分泌抗鼠疫耶尔森菌F1抗原单克隆抗体杂交瘤株的建立

目的应用杂交瘤技术,制备分泌抗鼠疫F1抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞株。方法用鼠疫菌F1抗原免疫雌性BALB/c小鼠,检测小鼠血清中的F1抗体,选抗体滴度最高的小鼠用于细胞融合,融合前3天F1抗原经腹腔注射加强免疫1次,然后取其脾脏细胞与处于对数生长期的SP2/0骨髓瘤细胞混合,50%的PEG作为细胞融合剂,HAT培养液选择培养融合后的细胞,间接ELISA法检测细胞培养上清中的F1抗体,阳性杂交瘤细胞用有限稀释法进行克隆及再克隆。结果获得共计100余株分泌F1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,3株进行了4次克隆化,经8个月保存后抗体分泌稳定。结论应用杂交瘤技术,在云南首次成功制备了3株能稳定分泌抗鼠疫杆菌F1抗原的单克隆抗体杂交瘤细胞株,建立了杂交瘤技术的实验程序。     

无血清培养液在分泌鼠疫F1McAb杂交瘤细胞中的初步应用

目的应用ADCF无血清细胞培养液对分泌鼠疫F1McAb的杂交瘤细胞进行静止培养,初步了解该瘤株在ADCF中的生长情况,为今后采用无血清培养液体外培养法生产单克隆抗体提供依据。方法通过将杂交瘤细胞直接转入ADCF培养液培养、驯化培养和优化条件后培养,观察细胞在各种培养条件下的生长情况,进行活细胞计数和抗体效价检测。结果用ADCF培养鼠疫F1杂交瘤细胞,细胞直接转入不能较好的生长;通过驯化、在放过含血清培养液的原瓶中能较好的贴壁生长,在新瓶中不能稳定地贴壁生长和增殖;在经含血清的培养液优化后的培养瓶中,细胞能贴壁生长和增殖。结论ADCF培养液可用于分泌鼠疫F1McAb的杂交瘤细胞的培养。     

鼠疫FI单克隆抗体杂交瘤株的建立

先后两次分别用鼠疫EV活菌和FI抗原免疫BALB/C小鼠的脾细胞与SP2/0瘤细胞混合,大容量40％PEG处理后离心法杂交,用IHA和PPA-ELISA检测McAb,建立了21株分泌抗鼠疫FI抗原的McAb的杂交瘤株,初步鉴定了其中5株。观测了1株杂交瘤分泌的McAb用于RIHA的特异性和敏感性。     

丙型肝炎病毒F蛋白反式激活基因2的克隆化研究

目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学(bioinformatics)技术筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)F蛋白反式激活新型靶基因,进一步阐明HCV感染相关疾病的发病机制.方法:以HCV F蛋白表达质粒pcDNA3.1(-)-F转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析.应用分子生物学技术,结合生物信息学技术,克隆HCV F蛋白反式激活作用的新的靶基因.结果:对于所获基因片段序列分析表明,其中之一为新型基因片段.从HepG2细胞提取总RNA,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列,并测序证实,因其可以被F蛋白反式激活,故命名为F蛋白反式激活蛋白2(HCV FTP2),已在GenBank中注册,注册号:AY740522.HCV FTP2基因的编码序列全长为177个核苷酸(nt),编码产物由58个氨基酸残基(aa)组成.结论:HCV F蛋白在病毒的自然感染过程中有明显的表达,最近的研究表明蛋白还具有反式激活的作用,上调宿主细胞某些基因的表达,可能参与HCV致癌.HCV F反式激活新靶基因的发现,为进一步研究HCV F蛋白的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定了基础.     

流感病毒A单抗杂交瘤细胞的制备及鉴定

目的制备抗A型流感病毒的单克隆抗体,用以建立特异、灵敏、简便的A型流感金标试纸检测方法。方法将A型流感病毒为完全抗原免疫BALB／c小鼠,得到的脾细胞与SP2／0细胞融合,获得稳定分泌抗流感A单抗的杂交瘤细胞株,对抗体进行鉴定。结果用杂交瘤技术,得到了3株可稳定分泌抗流感A单抗的杂交瘤细胞株,能分泌高滴度的针对A型流感病毒的特异单抗。结论本研究建立了抗A型流感病毒杂交瘤细胞株单克隆抗体,为金标法快速诊断A型流感感染打下了试验基础。     

HBV X蛋白反式调节基因XTP11的克隆化研究

目的:应用寡核苷酸基因芯片技术及生物信息学分析,筛选并克隆乙肝病毒X蛋白(HBxAg)反式激活新型靶基因.方法:以HBxAg表达质粒pcDNA 3.1(-)-X转染HepG2细胞,以空载体pcDNA 3.1(-)为平行对照,提取mRNA并进行寡核苷酸基因芯片分析.对于所获基因片段序列分析表明,其中之一为新型基因片段,与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性.通过序列同源性搜索和比对和电子拼接,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,确定新型基因序列.从转染了pcDNA 3.1(-)-X的HepG2细胞提取总RNA,以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,扩增获得该新基因的全长序列,并测序证实.结果:该新基因命名为XTP11,在GenBank中注册,注册号为AY740520.该基因的编码序列全长为1 344个核苷酸(nt),编码产物由448个氨基酸残基(aa)组成.结论:HBxAg反式激活新型靶基因XTP11的筛选与克隆,为进一步研究HBxAg反式激活作用的分子生物学机制奠定基础.     

杂交瘤细胞凝集试验诊断血吸虫病的实验研究

目的用杂交瘤细胞凝集试验(hybridomacellsagglutinationtest,HCAT)诊断实验日本血吸虫病,并探讨杂交瘤细胞在特异性血清中凝集的机制。方法分泌抗血吸虫31/32kDa抗原单抗的杂交瘤细胞H226经特定处理后分别与感染日本血吸虫尾蚴10、30和50条的小鼠血清孵育,动态观察感染后不同时间的凝集反应。上述杂交瘤细胞涂片后与日本血吸虫感染兔血清进行间接免疫荧光试验(IFT),以探讨凝集机制。结果杂交瘤细胞在感染鼠血清中呈现凝集反应:感染后2wk时,50条尾蚴感染组中70％HCAT阳性,至第5周,全部感染小鼠均出现阳性反应。抗原滴度在感染后逐步升高,感染后6wk时达到最高。重度感染鼠的抗原滴度明显高于中、轻度感染鼠。IFT显示,在杂交瘤细胞膜表面呈现特异性的黄绿色荧光,而细胞内未见显色。结论HCAT是一种血吸虫病诊断新方法。     

乙型肝炎病毒DNA聚合酶逆转录酶蛋白反式调节基因1的克隆化研究

目的　应用抑制性消减杂交 (SSH)技术及生物信息学 (bioinformatics)技术筛选并克隆乙型肝炎病毒 (HBV)DNA聚合酶(DNAPolymerase)逆转录酶 (RT)区蛋白的反式调节新型靶基因 ,进一步阐明HBV感染相关疾病的发病机制。方法　以HBVDNA聚合酶RT基因的表达质粒pcDNA3 1( -) RT转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 1( -)为平行对照 ,提取mRNA并进行SSH分析。并应用分子生物学技术 ,结合生物信息学技术 ,克隆RT反式调节作用的新的靶基因。结果　对于所获基因片段序列分析表明 ,其中之一为新型基因片段。从HepG2细胞提取总RNA ,以逆转录多聚酶链反应 (RT PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列 ,并测序证实 ,因其可以被HBVDNA聚合酶逆转录酶RT反式激活 ,故命名为DNA多聚酶反式激活蛋白 1(DNAPTP1) ,已在GenBank中注册 ,注册号 :AY45 0 3 89。DNAPTP1基因的编码序列全长为 43 5个核苷酸 (nt) ,编码产物由 14 4个氨基酸残基 (aa)组成。结论　HBVDNA聚合酶逆转录酶RT在HBV进入宿主细胞的过程中起着重要的作用 ,最近的研究表明RT蛋白还具有反式激活的作用 ,上调宿主细胞某些基因的表达 ,从而改变宿主正常的免疫应答水平 ,引起病变。逆转录酶RT反式激活新靶基因的发现 ,为进一步研究RT蛋白的分子生物学机制和探索新型治疗     

分泌抗细粒棘球蚴单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

本文采用棘球蚴囊壁生发展制备抗原免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠脾细胞与骨髓瘤ＳＰ２／Ｏ进行细胞融合，经多次筛选克隆后建立了分泌抗细粒棘球蚴单克隆抗体细胞株Ｃ５Ｆ２Ｃ１１Ａ１１，Ｃ１２Ｃ１１Ｆ６Ｇ３，Ｃ１２Ｈ１２Ｆ８Ｄ５三株。应用ＥＬＩＳＡ及免疫组化法检测该三株具有特异性，培养上清分泌抗体滴度分别为１：２５６０，１：５１２０，１：５１２０。     

抗基孔肯雅病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞系及应用研究

用BALB/C小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)与经基孔肯雅(CHIK)病毒免疫后的BALB/C小鼠的B淋巴细胞进行融合,共获得11株能分泌抗CHIK病毒McAb杂交瘤细胞系。融合率为80.6％,阳性率为29.7％。经微量中和试验证明,11株McAb均具有抗CHIK原型及从棕果蝠与人体分离到的地方株CHIK病毒的中和抗体。血凝抑制试验(HI)及间接免疫荧光试验(IF)均为阳性,McAb培养上清效价前者为1:32～1:64,后者为1:40～1:80,McAb腹水效价前者1:2560～1:5120,后者1:2560～1:10240。11株McAb均为IgG2b亚类,具有明显的病毒特异性。     

分泌牛种布鲁氏菌单克隆抗体杂交瘤细胞A7的悬浮培养研究

牛种布鲁氏菌杂交瘤细胞Ａ７株分泌高中和性的牛种布鲁氏菌单抗ＩｇＧ１，该细菌被培养在Ｔｅｃｈｎｅ－Ｔ１０４ｇａｊｆ１．５升细胞培养装置中，此显示很低的机械剪切力。在悬浮培养时，Ａ７细胞密度可达１．２３×１０６＾６ｍｌ以上，单克隆抗体效价达１Ｌ５１２。     

三株分泌抗细粒棘球蚴囊液抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞的建立和初步鉴定

以羊肝细粒棘球蚴囊液抗原免疫BaLb/c鼠脾细胞与SP2/o骨髓瘤细胞常规方法融合。用人肝棘球蚴囊液抗原间接ELISA法检测,获得3株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株,2G_4、2F_1和2F_(10)。对人肝包囊液抗原ELISA的终点分别为1∶204800,1∶819200和1∶3200。对纯化羊肝包囊液抗原致敏羊血球IHA的终点均为1∶512,但3株单抗等量混合后IHA滴度达1∶4096。对猪囊尾蚴抗原的ELISA滴度分别为1∶4000、1∶2000和1∶2000。对泡球蚴抗原ELISA滴度分别为1∶2000、1∶1000和1∶2000。交叉阻断ELISA试验的结果初步显示此3株单抗可能识别不同的抗原表位。3株细胞在液氮中冻存两年复苏后,仍继续稳定分泌抗体。     

塔里木盆地子午沙鼠鼠疫F1抗体实验观察

目的 观察塔里木盆地子午沙鼠(Merione meridianus)实验鼠疫F1抗体形成情况.方法 用强毒鼠疫菌2101号感染子午沙鼠,按不同时间随机抽取5只采血,用微量IHA法检测鼠疫F1抗体,观察仔鼠体内母系抗体维持时间.结果 (1)子午沙鼠感染鼠疫菌后,第4d出现抗体,此后抗体滴度维持在1: 4～1: 32之间.抗体阳性率为82.5%(85/103);(2)母系抗体在仔鼠体内可维持4.5个月.结论 子午沙鼠鼠疫F1抗体形成时间早,抗体滴度偏低且较为集中(1: 4～1: 32),无明显高峰期和下降期,抗体持续时间长,阳性率较高;仔鼠体内的母系抗体至少维持4.5个月.这可为动物鼠疫调查或分析时提供有价值的参考依据.     

分泌抗包虫囊液抗原McAb杂交瘤细胞株的建立

应用Oriel法制备的包虫囊液抗原经腹腔注入供实验的小鼠,作为脾细胞供体。此脾细胞与不能分泌的骨髓瘤细胞株SP2/0和P3u_1相融合,以生成杂交瘤细胞株。用ELISA法从这些混合细胞培养基中筛选出上清液,用稀释法将上清液克隆,再克隆化之后,生成能分泌单克隆抗体、抗包虫囊液活性的杂交瘤,其染色体数目在80～100范围之内。单克隆抗体类及亚类13Fs和31G_(12)分别是IgG_1和IgA。DD和ELISA用于鉴定它们的敏感性和特异性。应用ELISA法比较杂交瘤和绦虫囊尾蚴液等其它寄生虫抗原制备物,包虫囊液和Pf抗原,表明单克隆抗体对包虫囊寄生虫有很高的特异性。     

鼠疫F1单克隆抗体建株过程中的动物免疫

目的探讨在建立抗鼠疫F1抗原的单克隆抗体杂交瘤株的过程中抗原免疫的剂量及免疫方法.方法采用F1抗原常规免疫、改良的F1抗原脾内注射免疫以及EV菌免疫3种方法免疫6～8周龄,体重为10～20g,健康的雌性BALB/c小鼠,并用间接ELISA法检测尾血中的抗体. 结果在常规免疫中,200μg 组和100μg组免疫效果优于50μg组,而200μg组和100μg组免疫效果基本一致;改良的F1抗原脾内注射免疫,血中抗体效价较高;EV菌免疫的效果不理想. 结论用F1抗原常规免疫小鼠,免疫剂量用100μg/只较为合适;若要缩短免疫时间,采用改良的脾内注射免疫法是理想的选择.     

鼠疫间接血凝微量检测技术的改进与应用

目的 建立一种简便的鼠疫血清学间接血凝微量法.方法 以常规鼠疫间接血凝试验试管法和微量法为基础进行改进.结果 改进后的鼠疫间接血凝试验微量法无论在实验室,还是现场应用结果均与试管法一致,但从操作上更为简便、快速,结果判定客观清晰、易于质控,每次检测血清用量仅10μL,试剂耗材节省.结论 改进后的鼠疫血清学间接血凝微量法可替代常规鼠疫间接血凝试验试管法和微量法.