIF-1α)对人肺腺癌瘦素基因的调控作用及其机制.方法 采用免疫组织化学方法检测42例肺腺癌患者手术切除癌组织中HIF-1α和瘦素的表达,以其中16例患者的癌旁组织为对照.人肺腺癌A549细胞株分别经不同时间低氧处理(低氧0、12、24、48 h组)和不同浓度(0、5、10、20 μmol/L)HIF-1α抑制剂GL331+低氧处理,以反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测各组细胞HIF-1α和瘦素mRNA的表达,蛋白质印迹法检测HIF-1α和瘦素蛋白的表达.结果 肺腺癌和癌旁组织中HIF-1α表达阳性率分别为57.1%和18.8%(P<0.01),瘦素表达阳性率分别为69.0%和25.0%(P<0.01).低氧0、12、24、48 h组A549细胞中HIF-1α蛋白表达水平分别为0.314±0.030、0.552±0.027、0.743±0.015、0.799±0.010,瘦素mRNA分别为0.144±0.009、0.336±0.017、0.524±0.013、0.671±0.021,瘦素蛋白分别为0.398±0.016、0.633±0.036、0.796±0.008、0.942±0.088,各低氧组均明显高于低氧0 h组(均P<0.01);HIF-1αmRNA表达不随低氧时间的延长而变化(P>0.05).GL331抑制HIF-1α转录后再给予低氧处理,A549细胞中HIF-1α、瘦素mRNA及蛋白表达均随GL331浓度升高而逐渐受抑,不同浓度组均明显低于0 μmol/L组(P<0.01).结论 瘦素的表达水平随肺腺癌细胞低氧信号的加强而上调,并受HIF-1α的调控.     

hnRNP B1 siRNA对肺腺癌细胞A549 p53表达的影响

目的 探讨核内不均一核糖核蛋白(hnRNP)B1调节肺腺癌细胞A549抑癌基因p53表达的作用.方法 采用前期研究已构建并通过体外实验证实具有较好干扰效果的两对hnRNP B1特异性的小干扰RNA(siRNA)真核细胞表达载体(重组质粒A和D)转染的人肺腺癌细胞株A549作为实验组,对照组为转染空质粒的A549细胞和未转染任何质粒的A549细胞.各组细胞均用10 μmol/L顺铂作用24 h收集细胞.实时荧光定量RT-PCR检测p53 mRNA的表达,Western blot检测P53及磷酸化P53蛋白表达的变化.结果 各组细胞p53 mRNA和蛋白表达量无明显差异,说明hnRNP B1特异性siRNA对A549细胞p53基因mRNA和蛋白表达无影响.转染hnRNP B1 siRNA细胞磷酸化P53蛋白表达率分别为0.87±0.06、0.75±0.06,与空质粒转染组(0.30±0.08) 和未转染组(0.21±0.04)相比明显增高(P<0.01).结论 hnRNP B1 siRNA可上调肺腺癌细胞A549 P53活性,参与肺癌的发生发展.     

RNA干扰沉默缺氧诱导因子-1α对胃癌细胞生物学行为的影响

目的:观察RNA干扰沉默缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)对胃癌细胞增殖﹑凋亡﹑侵袭性的影响并探讨其可能的分子机制。方法:将HIF-1α短发夹RNA(shRNA)重组质粒pGCsi-shHIF-1α稳定转染人胃癌细胞SGC-7901;采用RT-PCR和Western blot法检测HIF-1α mRNA、蛋白表达水平,Western blot法检测葡萄糖转运蛋白1(Glut-1)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)及趋化因子受体CXCR4蛋白表达;MTT法、流式细胞仪、transwell试验分别检测转染细胞的增殖、凋亡及侵袭迁移能力。结果:稳定转染pGCsi-shHIF-1α后,SGC-7901细胞HIF-1α表达在mRNA及蛋白水平均受到明显抑制,Glut-1﹑MMP-2﹑CXCR4蛋白表达较对照组降低;细胞增殖能力较对照组明显降低,细胞凋亡率明显高于对照组(P<0.05);细胞体外侵袭迁移能力受到明显抑制(P<0.01)。结论:pGCsi-shHIF-1α能有效沉默胃癌细胞SGC-7901 HIF-1α基因表达,抑制胃癌细胞增殖、迁移及侵袭并诱导其凋亡,提示HIF-1α可能通过上调Glut-1﹑MMP-2和C...     

RNA干扰Grp78蛋白对肺癌细胞A549的作用研究

目的 探讨采用RNA干扰Grp78蛋白表达,观察对肺癌细胞A549的作用.方法 通过转染Grp78的siRNA质粒到肺癌细胞A549并进行表达,观察A549细胞的Grp78蛋白的表达及细胞的侵袭和转移能力的变化.结果 RNA干扰肺癌细胞A549的Grp78的表达,能够显著地抑制癌细胞的黏附、伸展,以及MMP-2,MMP-9蛋白的表达,甚至诱导细胞凋亡.结论 siRNA特异性下调Grp78蛋白,可以抑制肺癌细胞A549的侵袭和转移,甚至导致细胞凋亡.     

microRNA-34a在肺癌细胞凋亡中的作用

目的 探讨microRNA-34a在肺癌细胞凋亡中的作用。 方法 将A549肺癌细胞株分为3组:microRNA-34a转染组、对照组和未转染组。分析microRNA-34a在A549肺癌细胞中的表达,microRNA-34a对A549肺癌细胞生长周期、细胞增殖、细胞凋亡的影响,microRNA-34a对A549肺癌细胞Bcl-2、P53和C-MYC蛋白以及mRNA表达的影响。 结果 miRNA-34a转染组microRNA-34a的表达明显高于对照组(P<0.05)。miRNA-34a转染组G₀/G₁细胞明显高于对照组和未转染组(P<0.05)。miRNA-34a转染组48 h和96 h的增殖率明显低于对照组和未转染组(P<0.05)。miRNA-34a转染组的细胞凋亡明显高于对照组和未转染组(P<0.05)。miRNA-34a转染组的Bcl-2蛋白和C-MYC蛋白表达水平明显低于对照组(P<0.05);miRNA-34a转染组的P53蛋白表达水平明显高于对照组(P<0.05)。miRNA-34a转染组的Bcl-2 mRNA和C-MYC mRNA表达水平明显低于对照组Bcl-2 mRNA和C-MYC mRNA表达水平(P<0.05);miRNA-34a转染组的P53 mRNA表达水平明显高于对照组P53 mRNA表达水平(P<0.05)。 结论 microRNA-34a抑制A549肺癌细胞增殖,促进A549肺癌细胞的凋亡,机制可能为下调Bcl-2和C-MYC基因,上调P53基因。      

下调叉头转录因子M1基因表达对非小细胞肺癌细胞生长与侵袭能力的影响

目的 研究用叉头转录因子M1(FoxM1)基因小干扰RNA下调非小细胞肺癌(NSCLC)细胞株FoxM1基因表达后细胞增殖与侵袭能力的改变,为开发新的NSCLC靶向治疗方法提供依据.方法 设计靶向FoxM1小干扰RNA(siFoxM1),分别以siFoxM1和无关对照siRNA转染人NSCLC细胞株SPC-A-1、A549和LTEP-a-2,采用实时逆转录PCR和蛋白质印迹法检测FoxM1 mRNA和蛋白表达,采用集落形成试验、划痕试验和细胞侵袭试验研究下调FoxM1基因表达对细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响.结果 转染siFoxM1可高效特异地下调SPC-A-1、A549和LTEP-a-2细胞的FoxM1mRNA表达(分别下降83.9%、83.6%、88.6%)和蛋白表达.转染siFoxM1的SPC-A-1、A549和LTEP-a-2细胞集落形成数[分别为(136.0±15.5)、(87.0±2.6)和(121.7±9.4)个]和穿膜细胞数[分别为(19.2±2.5)、(4.2±0.8)和(6.2±1.8)个]均明显低于转染无关对照siRNA细胞[集落形成数分别为(222.3±20.5)、(164.7±14.1)和(260.7±13.5)个,穿膜细胞数分别为(81.4±6.2)、(39.2±4.6)和(35.6±3.0)个,均P<0.01];转染siFoxM1的SPC-A-1细胞划痕愈合率(52.6%±7.8%)明显低于转染无关对照siRNA细胞(85.3%±18.6%,P<0.01).结论 FoxM1基因表达下调可显著降低多种NSCLC细胞的增殖与侵袭能力,提爪FoxM1是潜在的肺癌治疗靶点.     

沉默CDH1基因促进非小细胞肺癌A549细胞系转移侵袭的机制

目的探究小干扰RNA(siRNA)沉默非小细胞肺癌A549细胞系E-钙黏蛋白(E-cadherin)基因(CDH1)后对于A549细胞转移和侵袭的促进作用。方法采用siRNA技术沉默A549细胞中的CDH1基因,采用RT-QPCR和Western blot法检测沉默后的基因表达与蛋白表达。将细胞分为对照组(Control)、siRNA阴性组(siRNA-NC)和siRNA基因沉默组(siRNA-CDH1),CCK-8检测基因沉默后12、24、48、72 h细胞活力,细胞划痕实验检测细胞迁移能力的变化,Transwell小室检测细胞侵袭能力的变化,Western blot法检测细胞转移侵袭关键因子波形蛋白(vimentin),基质金属蛋白MMP-2和MMP-9,以及N-cadherin的表达水平。RT-QPCR检测vimentin、MMP-2、MMP-9以及Slug、Snail的mRNA表达水平。结果 CDH1沉默后,A549细胞活力显著增高,且呈时间依赖性,相比Control组和siRNA-NC组差异有统计学意义(P0.05)。细胞划痕实验和Transwell小室实验结果显示,CDH1沉默后细胞迁移和侵袭能力显著增强,相比Control组和siRNA-NC组差异有统计学意义(P0.05)。siRNA-CDH1组中vimentin、MMP-9、MMP-2以及N-cadherin的表达显著上调,vimentin、MMP-9、MMP-2以及Slug、Snail的mRNA表达水平也上调,相比Control组和siRNA-NC组差异有统计学意义(P0.05)。结论 CDH1缺失可以增加A549细胞的增殖能力以及侵袭能力。     

GLUT-1和MMP-2在非小细胞肺癌中的表达及相关性研究

目的:探讨葡萄糖转运蛋白1(GLUT-1)和基质金属蛋白酶-2(MMP-2)在低氧培养条件下肺腺癌细胞株A549及非小细胞肺癌(NSCLC)组织中的表达及临床意义。方法:分别采用免疫印迹(Western Blot)、免疫组化法测定缺氧条件下A549细胞及80例NSCLC组织和26例癌旁正常肺组织中GLUT-1和MMP-2的蛋白表达,并分析GLUT-1、MMP-2与临床病理特点之间的关系及两者相互关系。结果:随着缺氧时间的延长,肺腺癌细胞中GLUT-1和MMP-2的蛋白水平呈升高趋势(P<0.01或P<0.05)。NSCLC组织中GLUT-1和MMP-2的蛋白阳性表达率明显高于癌旁正常肺组织(P<0.01)。有淋巴结转移的表达高于无淋巴结转移者,中晚期(Ⅲ+Ⅳ期)肺癌组织中的表达高于早期(Ⅰ+Ⅱ期)(P<0.05或P<0.01)。GLUT-1与MMP-2表达呈正相关(P<0.01)。结论:氯化钴诱导缺氧可以上调GLUT-1和MMP-2在肺腺癌细胞中的表达,使之进一步耐受缺氧。HIF-1α、GLUT-1在NSCLC组织中过度表达,两者协同参与了非小细胞肺癌的侵袭转移。     

乏氧诱导的自噬与肺腺癌放射抵抗的相关性研究

目的 研究乏氧诱导的自噬与肺腺癌放射抵抗之间的相关性.方法 肺腺癌A549细胞行常氧和乏氧培养.构建靶向抑制乏氧诱导因子-1α(HIF-1α)的shRNA表达质粒,转染乏氧A549细胞,筛选稳定表达的克隆细胞.克隆形成实验检测细胞放射敏感性.Western blot法检测各处理组细胞HIF-1α、beclin1蛋白的表达.结果 乏氧细胞存活分数(SF2)为0.62,常氧细胞为0.43,提示乏氧A549细胞放射敏感性降低.常氧下A549细胞HIF-1α和beclin1蛋白低表达,乏氧12、24、48 h时间点HIF-1α和beclin1蛋白表达明显增加,差异均有统计学意义(P＜0.05).相应时间点HIF-1α与beclin1的表达呈正相关(r＝0.75,P＜0.05).A549/HIF-1α-shRNA的SF2为0.45,放射增益比(SER)为0.72,明显低于阴性对照组,说明抑制HIF-1α表达明显提高乏氧A549细胞放射敏感性.乏氧条件下HIF-1α的表达被抑制后 beclin1 蛋白的表达明显降低(24 h:t=5.69,P=0.01;48 h:t=5.13,P=0.01).结论 乏氧诱导的自噬参与肺腺癌的放射抵抗.     

HIF-1α516对人肝癌HepG2细胞侵袭转移能力的影响

目的观察HIF-1α516对人肝癌HepG2细胞侵袭转移能力的影响。方法人肝癌HepG2细胞分为空白组(同步培养,不做任何处理)、对照组(转染siRNA)和siRNA干扰组(转染HIF-1α516 siRNA)。siRNA和HIF-1α516 siRNA通过脂质体转染HepG2,转染18h后Western blot检测HepG2细胞中HIF-1β核蛋白和全细胞蛋白的表达、ELISA法检测细胞培养上清中MMP-2、MMP-9的含量,Transwell小室观察HepG2的转移侵袭能力。结果 HIF-1α516 siRNA能显著降低HepG2细胞HIF-1α516mRNA的表达(降低70.0%)(P<0.01);增强HepG2细胞的侵袭转移能力(增强71.10%)(P<0.01)。HIF-1α516siRNA对全细胞HIF-1β蛋白的表达无影响,但能促进HIF-1β蛋白的核转移(增强64.1%)(P<0.01)。HIF-1α516 siRNA能明显升高HepG2细胞培养上清中MMP-2、MMP-9蛋白表达,分别升高37.72%、55.46%(P<0.01)。结论 HIF-1α516能抑制HepG2的转移侵袭,其机制可能与抑制HIF-1β的核转移有关。     

赖氨酰氧化酶与乳腺癌侵袭转移相关因子的研究

目的探讨赖氨酰氧化酶(LOX)与乳腺癌侵袭转移相关因子基质金属蛋白酶(MMPs)及低氧诱导因子-1α(HIF-1α)的相关性以及LOX在乳腺癌侵袭转移中的可能机制。方法构建LOX基因的特异性慢病毒干扰载体(LOX-RNAi-LV),稳定转染至乳腺癌细胞MDA-MB-231,实验设空白组、干扰组和阴性对照组,实时定量荧光PCR检测3组细胞中LOX、MMP-2、MMP-9和HIF-1α的表达,Western blot检测各组LOX蛋白的表达;构建乳腺癌细胞MDA-MB-231,MCF-7和LOX基因干扰的MDA-MB-231裸鼠移植瘤模型,6周后测定移植肿瘤的生长及转移情况,SP免疫组织化学技术检测移植瘤中LOX、MMP-2、MMP-9及HIF-1α蛋白的表达情况。结果转染LOX-RNAi-LV后乳腺癌细胞MDA-MB-231中的LOX mRNA和蛋白被明显抑制,抑制率为89.20%和82.97%,差异有统计学意义(P<0.05);干扰组的MMP-2、MMP-9及HIF-1α表达与阴性对照组及空白组比较差异有统计学意义(P<0.05);6周后裸鼠的MDA-MB-231组LOX、MMP-2、MMP-9及HIF-1α蛋白表达水平明显高于LOX基因干扰组及MCF-7组,相关分析显示,LOX蛋白与MMP-2(r=0.696,P=0.000)、MMP-9(r=0.735,P=0.000)、HIF-1α(r=0.737,P=0.000)蛋白呈显著正相关。结论 LOX-RNAi-LV可有效下调乳腺癌细胞MDA-MB-231中LOX mRNA和蛋白表达水平;LOX促进乳腺癌侵袭转移的机制可能与MMP-2、MMP-9及HIF-1α的异常表达相关。     

rhIL-11通过激活JAK/STAT3/HIF-1α/EMT通路促进肺腺癌A549细胞转移机制

【摘要】 目的 探讨重组人白细胞介素11（rhIL-11）通过激活JAK/STAT3/HIF-1α/EMT通路促进肺腺癌A549细胞侵袭转移的机制。方法 将人肺腺癌A549细胞分为rhIL-11 0μg/L组（对照组）、rhIL-11 10μg/L组、rhIL-11 40μg/L组、rhIL-11 80μg/L组、rhIL-11 0μg/L+AG490（JAK抑制剂）组、rhIL-11 10μg/L+AG490组、rhIL-11 40μg/L+AG490组和rhIL-11 80μg/L+AG490组共8组,采用划痕试验和Transwell侵袭试验了解rhIL-11对细胞迁移和侵袭能力的影响。用qRT PCR和Western Blot法检测肿瘤细胞中STAT3、HIF-1α、Twist和E Cadherin等基因的mRNA和蛋白表达。 结果 rhIL-11促进肺癌A549细胞迁移和侵袭能力增强,且随着rhIL-11浓度的增高而增强,各组间比较,差异均有统计学意义(P＜0.05)。与对照组比较,rhIL-11 80μg/L组的STAT3、HIF-1α和Twist等基因的mRNA和蛋白表达量均明显增加（P＜0.05）,而E Cadherin基因的mRNA和蛋白表达量均明显减低（P＜0.05）。与rhIL-11 80μg/L 组比较,rhIL-11 80μg/L+AG490组的STAT3、HIF 1α和Twist的mRNA和蛋白表达均显著降低（P＜0.01）。结论 rhIL-11促进肺癌A549细胞侵袭转移,其机制可能是通过激活JAK/STAT3/HIF-1α/EMT信号通路促进转移。     

STAT3 siRNA对肺腺癌A549细胞STAT3及其下游基因表达的影响

目的：观察RNA干扰沉默STAT3基因对人肺腺癌A549细胞STAT3、CyclinD1、Bcl-2、BAX、Caspase-9蛋白表达的影响及其相关性及对细胞生长的影响,探讨肺癌基因治疗的新途径。方法：采用化学合成法,合成针对STAT3基因不同位点设计的3条小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）序列（siRNA1-3）和1条带有荧光标记的应用STAT3-siRNA转染处理人肺腺癌细胞系A549,转染16h后荧光显微镜观察转染效率,RT-PCR检测STAT3基因表达的变化,蛋白免疫印迹法检测转染后A549细胞STAT3,CyclinD1,BAX,Bcl-2,Caspase-9蛋白表达,AM-BLUE检测A549细胞生长情况。结果：经RNA干扰能有效减低A549细胞STAT3mRNA表达水平（P〈0.05）,转染后A549细胞STAT3、CyclinD1、Bcl-2蛋白的表达水平均显著降低（P〈0.05）,而BAX、Caspase-9蛋白的表达水平升高（P〈0.05）。STAT3蛋白表达分别与CyclinD1、Bcl-2蛋白表达呈正相关（r=0.854,0.910,P〈0.05）;与BAX蛋白表达程负相关性（r=-0.848,P〈0.05）;与Caspase-9蛋白表达程无相关性（r=-0.787,P〉0.05）。RNA干扰法沉默STAT3基因后,A549细胞增殖受到明显抑制。结论：STAT3-siRNA可有效抑制STAT3、CyclinD1、Bcl-2在人肺腺癌A549细胞中的表达,升高BAX、Caspase-9在人肺腺癌A549细胞中的表达,抑制A549细胞生长。     

TNF-α/HIF-1α/VASP途径在肺癌A549细胞增殖和粘附中的作用研究

【目的】 肺癌是目前世界癌症导致死亡排名第一的肿瘤,其中肿瘤细胞的增殖和转移与肺癌的死亡率密切相关。最近的调查显示肿瘤坏死因子-α(TNF-α)与肿瘤的侵袭和转移相关,但是具体的机制仍不清楚。本实验旨在以肺癌A549细胞作为模型,研究TNF-α/HIF-1α/VASP途径在肺癌A549细胞的增殖和粘附中的作用。 【方法】 常规培养A549细胞,用MTT法和adhesion assay分别检测不同浓度的TNF-α对A549细胞增殖和粘附的影响。在随后的实验中采用高浓度的TNF-α刺激(120 ng/mL)作为刺激因素,分别用sh-RNA和pEGFP-C1-VASP敲除或过表达VASP、用siRNA和pEGFP-C1敲除或过表达HIF-1α,MTT法和adhesion assay分别检测细胞增殖和粘附水平,PCR检测HIF-1α和VASP在mRNA表达水平,蛋白质印迹法检测HIF-1α和VASP蛋白的表达。同时采用Luciferase assay 的方法检测HIF-1α与VASP启动子区域结合的状态。 【结果】 (1)高剂量TNF-α可以促进HIF-1α表达,从而下调VASP表达水平,抑制肺癌A549细胞增殖和粘附。(2)与空载质粒pEGFP-C1组相比,瞬时转染VASP过表达质粒pEGFP-C1-VASP后,A549细胞的增殖能力显著增加(P<0.05),粘附能力显著增加(P<0.05)。相反,与Scrambled-shRNA组比较,通过转染VASP shRNA特异性敲降VASP后,A549细胞的增殖能力显著降低(P<0.05),粘附能力显著降低(P<0.05)。(3)选择高浓度TNF-α(120 ng/mL)处理A549细胞24小时后,与空载质粒pEGFP-C1组相比,瞬时转染HIF-1α过表达质粒pEGFP-C1-HIF后,HIF-1α的表达在mRNA 和蛋白水平都显著增加(P<0.05),与此同时VASP的表达在mRNA和蛋白的水平显著降低(P<0.05)。相反,与Scrambled-siRNA组比较,通过转染HIF siRNA特异性敲降HIF-1α后, HIF-1α的表达在mRNA 和蛋白水平都显著降低(P<0.05),与此同时VASP的表达在mRNA和蛋白的水平显著增高(P<0.05)。(4)在给予肿瘤坏死因子-α诱导的细胞中,通过转染HIF siRNA特异性敲降HIF-1α表达后,TNF-α带来的HIF-1α的升高被部分抵消了(P<0.05)。(5)Luciferase assay 的检测结果提示HIF-1α可以与VASP启动子区域结合从而在转录水平上抑制VASP的表达。 【结论】 高浓度TNF-α通过增加HIF-1α的表达,调控并抑制VASP蛋白的表达,从而降低肺癌A549细胞增殖和粘附,从而发挥抗肿瘤的作用。     

PKD3促进非小细胞肺癌A549细胞迁移的作用和机制

目的 探讨PKD3在非小细胞肺癌细胞迁移和侵袭中的作用及机制.方法 以人非小细胞肺癌A549细胞为研究对象,通过重组腺病毒感染和siRNA转染的策略,采用HEK293细胞测定病毒滴度;荧光定量RT-PCR和Western blot检测转染对照siRNA与PKD3 siRNA的A549细胞中PKD3、MT1-MMP、MMP-2的mRNA和蛋白表达水平差异;创伤愈合实验检测PKD3过表达或siRNA转染后不同时间点各组细胞的迁移能力.结果 经HEK293细胞病毒滴度测定,3种重组腺病毒Ade-LacZ、Ade-PKD3和Ade-PKD3-DN滴度分别达2.4×109、3.0×109、3.2×109 PFU/ml;免疫印迹证实Ade-PKD3和Ade-PKD3-DN在A549中高效过表达;在感染细胞24 h后和细胞划痕后4 、20 h,与Ade-LacZ感染的对照细胞相比,感染Ade-PKD3的A549迁移能力显著增强(P<0.01),而细胞划痕后8 h和20 h后,与Ade-LacZ感染细胞相比,Ade-PKD3-DN的A549迁移能力显著减弱(P<0.01);同时,siRNA敲低A549细胞中内源性PKD3的表达不仅在细胞划痕后的16、24、36 h明显抑制细胞的迁移,而且在mRNA和蛋白水平下调肿瘤细胞迁移和侵袭相关基因MT1-MMP、MMP-2的表达.结论 PKD3的表达可显著增强A549的迁移能力,这种作用可能通过上调MT1-MMP、MMP-2的表达实现.     

干扰CD44v3的表达对肺腺癌A549细胞侵袭行为的影响

目的研究肺腺癌细胞A549的侵袭能力和黏附分子CD44v3的关系。方法用pRNAT-H1.1/Neo(6.1 kb)质粒构建一个能够稳定转录短发卡RNA(shRNA)并干扰CD44v3分子表达的表达载体,将其转染A549细胞,用荧光免疫细胞化学法和Western blot检测A549细胞CD44v3表达的变化。用Boyden室和人工基底膜构建癌细胞的体外侵袭模型,计数并比较各实验组穿过人工基底膜的细胞数。结果肺腺癌细胞A549表达CD44v3分子,分子量为130 kD(1 kD=0.992 1 ku)。转染干扰质粒表达载体能够使A549细胞的CD44v3表达降低46%。癌细胞的离体侵袭模型中发现干扰组癌细胞侵袭能力为(4.00±1.22),空载对照组为(13.20±4.92),前者的癌细胞侵袭能力较后者下降70%(P<0.01)。抗CD44v3单克隆抗体(阳性对照组)也可降低A549细胞的侵袭能力,干扰组和阳性对照组比较,两者差异无显著性意义(P>0.05)。结论肺腺癌细胞A549表达CD44v3分子,用RNAi技术可降低其表达。CD44v3表达降低的A549细胞侵袭能力受到抑制。