细胞周期素D1反义脱氧寡核苷酸对A549细胞增殖及凋亡的调控作用

提要:目的探讨脂质体转染细胞周期素D1(cyclinD1)反义脱氧寡核苷酸链(antisenseoligodeoxynucleotide,ASON)对A549细胞增殖及细胞周期的影响。方法采用脂质体转染技术将cyclinD1ASON转入A549细胞培养,用MTT法检测细胞生长状况,应用流式细胞术(FACS)、检测细胞DNA梯形带等方法观察细胞凋亡及RT PCR法检测cyclinD1蛋白的表达。结果脂质体转染cyclinD1ASON组和单纯cyclinD1ASON组的A549细胞存活率较对照组显著降低(P<0.01)。脂质体转染cyclinD1ASON组cyclinD1表达水平(32%)较对照组(83%)明显减低(P<0.01),并能检测出DNA断裂。结论脂质体转染cyclinD1ASON能在体外明显抑制肺腺癌细胞的生长,且有诱导细胞凋亡、抑制细胞内cyclin D1合成的作用,可能会成为基因治疗的一个新靶点。     

反义c-myc寡核苷酸对大鼠气道平滑肌细胞周期的阻滞作用

目的: 观察反义c-myc寡核苷酸对大鼠气道平滑肌细胞周期的影响. 方法: 大鼠气道平滑肌细胞原代培养后,以Lipofectin将反义、正义和错配c-myc寡核苷酸导入平滑肌细胞,流式细胞技术检测细胞周期,免疫组织化学方法检测cyclin D1和cyclin E的表达. 结果: 反义c-myc寡核苷酸可明显抑制大鼠气道平滑肌细胞通过S期,正义及错配c-myc寡核苷酸对细胞周期无明显影响;反义c-myc寡核苷酸抑制了大鼠气道平滑肌细胞cyclin D1和cyclin E的表达. 结论: 反义c-myc寡核苷酸可抑制大鼠气道平滑肌细胞通过S期,抑制cyclin D1和cyclin E 的表达.     

汉坦病毒感染对体外培养的内皮细胞细胞周期素表达的影响

为研究汉坦病毒感染对体外培养的脐静脉内皮细胞细胞周期素E(cyclin E)和细胞周期素D 1(cyclin D 1)表达的影响,用重型、中轻型肾综合征出血热患者及正常人血清感染体外培养的脐静脉内皮细胞,应用ABC免疫组化染色方法和多媒体彩色病理图文分析系统定量分析感染汉坦病毒后内皮细胞周期素表达的变化.结果显示重型组内皮细胞中cyclinE、cyclinD1的表达均明显低于阴性对照组和中轻型组;中轻型组细胞cyclinE和cyclinD1的表达与阴性对照组间均无明显差异(P＞0.05).提示汉坦病毒对血管内皮细胞有直接致病变作用,可减慢细胞周期,抑制细胞增殖,此作用与病毒毒力大小密切相关.     

甘草单体新甘草酚对肝癌细胞HepG2细胞增殖的抑制作用

目的 探究甘草单体成分新甘草酚对人肝癌细胞系HepG2增殖作用的影响。方法 低（10μM）、中20μM）、高（40μM）剂量新甘草酚培养HepG2细胞24 h,PBS作为空白对照,索拉非尼作为阳性对照,CCK8细胞增殖实验检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期,荧光定量PCR（real-time quantitative PCR,RT-PCR）检测cyclin D1、cyclin A mRNA表达水平,蛋白印记（Western Blot,WB）检测PI3K-Akt信号活化。结果 低（10μM）、中20μM）、高（40μM）剂量新甘草酚对HepG2细胞增殖均具有抑制作用（P＜0.05）;细胞周期实验表明新甘草酚减少G0/G1期细胞（P＜0.05）,增加G2/M期细胞（P＜0.05）,抑制DNA复制和减数分裂过程;RT-PCR结果显示,新甘草酚抑制细胞周期相关蛋白cyclin D1、cyclin A 转录水平的表达;WB结果表明新甘草酚抑制PI3K-Akt信号活化。结论 新甘草酚可能通过抑制PI3K-Akt信号活化,抑制了细胞周期蛋白cyclin D1、cyclin A表达,从而对HepG2细胞的增殖起到抑制作用。     

丙型肝炎病毒核心蛋白对肝癌细胞stat3通路及细胞周期蛋白cyclin D1的调控作用

[目的]探讨丙型肝炎病毒核心蛋白(HCVc)是否调控肝癌细胞中stat3通路及细胞周期蛋白cyclin D 1的表达,参与肝癌细胞的恶性生物学行为.[方法]将含HCVc基因的真核表达质粒pEGFP-N3-HCVc瞬时转染人肝癌细胞HepG2使HCVc过表达,用siRNA-HCVc敲除HepG2细胞中HCVc的表达,荧光显微镜检测绿色荧光蛋白(GFP)的表达,Western blot检测HCVc、总stat3(stat3)、磷酸化stat3(p-stat3)及cyclinD1蛋白的表达;流式细胞术及MTT法检测细胞周期变化及细胞增殖情况.[结果]Western blot结果显示,通过瞬时转染而过表达HCVc的HepG2细胞中,HCVc、p-stat3及cyclinD1的蛋白水平高于空白质粒转染组和未转染组;siRNA-HCVc敲除HCVc表达后,HCVc、p-stat3和cyclin D1蛋白的表达下调;酪氨酸磷酸化抑制剂AG490(JAK2特异性拮抗剂)处理可下调过表达HCVc的HepG2细胞中p-stat3和cyclin D1蛋白的表达.流式细胞术显示过表达HCVc可促进细胞向G2/M期进展.MTT法结果显示过表达HCVc使HepG2细胞增殖能力增加.[结论]HCVc可活化HepG2细胞中stat3通路,调控细胞周期蛋白cyclinD1的表达,促进细胞周期进展及细胞增殖,可能与肝癌的发展有关.     

漆树酸对人前列腺癌细胞 LNCaP 细胞周期的影响及机制

目的：观察漆树酸对人前列腺癌细胞 LNCaP 细胞周期的影响并分析其机制。方法人前列腺癌细胞 LNCaP 经漆树酸处理后,MTS 法观察不同时间、不同浓度的漆树酸对细胞增殖率的影响,流式细胞术分析细胞周期变化,Western blot 方法观察漆树酸作用后细胞周期相关因子 CDK4、CDK6、cyclin D1和 P27蛋白水平的表达变化。结果（1）漆树酸时间和浓度依赖性地抑制细胞增殖;（2）经漆树酸处理后的细胞出现生长抑制,细胞主要阻滞在 G0／G1期;（3）漆树酸作用细胞后,CDK4、CDK6、cyclin D1蛋白表达水平低于溶剂对照组,而 P27蛋白表达水平高于溶剂对照组。结论漆树酸可抑制 LNCaP 细胞增殖,其机制可能是与细胞周期相关蛋白 P27的上调, CDK4、CDK6、cyclin D1表达下调有关,导致细胞阻滞在 G0／G1期。     

肾小球系膜细胞中β1整合素表达及细胞凋亡与N-糖链抑制剂关系的研究

目的观察N-糖链抑制剂衣霉素（TM）对肾小球系膜细胞（GMC）增殖、凋亡的影响以及β1整合素和cyclin D1表达在细胞凋亡以及细胞增殖中的作用。方法体外培养的大鼠GMC分四组：正常对照组,0．5、1．0和2．0μg／mL衣霉素组。采用流式细胞技术测定β1整合素水平和细胞凋亡率,细胞免疫化学方法测定cyclin D1表达,MTT法测定细胞增殖能力。结果TM作用以后,细胞β1整合素水平降低,细胞凋亡率增加,同时细胞周期正调控蛋白cyclin D1表达下降,增殖能力降低,这种作用呈剂量依赖性。结论N-糖链抑制剂TM通过抑制β1整合素的表达,影响细胞的粘附而导致细胞凋亡,并影响细胞周期正调控蛋白cyclin D1表达,使细胞增殖能力受抑,这种作用呈剂量依赖性。     

三氧化二砷对人肝癌细胞周期相关基因表达的影响

目的研究三氧化二砷(As2O3)对人肝癌SMMC-7721细胞周期的阻滞作用及相关基因的表达.探讨As2O3抗肝癌作用的机理.方法体外培养人肝癌细胞株SMMC-7721,用2μmol/L As2O3处理72h,流式细胞仪检测细胞周期变化;通过免疫细胞化学检测cyclin D1、PCNA基因编码蛋白的表达.结果 As2O3使SMMC-7721细胞周期阻滞在G0/G1期.与对照组比较,经As2O3作用的人肝癌细胞cyclin D1、PCNA基因编码蛋白的表达减少.结论 As2O3 通过干扰细胞周期的进程,下调cyclinD1、PCNA基因编码蛋白的表达,抑制肿瘤的增殖和转移,从而具有抗肿瘤的作用.     

细胞周期素D1shRNA表达载体的构建及其对A549细胞增殖的影响

目的 构建针对细胞周期素D1(cyclinD1,由CCND1基因编码)的shRNA表达载体,筛选出有效序列,观察其对肺腺癌A549细胞增殖的影响.方法 设计针对cyclin D1基因编码区的3条寡核苷酸链,体外退火后克隆入干扰栽体Pgenesil-1中,对重组质粒进行酶切分析和DNA序列测定.以脂质体法将空载体Pgenesil-1-K和3个重组质粒Pgenesil-1-CCND11、Pgenesil-1-CCND12、Pgenesil-1-CCND13分别导人549肺腺癌细胞,48 h后用Real time PCK和Western blotting技术检测各实验组肺腺癌细胞内cycli D1 mRNA及蛋白的表达情况,用流式细胞仪检测细胞周期观察构建的载体对A549细胞增殖的影响.结果 经酶切鉴定及DNA测序,重组质粒中已插入了目的 基因片断.转染cyclin D1-shRNA的A549细胞48 h后测定cyclin D1 mRNA和蛋白含量.以Pgenesil-1-CCND13抑制cyclin D1 mRNA及蛋白表达效果最为有效.其抑制率分别为62%和60%,而且它能抑制A549细胞的增殖.结论 成功构建了针对cyclin D1的RNA干扰表达载体Pgenesil-1-CCND11、Pgenesil-1-CCND12、Pgenesil-1-CCND13,Pgenesil-1-CCND13能有效抑制cyclin D1在A549细胞中的表达,并抑制A549的增殖,为进一步应用于肺腺癌的治疗实验研究奠定了基础.     

三氧化二砷对A549细胞周期及cyclin D_1基因表达的影响

目的：研究三氧化二砷（arsenic trioxide,As2O3）对肺腺癌A549细胞株细胞增殖、细胞周期以及cylin D1基因表达情况,初步探讨As2O3对肺腺癌细胞增殖的影响及其机制。方法：分别以不同浓度的As2O3作用于A549细胞,作用不同时间后,对细胞增殖活性、细胞周期及cylin D1基因表达的情况进行检测。结果：稍高浓度（〉2μmol/L）的As2O3可抑制A549细胞增殖,并有剂量和时间依赖性,As2O3可抑制A549细胞由G1期进入S期。逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测cylin D1基因转录水平和细胞爬片免疫组化检测cyclin D1基因蛋白表达的相对强度,发现As2O3作用组cyclin D1基因表达与对照组相比明显减低（P〈0.01）。结论：As2O3可有效抑制A549细胞增殖,抑制效应呈量效和时效关系,并且能阻碍细胞周期由G1进入S期,这一过程可能与As2O3抑制cyclin D1基因表达有关。     

Cyclin D3正、反义表达质粒在淋巴瘤细胞系Raji中的转染与鉴定

目的 :构建人类cyclinD3正义和反义真核表达质粒 ,分别转染到淋巴瘤细胞系Raji细胞中 ,为探讨cyclinD3基因对淋巴瘤细胞生物学行为的影响提供研究基础。方法 :以Raji细胞总RNA为模板 ,通过RT -PCR获取cyclinD3全长cDNA ,克隆入 pGEM -T载体 ,再亚克隆到真核表达载体pcDNA3 .1中 ,构成含cyclinD3的表达质粒 pcD NA3 -cyclinD3。再运用DNA重组技术将cyclinD3基因反向克隆到pcDNA3 .1中 ,构建成cyclinD3反义表达质粒pcDNA3 -ascyclinD3。用脂质体介导的基因转染方法 ,将cyclinD3正、反义表达质粒和空质粒分别导入Raji细胞 ,经G418筛选建立稳定转染细胞株 ,用WesternBlot方法鉴定cyclinD3基因的表达。结果 :酶切鉴定和测序分析证实 ,实验成功构建了cyclinD3正、反义表达质粒。与转染cyclinD3正义表达质粒和空质粒的细胞相比 ,转染cyclinD3反义表达质粒的Raji细胞中cyclinD3表达水平下降。 结论 :正、反义cyclinD3在淋巴瘤细胞中的转染和表达 ,为进一步研究cyclinD3在淋巴瘤细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡中的作用奠定了基础     

HMGB1对人肝癌细胞株HepG2体外增殖的影响

目的：观察HMGB1对人肝癌细胞株HepG2增殖的影响并初步探讨其可能机制。方法：采用不同剂量(0,10,50,100 ng/mL)重组HMGB1(rHMGB1)刺激HepG2细胞24 h,用MTT法检测HepG2细胞增殖,Western印迹和RT PCR法检测cyclin D1,PCNA的表达。结果：不同剂量(10,50,100 ng/mL)rHMGB1组HepG2细胞增殖能力均明显高于对照组（P＜0.05）。HMGB1抗体（20 μg/mL）能中和HMGB1(10ng/mL)对HepG2细胞的促增殖作用（P＜0.05）。Western印迹和RT PCR显示,与对照组比较,HMGB1能明显促进HepG2细胞PCNA,cyclin Dl蛋白和mRNA的表达（P＜0.05）,HMGB1抗体能明显抑制HMGB1上调PCNA,cyclin Dl蛋白和mRNA的表达（P＜0.05）。结论：HMGB1可能通过上调cyclin Dl和PCNA表达,促进HepG2细胞增殖。HMGB1抗体对肝细胞癌可能有治疗作用。     

脂质体介导Cyclin D1干扰RNA对人肝癌细胞株HepG2全细胞蛋白质组表达的影响

目的探讨CyclinD1干扰RNA对人肝癌细胞株HepG2细胞中CyclinD1mRNA的表达、对细胞周期和增殖以及蛋白质组表达变化的影响。方法构建CyclinD1干扰RNA的重组质粒pU6-CyclinD1-siRNA,并设立阴性对照空载体转染组和空白对照组。采用脂质体介导转染肝癌细胞株HepG2细胞,经G418筛选阳性转染细胞克隆,流式细胞术、MTT法检测其细胞周期、细胞生长曲线的改变;反转录PCR法及双向凝胶电泳．质谱技术比较转染前后CyclinD1mRNA的表达和蛋白质组表达的变化。结果（1）成功构建了CyclinD1干扰RNA的重组质粒pU6．CyclinD1．siRNA。并获得稳定转染组细胞HepG2-CyclinD1siRNA。（2）稳定转染组细胞与阴性对照组细胞和空白对照组相比,CyclinD1mRNA表达水平降低。细胞周期明显改变,从G1期到s期发生阻滞。（3）通过双向电泳-图像分析-质谱技术得到稳定转染组低表达蛋白6个,经数据库搜索分别是锌指蛋白ZFP-36、角蛋白19、热休克蛋白伴侣素10、波形蛋白、肿瘤拒绝抗原gp96、未知蛋白。这些蛋白与细胞的增殖、细胞凋亡的信号转导调节、以及肿瘤的发生、发展等相关。结论CyclinD1干扰RNA可明显降低肝癌HepG2细胞CyclinD1mRNA的表达,亦可阻滞肝癌HepG2的细胞周期,抑制细胞增殖;CyclinDI干扰RNA干扰后差异表达的蛋白质涉及细胞的增殖、细胞凋亡的信号转导调节、以及肿瘤的发生、发展。     

Vitamin C Inhibits Benzo[a]pyrene-lnduced Cell Cycle Changes Partly via Cyclin D1/ E2F Pathway in Human Embryo Lung Fibroblasts

Objective To study the molecular mechanism of the inhibitory effects of vitamin C on benzo[a]pyrene （B[a]P）-induced changes of cell cycle in human embryo lung fibroblast （HELF） cells. Methods The stable transfectants, HELF transfected with antisense cyclin D1 and antisense CDK4, were established. Cells were cultured and pretreated with vitamin C before stimulation with B[a]P for 24 h. The expression levels of cyclin DI, CDK4, E2FI, and E2F4 were determined by Western blot. Flow cytometric analysis was employed to detect the distributions of cell cycle. Results B[a]P significantly elevated the expression levels of cyclin D 1, E2F1, and E2F4 in HELF cells. Vitamin C decreased the expression levels of cyclin D 1, E2F1, and E2F4 in B [a]P-stimulated HELF cells. Dose-dependent relationships were not found between the different concentrations of vitamin C （10, 100, 500, 1000, and 5000 lamol/L） and the expression levels of cyclin D 1, E2F1, and E2F4 in HELF cells. The expression levels of cyclin D1, E2FI, and E2F4 in B[a]P-treated transfectants were lower than those in B[a]P-treated HELF cells. The expression levels of cyclin DI and E2F4 treated with vitamin C and antisense cyclin D1 were decreased compared with those treated with antisense cyclin DI alone. The effects of vitamin C combined with antisense CDK4 on the expression levels of cyclin DI and E2FI/E2F4 were similar to those of antisense CDK4 alone. B[a]P progressed HELF cells from GI to S phase. Both vitamin C and antisense cyclin DI suppressed the changes of cell cycle progressed by B[a]P. However, antisense CDK4 did not attenuate the above changes. Vitamin C combined with antisense CDK4 markedly suppressed B[a]P-induced changes of cell cycle as compared with antisense CDK4. But the inhibitory effects of vitamin C combined with antisense cyclin DI on B[a]P-induced changes of cell cycle were similar to those of vitamin C alone or antisense cyclin DI alone. Conclusions B[a]P progressed HELF cells from G1 to S phase via intracellular signaling pathway of cyclin D I/E2F. Vitamin C may modulate this signaling pathway to protect cells from injury caused by B[a]P.     

稳定转染维生素D受体反义cDNA的人骨肉瘤细胞系的建立

目的：建立稳定转染维生素D受体（VDR）反义cDNA的人骨肉瘤细胞系,方法：构建VDR反义cDNA的真核表达载体,用Lipofectamine法转染人骨肉瘤细胞系HOS－8603,经G418筛选后获得稳定转染细胞株,并用免疫组化技术检测内源性VDR蛋白折表达情况,采用瞬时转染报告基因技术从靶基因水平检测VDRas3细胞内VDR的转录激活功能,结果“筛选出6株抗G418细胞克隆（VDRas1-6),其中VDRas3细胞内源性VDR蛋白的表达量低于对照细胞,激素作用72h后,对照组细胞的报告基因氯霉素乙酰转移酶（CAT）转录活性增加约3．5倍,而VDRas3细胞CAT的转录基本不受激素诱导。结论：获得了稳定转染VDR反义cDNA的细胞系,为今后进一步研究1,25（OH）2D3及其类似物调节细胞增殖分化的分子机制提供了一个良的细胞模型。     

Musashi1正调控肝细胞癌细胞的生长并促进其增殖

目的 Musashi1（MSI1）属于RNA结合蛋白（RBP）家族,可特异性地结合mRNA并对蛋白质的翻译起激活或抑制作用,但它在肝细胞癌（HCC）中的功能还未被深入探究。本课题主要探讨MSI1在HCC细胞生长及增殖中的作用及机制。方法 构建MSI1过表达或敲除细胞系。采用免疫组化和Western blot技术检测MSI1在HCC组织中的表达。采用MTT、流式等方法探讨过表达或沉默MSI1对HCC细胞增殖、细胞活力及细胞周期分布的影响,同时检测细胞内PCNA、Cyclin D1以及Wnt/β-catenin通路关键分子APC和β-catenin的表达。结果 MSI1在HCC组织中的表达比非肿瘤的癌旁组织高。与对照细胞相比,HepG2细胞过表达MSI1不仅显著促进了其生长（7 d时的MTT值从0.52±0.12大幅增加至1.01±0.14,P<0.01）,且处于G0/G1期的细胞比率也从（58.42±3.18）%降至（40.67±1.22）%,而S期细胞比率则从（28.51±1.93）%增加至（40.06±1.92）%（P<0.01）。与此同时,细胞PCNA和Cyclin D1蛋白的表达明显上调。反之,敲除MSI1使Huh7细胞的生长显著受抑,更多细胞停滞于G0/G1期（G0/G1期细胞比率从（43.83±1.57）%增加至（62.84±1.22）%（P<0.01）,同时细胞PCNA和Cyclin D1的表达则显著下调。MSI1的过表达可以降低Wnt/β-catenin信号通路分子APC但增加β-catenin的表达,反之MSI1的敲低却可以增加细胞内APC而降低β-catenin的表达。结论 MSI1可以通过正调控HCC细胞的生长及细胞周期的进程而加速HCC病程的进展,其作用可能是通过激活Wnt/β-catenin信号通路实现的。