CVB3非结构蛋白3A与TMED4相互作用对细胞凋亡的研究

【立论依据】 CVB3属于小RNA病毒科肠道病毒属,能引起包括病毒性心肌炎、无菌性脑膜炎、胰腺炎等多种严重的疾病;目前,CVB3感染引起病毒性心肌病我们尚无特效药物用于临床治疗,也没有合适的疫苗用于预防。3A是CVB3主要的非结构蛋白,参与形成病毒复制复合体的骨架蛋白及抑制内质网至高尔基体的物质转运,但其如何与宿主细胞内蛋白相互作用以及对宿主的致病机制仍不清楚。本课题的前期工作中,以CVB3病毒3A为诱饵、运用酵母双杂交系统从人心脏cDNA文库中筛出了多个阳性克隆,TMED4是7个阳性蛋白之一。相关文献报道,TMED4在细胞的凋亡中起促进作用,而TMED4表达的沉默,不仅可以促进HSP70的表达,也提高了HSP70和Apaf-1的结合能力,从而对细胞的凋亡起到了抑制作用。 【设计思路】 3A是否在细胞凋亡中有作用;进一步论证3A与TMED4存在相互作用;是否是3A和TMED4的相互作用影响了细胞凋亡。 【实验内容】 Annexin V法分别检测pBudCE4.1-3A+brefeldin A、pBudCE4.1+brefeldin A比较两组细胞的凋亡情况;COIP、激光共聚焦显微镜观察进一步论证3A与TMED4存在相互作用及共定位;动物感染CVB3后蛋白质印迹法检测TMED4的表达;Annexin V法及蛋白质印迹等实验分别对pBudCE4.1-3A+shTMED4、pBudCE4.1-3A+Cont.shRNA两组细胞的凋亡情况和HSP70、caspase-3的表达情况进行检测和分析。Annexin V法及蛋白质印迹等实验中每一实验组及对照组均采取多组平行实验分别按0、6、12、18、24、30、36、42 h等不同时间进行相关实验操作。 【材料】 成年BALB/c小鼠,TurboFect,brefeldin A,TMED4 Antibody,HSP70 Antibody,caspase-3 Antiboody,TMED4 shRNA Plasmid等。 【可行性】 本课题理论依据充足可行;课题所采用的各项技术已较熟练的掌握;课题所需器材完备,资金充足。 【创新性】 本课题的前期研究基础具有原创性且实验设计方案均为本组成员独立完成;TMED4是一个新发现且研究尚不足的蛋白,我们的研究成果必然会丰富TMED4在细胞内的功能且关于CVB3 3A与TMED4的相互作用对细胞结构和功能影响机制的研究在国际上属于首次。     

褪黑素在病毒性心肌炎中的保护作用

目的 探讨褪黑素在柯萨奇病毒B3（Coxsackie virus B3,CVB3）感染的病毒性心肌炎小鼠中的保护作用,为病毒性心肌炎的治疗提供新的手段。方法 将64只5周龄的雄性BALB/c小鼠随机分为3 组：正常对照组、实验对照组、褪黑素组。以腹腔注射CVB3建立急性病毒性心肌炎模型,接种当天记为第0 天,24h后正常对照组、实验对照组每日分别经腹腔注射等量生理盐水,褪黑素组每日经腹腔注射溶于乙醇及生理盐水的褪黑素。分别于接种后第7天和第14天从各组随机抽取8只处死,留取心肌组织标本。用苏木素-伊红染色法观察心肌炎症病理改变,蛋白印迹法定量检测Bax、Bcl-2、Cleaved-caspase 9的蛋白水平表达,用免疫组织化学法检测心肌组织中Cleaved-caspase 3的表达量。结果 与正常对照组比较,实验对照组心肌炎症病理评分较高,Bax、Cleaved-caspase 9凋亡蛋白表达水平和Cleaved-caspase 3表达量上调,Bcl-2蛋白水平表达下调,给予褪黑素干预后心肌炎症病理评分降低,并可明显下调Bax、Cleaved-caspase 9凋亡蛋白表达水平和Cleaved-caspase 3表达量,上调Bcl-2蛋白表达水平。结论 褪黑素能够减轻心肌损伤,下调病毒性心肌炎小鼠心肌组织中Bax、Cleaved-caspase 3、Cleaved-caspase 9的表达和上调Bcl-2的表达,从而对病毒性心肌炎小鼠起到保护作用。     

MiR-124通过调控Smad4促进C6胶质瘤细胞凋亡的研究

【立论依据】 胶质瘤是中枢神经系统肿瘤中最常见的恶性肿瘤。由于外科技术难以做到病理学上的全切除,术后复发率非常高。在前期实验中我们发现C6胶质瘤细胞miR-124含量显著低于与正常大鼠大脑组织,且转染miR-124 后,C6胶质瘤细胞数明显减少。我们应用microRNA靶基因信息软件查到smad4的mRNA与miR-124-3p有3个结合位点,smad4可能是miR-124的靶基因。由此推测miR-124可能通过抑制smad4的蛋白表达对胶质瘤细胞起作用。 【设计思路】 本实验以大鼠C6胶质瘤细胞为研究对象,通过人为转染miR-124,分析其对smad4蛋白表达的影响,并确定smad4为miR-124新靶基因,从而探索miR-124对促进C6胶质瘤细胞凋亡的新作用机制。 【实验内容】 (1)通过qRT-PCR检测正常大鼠大脑、C6胶质瘤细胞、转染后的C6胶质瘤细胞中miR-124的表达水平。(2)转染外源miR-124观察C6胶质瘤细胞的生长状态。(3)结合蛋白质印迹和TUNEL assay方法,比较分析miR-124转染前和后C6胶质瘤细胞凋亡差异。(4)通过qRT-PCR检测比较分析转染miR-124 前后C6胶质瘤细胞中smad4 mRNA的表达变化。(5)用蛋白质印迹检测转染miR-124前后的C6胶质瘤细胞中Smad4表达变化。(6)以siRNA-Smad4 抑制smad4基因的表达后,再转染 miR-124 mimic,通过蛋白质印迹和细胞荧光染色方法比较分析细胞增殖的变化。 【材料】 C6胶质瘤细胞,Lipo2000脂质体,miR-124 mimic,实时PCR仪,超净台,孵箱,相差显微镜,荧光显微镜,PCR相关试剂,蛋白质印迹相关试剂,TUNEL assay试剂盒,Smad4抗体等。 【可行性】 前期研究已证实人工转染miR-124后其细胞数明显降低,smad4的蛋白水平下调;通过microRNA靶基因信息软件查到smad4可能是miR-124的另一个靶基因;项目组成员已熟练掌握研究所需要各种实验技术;实验设备齐全,具有完成上述实验的基本仪器设备。 【创新性】 我们将证明:miR-124通过抑制smad4的蛋白表达,调控smad4,抑制胶质瘤细胞的增殖且促进死亡。已有研究表明miR-124通过抑制靶基因STAT3 的蛋白表达对胶质瘤起作用,但目前尚无关于miR-124与 smad4之间作用关系的报道。     

p66Shc-线粒体信号通路在氧化低密度脂蛋白诱导的巨噬细胞凋亡中的作用

【立论依据】 氧化低密度脂蛋白(oxLDL)可经线粒体途径诱导巨噬细胞凋亡并影响动脉粥样硬化斑块稳定性,但具体的分子机制尚未阐明。近有研究显示:在人内皮细胞,oxLDL可通过激活蛋白激酶C-β(PKCβ)与c—Jun氨基末端激酶(JNK)从而使衔接蛋白p66^Shc发生磷酸化;另有文献报道:磷酸化的p66^Shc可转位到线粒体引起线粒体损伤。本实验旨在探讨p66^Shc-线粒体信号通路在oxLDL诱导的人巨噬细胞凋亡中的作用。 【设计思路】 本实验分两部分:第一部分拟证明oxLDL可促进巨噬细胞中p66^Shc的磷酸化及线粒体转位;第二部分拟证明p66^Shc磷酸化及转位在oxLDL诱导的线粒体损伤、线粒体凋亡途径中起重要作用。 【实验内容】 采用序列超速离心法分离健康人新鲜血浆LDL,继而用CuSO4氧化制备oxLDL;体外培养THP-1细胞(人外周血单核细胞)并用佛波酯诱导为巨噬细胞,蛋白质印迹法检测oxLDL对p66^Shc及胞浆和线粒体中磷酸化p66^Shc(Ser36)蛋白表达的影响;而后将细胞分为对照组、oxLDL组及oxLDL+SiRNAp66^Shc组,用流式细胞仪及荧光显微镜检测线粒体膜电位、线粒体内超氧阴离子及细胞凋亡的变化,蛋白质印迹法检测线粒体凋亡途径相关蛋白的表达。 【材料】 采用含10%FBS的高糖1640培养液培养细胞;采用Rhodamine 123染色检测线粒体膜电位,MitoSOX Red试剂盒染色检测线粒体内超氧阴离子,AnnexinV FITC 试剂盒双染检测细胞凋亡;采用p66^Shc、phospho-p66^Shc( Ser36)、细胞色素C、caspase-9等抗体检测相关蛋白的表达。 【可行性】 我们前期预实验结果显示oxLDL可加速p66^Shc磷酸化和线粒体损伤,且两者呈正相关,这为该假说的成立提供了有力证据;实验负责人跟随导师进行科研工作两年,已熟练掌握相关实验技术;本实验承担单位泰山医学院动脉粥样硬化研究所具备实验所需全部仪器设备,实验条件完善。 【创新性】 本实验首次研究p66^Shc在oxLDL诱导的人巨噬细胞线粒体凋亡中的作用,可进一步阐明p66^Shc与AS发生发展的关系,从而为AS的防治锁定新靶点。     

致婴幼儿腹泻星状病毒非结构蛋白诱导宿主细胞凋亡的分子机制

星状病毒(human astrovirus,HAstV)是导致婴幼儿腹泻的重要病原体,发病率高,易造成群体感染,威胁公共卫生安全。目前HAstV导致腹泻的致病机制尚不明确。本研究前期工作基础表明HAstV非结构蛋白nsP1a能够诱导细胞凋亡,是病毒诱发腹泻的主要原因。基于前期研究结果,本研究以nsP1a蛋白为研究对象,深入探讨nsP1a诱导细胞凋亡的能力及信号通路,并筛选鉴定nsP1a蛋白诱导细胞凋亡的关键结构域。【立论依据】 文献表明,病毒诱导的腹泻大多与小肠上皮细胞凋亡密切相关。前期研究表明HAstV野毒株能诱导Caco-2细胞凋亡,非结构蛋白nsP1a起到主要作用。基于前期实验结果,本研究深入开展nsP1a诱导Caco-2凋亡的分子机制研究。 【设计思路】 以nsP1a蛋白为研究对象,探讨nsP1a蛋白诱导细胞凋亡的分子机制,明确nsP1a蛋白诱导的凋亡是通过何种途径发挥作用;筛选鉴定nsP1a蛋白促凋亡作用的关键结构域。 【实验内容】 构建nsP1a蛋白真核表达载体转染宿主细胞,建立稳定表达细胞株。采用流式细胞技术检测蛋白诱导细胞凋亡的能力。实时定量及蛋白质印迹法检测细胞caspase3、caspase8、caspase9、FADD蛋白、Bcl-2、Bax的表达变化。综合分析受体途径和线粒体途径参与诱导细胞凋亡的机制。构建nsP1a蛋白不同位点的删除突变体,流式细胞仪分析筛选nsP1a蛋白中诱导细胞凋亡的主要结构域。 【材料】 载体pEGFP-N3,Caco-2细胞, Lipofectamine 2000, caspase3、6、8、9,细胞色素C、FADD、PARP、LaminA/C,EGFP抗体等。 【可行性】 本研究由国家自然基金青年基金项目(81201285)及辽宁省大学生创新创业训练计划项目(201210160005)支持。 【创新性】 本研究内容国内外未见报道。本研究为探明nsP1a蛋白参与的星状病毒致腹泻机制提供理论依据,同时也为星状病毒抗腹泻药物的筛选提供有效靶点。     

丝氨酸缺乏和p53依赖的代谢重构对乳腺癌细胞的影响

【立论依据】 丝氨酸对肿瘤细胞增殖具有重要作用。丝氨酸缺乏可导致肿瘤细胞氧化应激,对其增殖产生抑制。肿瘤抑制基因p53在抗氧化代谢中发挥不可或缺的作用,因此p53可帮助肿瘤细胞耐受丝氨酸缺乏。这与p53的抑癌功能是一对矛盾,利用此矛盾可为肿瘤治疗提供新的思路。 【设计思路】 选取p53突变或缺失的三阴性乳腺癌细胞系,给予丝氨酸缺失的培养环境,观察其增殖情况、相关基因和蛋白表达情况。以p53阳性的乳腺癌细胞和正常培养基作对照 【实验内容】 MDA-MB-157(P53 null)或HCC1937(P53 mutant)分别用不含丝氨酸的培养基(-SG)、加入丝氨酸的-SG、加入丙酮酸和GSH的-SG,进行72 h培养,每24 h用流式细胞仪检测细胞数量、细胞周期和细胞内ROS水平,酶标仪检测抗氧化能力、GSH和GSSG水平,Real-time PCR检测P53、PHGDH的mRNA转录,蛋白质印迹检测p53、PHGDH的蛋白表达。MCF-7(P53 wildtype)作为P53的阳性对照。 【材料】 MCF-7、MDA-MB-157或HCC1937、MEM培养液(HyClone SH30024)、丝氨酸、丙酮酸、GSH,相关的试剂盒和试剂。 【可行性】 已进行预实验,已实践过实验内容中提及的操作,已观察到MCF-7在丝氨酸缺乏时增殖先受抑制后恢复、细胞内ROS水平上升、PHGDH表达上升 【创新性】 p53对肿瘤细胞代谢的影响已成为研究热点。多数肿瘤中近一半存在p53基因的突变,丝氨酸在肿瘤增殖中的重要地位,使得丝氨酸、p53以及相关的信号调节通路和酶可能成为肿瘤治疗的新靶点。     

去乙酰化酶SIRT1调控PFOA诱导小鼠肝损伤的作用及机制研究

【立论依据】 流行病学调查发现,全氟辛酸(PFOA)和人类多种疾病密切相关。我们前期研究发现PFOA可通过氧化应激、炎症反应和诱导凋亡引起小鼠肝脏毒性损伤。去乙酰化酶SIRT1在细胞应激反应中具有关键作用,可引起多种转录因子去乙酰化,从而促进细胞存活,抑制凋亡。因此,我们提出:“SIRT1的去乙酰化修饰可能对PFOA诱导的小鼠肝损伤起保护作用”。 【设计思路】 在前期研究的基础上,探讨PFOA肝脏毒性与SIRT1表达和反应活性的相关性;利用SIRT1激活剂以及SIRT1抑制剂观察SIRT1信号通路对PFOA诱导的肝脏毒性损伤的调控作用;通过检测P53、NF-κB p65 和FOXO3a的表达和乙酰化水平,分析SIRT1系统调控PFOA肝脏毒性的分子机制,是否与SIRT1对P53、NF-κB p65 和FOXO3a的去乙酰化修饰有关。 【实验内容】 (1)Real-time PCR和蛋白质印迹方法检测SIRT1的表达,免疫共沉淀法检测SIRT1的反应活性,对比正常对照和PFOA染毒小鼠,明确PFOA肝脏毒性与SIRT1的相关性;(2) PFOA染毒小鼠给予SIRT1激活剂SRT1720以及SIRT1抑制剂尼克酰胺,石蜡切片HE染色观察肝组织病理学改变;全自动生化分析仪检测ALT、AST、ALP及LDH的血清水平;酶联免疫分析IL-6、COX-2及CRP的肝组织水平;免疫组化检测DNA氧化损伤标志物8-OHdG的产生;比色法检测MDA生成及SOD、CAT和GSH-PX的活性;TUNEL染色法观察细胞凋亡;real-time PCR和蛋白质印迹方法检测Bcl-2、Bax、Fas、FasL等凋亡相关基因的表达,明确SIRT1通路的激活或抑制对PFOA诱导肝脏损伤的调控作用;(3)应用乙酰化赖氨酸抗体通过蛋白质印迹方法检测P53、NF-κB p65 和FOXO3a的乙酰化水平,分析SIRT1是否通过对P53、NF-κB p65 和FOXO3a的去乙酰化修饰调控PFOA诱导的肝脏毒性损伤。 【材料】 本项目以小鼠为实验动物,实验仪器包括实时荧光定量PCR仪、全自动DNA扩增仪、紫外可见分光光度计、石蜡切片机、高速低温离心机、蛋白电泳系统、电转仪、全自动生化分析仪等。 【可行性】 本项目充分分析了国内外研究现状和发展前景,并取得了较好的前期研究基础。 【创新性】 SIRT1对PFOA肝脏毒性的调控作用尚未见报道,本实验项目研究SIRT1对PFOA诱导肝损伤的保护作用及其分子机制,为预防和治疗全氟化合物引起的肝脏损伤寻找新靶点。     

去细胞肝支架诱导大鼠损伤肝脏再生的研究

【立论依据】 基于结合国内外对肝脏去细胞的研究及前期的基础,利用肝脏去细胞支架在体内诱导损伤肝组织的修复与再生。以解决肝功能衰竭供体缺乏,在外科手术后损失修复与再生的空缺。 【设计思路】 制造肝损伤模型研究去细胞支架对于肝脏损伤修复及再生的作用。 【实验内容】 通过外科手术造成大鼠肝脏损伤,移植去细胞支架修补创面;检测去细胞基质内生长因子含量与移植后支架内细胞的类型;观测移植后肝脏形态及内部结构的改变与蛋白表达情况。 【材料】 去细胞肝脏支架。 【可行性】 去细胞支架相较于其他生物材料具有完全模拟机体细胞的生存环境;去细胞支架含有的一系列黏附分子及生长因子是细胞与组织再生的关键因素;运用去细胞支架体外培养细胞已初具成效。 【创新性】 相较国外针对去细胞支架的体外研究,体内移植能模拟真正的体内生理环境;运用新型生物材料修复肝损伤。     

Cx43形成的GJIC在NGF诱导PC12细胞神经元样分化中作用的研究

【立论依据】 在神经系统的发育和修复过程中,神经元间的细胞通讯在细胞的静息、增殖、分化和凋亡过程的发生发展中发挥着重要作用。细胞间通讯有缝隙连接、膜表面分子接触通讯和化学通讯三种方式,而缝隙连接(GJ)是细胞间直接通讯的唯一方式。缝隙连接蛋白(connexin)是GJ结构和功能的基础,在缝隙连接蛋白家族中,Cx43在中枢神经系统的发育过程中发挥重要作用。功能性缝隙连接(GJIC)是通过缝隙连接在相邻细胞间传递氨基酸、离子、小分子等的一种通讯方式。研究表明,神经生长因子(NGF)可以促进Cx43磷酸化,同时可以诱导嗜铬细胞瘤PC12细胞分化而产生与交感神经元相似的神经元。但是Cx43形成的功能性缝隙连接(GJIC)在NGF诱导PC12细胞分化中的作用尚不清楚。因此,本研究拟阐述Cx43形成的GJIC在NGF诱导PC12细胞分化中的作用。 【设计思路】 本实验拟构建Cx43稳定转染的PC12细胞系,并检测Cx43形成的GJIC的功能。 NGF诱导PC12细胞和Cx43稳定转染的PC12细胞,分析Cx43形成的GJIC在NGF诱导PC12细胞神经元样分化过程中的作用,为神经损伤和修复提供新的研究靶点。 【实验内容】 (1)构建Cx43稳定转染的PC12细胞系;(2)实验分组:NGF诱导PC12细胞组,NGF诱导Cx43稳定转染的PC12细胞组,NGF诱导PC12细胞组+缝隙连接抑制剂(CBX),NGF诱导Cx43稳定转染的PC12细胞组+CBX;(3)形态学观察和NES免疫荧光细胞化学染色检测细胞分化率;(4)Dye Coupling检测Cx43形成的GJIC。 【材料】 PC12细胞;NGF;Cx43真核表达质粒;Cx43引物和抗体;CBX;NES单克隆抗体;FITC-IgG。 【可行性】 本研究前期研究工作通过形态学观察及Image软件测量显示在一定范围内,NGF量的增加可以有效提高PC12细胞的分化水平,课题组成员熟练掌握相关实验的方法和技术;研究室能提供相关的仪器和材料。实验思路清晰,实验过程明确。 【创新性】 本研究应用NGF诱导PC12细胞分化模型,探究Cx43形成的GJIC在NGF诱导PC12细胞分化过程中的作用,从而为神经损伤和修复提供新的研究依据和调控靶点。     

去乙酰化修饰调控瘦素诱导乳腺癌细胞增殖的分子机制

【目的】 研究去乙酰化修饰在瘦素(Leptin)诱导的乳腺癌细胞增殖过程中的调控作用。 【方法】 应用MTT法测定Leptin对乳腺癌MDA-MB-231细胞生长的诱导作用,并测定乳腺癌细胞活力、侵袭力及细胞周期的变化情况;实时定量PCR、蛋白质印迹法测定Leptin诱导后MDA-MB-231细胞周期关键因子及相关酶的表达情况;染色质沉淀法(ChIP)检测Leptin作用MDA-MB-231细胞后核心组蛋白H3、H4乙酰化水平变化情况。 【结果】 Leptin诱导乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖呈现时间和剂量依赖性,1.25 nm (20 mg/mL)、24 h为Leptin最佳作用浓度和孵育时间;经Leptin处理后,乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡明显减少、活力增强,同时由G₁进入S期的细胞显著增多;荧光显微镜观察发现Leptin诱导后BrdU荧光染色增强,且主要集中在MDA-MB-231细胞核内;Transwell小室侵袭实验也显示细胞侵袭力增强;实时定量PCR及蛋白质印迹法检测 发现Leptin处理后的 MDA-MB-231细胞中与G₁/S 期限制点调控相关的细胞周期调控因子CDK2、cyclin E1以及与抑制细胞凋亡有关的Bcl-2均显著增加,细胞中HDAC酶活性增强,且与细胞周期G₁/S 期调控密切相关的HDAC1 mRNA及蛋白表达水平也明显增强;ChIP 实验发现Leptin处理后的乳腺癌MDA-MB-231细胞中GAPDH 启动子区域核心组蛋白乙酰化水平显著降低,而经HDAC抑制剂SAHA阻断后MDA-MB-231细胞p21WAF 1/CIP 表达水平显著提高。 【结论】 Leptin通过HDAC1的去乙酰化修饰抑制p21WAF 1/CIP的表达,激活细胞周期关键因子CDK 2、cyclin E1的表达,从而加速乳腺癌细胞周期G₁/S 期的进程。     

Nesfatin-1对帕金森病模型多巴胺能神经元的保护作用及其机制研究

【立论依据】 帕金森病(PD)是一种严重危害中老年人健康的神经退行性疾病,但至今尚无有效的药物或方法能阻止或逆转PD的病情发展。Nesfatin-1是2006年发现的,由82个氨基酸组成的能够抑制摄食的脑肠肽。研究发现nesfatin-1可通过抗凋亡及抗炎机制发挥神经保护作用,但是nesfatin-1能否对多巴胺(DA)能神经元发挥保护作用尚不清楚。本室前期研究证实nesfatin-1能够改变DA能神经元的放电频率,因此,本研究拟在鱼藤酮制备的PD模型上,观察nesfatin-1对DA能神经元的保护作用,并探讨其机制。 【设计思路】 鱼藤酮是一种制备PD模型的环境毒素,是线粒体复合物I的特异性抑制剂,通过损伤线粒体途径导致细胞凋亡。因此本实验拟在鱼藤酮诱导的PD细胞和大鼠模型上,观察nesfatin-1对鱼藤酮诱导的线粒体功能损伤及其介导的细胞凋亡的影响,并进一步研究其分子机制,阐明nesfatin-1可能通过Gs-cAMP-PKA通路影响Bad蛋白的磷酸化水平从而发挥其保护线粒体及抗凋亡的作用。 【实验内容】 在鱼藤酮制备的PD细胞模型上,应用MTT法、流式细胞仪技术、激光共聚焦显微镜等方法,检测nesfatin-1对鱼藤酮所致的细胞存活率、线粒体复合物I的活性、线粒体跨膜电位差、活性氧、PKA蛋白水平、Bad蛋白磷酸化、线粒体细胞色素C的释放、caspase-3活性及细胞凋亡形态学变化的影响。此外,在鱼藤酮制备的PD大鼠模型上,应用免疫组织化学,蛋白质印迹、TUNEL染色等方法进一步研究nesfatin-1对黑质DA能神经元的保护作用。 【材料】 MTT、罗丹明123、H2DCFDA、PKA抗体、磷酸化Bad蛋白抗体、TH抗体(Sigma公司),细胞色素C单克隆抗体(Clontech公司),Caspase-3抗体凋亡试剂盒(BD公司),Hoechst33258(Beyotime公司),TUNEL试剂盒(Roche公司)。 【可行性】 前期研究已证实500 nmol/L鱼藤酮处理MES23.5细胞24 h后,细胞存活率降低,线粒体跨膜电位差降低,nesfatin-1预孵育能拮抗鱼藤酮诱发的改变。实验所在学科为国家生理学重点(培育)学科,具备完成实验所需实验技术和设备。 【创新性】 证实nesfatin-1对DA能神经元的损伤具有保护作用,并阐明了介导的细胞信号转导通路和分子机制,为研制新的预防和治疗PD的药物提供一定的实验依据。     

突变亨廷顿蛋白通过裂解钙反应性反式激活子CREST产生细胞毒性

【目的】 亨廷顿病(HD)基因突变后编码的突变亨廷顿蛋白(mHtt)通过干扰神经元的细胞周期,造成神经元死亡;钙反应性反式激活子(CREST)可促进神经元分化发育。本项目研究mHtt是否通过影响CREST而产生细胞毒性。 【方法】 应用免疫印迹、RT-PCR检测HD转基因小鼠(R6/2小鼠)和转染表达mHtt的小鼠成神经瘤细胞(N2a细胞)中CREST的蛋白和mRNA水平,应用生物信息学方法和缺失突变实验分析检测CREST中可能酶解位点,应用台盼蓝和PI染色检测细胞活力,以无血清培养进行神经细胞分化诱导,以N2a细胞突起生长长度反映其分化能力。 【结果】 在HD转基因小鼠大脑皮质、纹状体、海马内及转染表达mHtt的N2a细胞内,CREST蛋白水平明显降低,但其mRNA水平无显著改变,提示mHtt不影响CREST的转录表达,但可引起CREST翻译后水平的改变。在全长CREST(55 kDa)蛋白水平降低的同时,一个分子量在35 kDa左右的CREST裂解片段水平显著增加。生物信息学分析发现,CREST分子中不存在半胱氨酸蛋白酶(caspase)酶切位点,但存在多个可能的钙蛋白酶(calpain)酶切位点。在表达mHtt的N2a细胞用calpain活性抑制剂calpeptin处理后,35 kDa-CREST片段的产生减少,而全长CREST水平的降低被抑制。分别用HA和Flag标签对全长CREST蛋白的氨基端和羧基端进行标记,构建了HA-CREST-flag质粒,与表达mHtt的质粒共转N2a细胞后,发现35 kDa-CREST片段可以被Flag抗体检测到,而不能被HA抗体检测到;缺失132-139aa的CREST在表达mHtt的细胞中产生与对照细胞水平相近的35 kDa羧基末端片段,而其他缺失钙蛋白酶可能裂解位点的CREST在表达mHtt的细胞中仍产生高水平的35 kDa羧基末端片段。因此,被mHtt激活的钙蛋白酶主要在CREST的132-139aa部位对其进行裂解。对细胞活力的分析发现,在转染表达mHtt的N2a细胞中,过表达CREST可以显著降低台盼蓝和PI染色阳性的死细胞比率;过表达CREST还可显著纠正mHtt对N2a细胞突起生长的抑制。细胞活力分析和突起生长检测结果提示,mHtt对细胞的毒性和对分化的抑制与其降低CREST蛋白水平有关。 【结论】 mHtt在CREST 132-139aa处通过钙蛋白酶相关的蛋白裂解方式促进CREST的降解,引起CREST促神经元分化功能的降低而产生细胞毒性。该研究进一步揭示了HD的病理学机制,并为探索治疗HD的方法提供了新的线索。     

MNPs-exosomes联合载药系统的制备及其在肿瘤治疗中的可行性探索

【立论依据】 药物靶向输送系统在肿瘤治疗中至关重要。磁性纳米颗粒(MNPs)可在外磁场引导下使其负载药物定向于肿瘤组织,达到肿瘤化疗中低毒高效的目的。然而,它的非生物源性使它不能在体液和组织中稳定地存在。Exosomes是一种由体内多种细胞释放的、直径介于50~150纳米的微囊体。因不引起补体或凝血因子的激活,以及难以被单核巨噬细胞吞噬,故可以在体内稳定存在,也是药物的理想载体。但由于靶向性较弱,难以富集至肿瘤组织。 【设计思路】 本项目拟设计并制备MNPs-exosomes二者联合的载药系统,以达到优势互补的效果,并通过体内外实验探讨其是否具有协同效应,从而为构建肿瘤靶向给药系统提供一种新思路。 【实验内容】 (1)制备3种药物载体:MNPs、exosomes、MNPs-exosomes联合载药体;(2)将3种药物载体分别与药物结合:选用多柔比星;(3)体内外实验验证其靶向性;(4)体内外实验评价其治疗效果。 【材料】 RAW-264.7细胞、HEPG-2细胞、MNPs、四氧化三铁悬液、250nm二氧化硅粒子悬液、聚苯乙烯、甲苯。 【可行性】 本课题组已进行了制备MNPs-exosomes联合载药体的预实验,实验结果符合预期。在以往的研究中,我们已经掌握了进行上述实验所需要的技术和方法,具备一定的科研悟性和热情,可以完成此研究。 【创新性】 (1)首次提出将MNPs与exosomes联合载药,通过二者的优势互补,来观察联合体是否具有协同作用;(2)我们拟通过制作超小粒径分子筛分离提纯exosomes,避免了传统方法的弊端。     

具有抗氧化活性的含硒短肽的研制

【立论依据】 硒蛋白是微量元素硒发挥生物学功能的主要形式。人体中硒蛋白在抗氧化、抗肿瘤和调节免疫等方面都具有显著的作用,其中抗氧化活性是多种硒蛋白最核心的生物学功能。研制一种具有潜在应用价值的、类似于硒蛋白的抗氧化活性的含硒短肽具有重要意义。 【设计思路】 选取抗氧化活性最强的硒蛋白如硒蛋白P、谷胱甘肽过氧化物酶等,设计出3~5种含硒代半胱氨酸活性中心的硒蛋白截短型的短肽,根据硒蛋白基因表达的特殊性构建其表达载体及其哺乳动物细胞表达体系,实现此类含硒短肽的准确、高效的翻译,再通过抗氧化检测筛选出具有应用开发价值的短肽。 【实验内容】 (1)用于硒蛋白基因工程表达的哺乳动物细胞株的建立:选择在人类硒蛋白翻译过程中将编码硒代半胱氨酸密码子TGA正确解码时起着重要作用的3个反式作用因子,即SECIS 结合蛋白2(SBP2)、Sec特异延伸因子(EFSec)和核糖体蛋白L30(RPL30),将它们的编码基因分别克隆并构建为1个三基因表达载体pcDNA3.1-SBP2/Efsec/RPL30,稳定转染HepG2细胞系获得目的基因高表达的单克隆细胞株;(2)利用生物信息学的方法,筛选和设计硒蛋白截短型的短肽,并将其编码基因插入真核表达载体pcDNA4HisMaxB获得相应的重组载体;(3)利用各重组载体分别对已建立的转基因细胞株进行稳定转染,使目的基因表达并纯化获得含硒短肽;(4)利用常规的抗氧化检测方法,考察各种含硒短肽体外抗氧化活性,并筛选出最佳者用于后续研究。 【材料】 人肝癌细胞系HepG2;质粒pcDNA3.1、pcDNA4HisMaxB;各种基因工程工具酶及常规试剂;细胞培养及转染试剂;抗氧化检测试剂盒等。 【可行性】 硒蛋白复杂的翻译机制已经逐渐阐明,在原核生物细胞中利用反式作用因子提高硒蛋白表达已取得成功,为真核表达提供重要的启示,我们的设计在理论上是可行的;实验室相关技术方法及条件成熟,完全可满足本研究的要求。 【创新性】 具有抗氧化活性的硒蛋白分子量大限制了其药用价值,我们研究中将获得截短型的含硒短肽从而使其具有应用开发价值。此外,应用3个反式作用因子构建硒蛋白基因工程表达体系也是本研究的一个创新。     

TRPM2在机械性创伤引发单核细胞TNF-α过量产生中的作用及其机制

【立论依据】 车祸、地震等造成的机械性创伤(MT),可以造成心脑等重要器官的继发性损伤。前期的研究表明,MT引发的TNF-α过量产生是导致继发性心肌损伤的关键环节,然而其机制却不清楚。TRPM2是非选择性阳离子通道,在氧化应激情况下开放。由于单核细胞是产生TNF-α的主要细胞,故本课题以TRPM2为切入点,研究MT引发单核细胞TNF-α过量产生的机制。 【设计思路】 依次解决下述三个问题:(1)TRPM2在MT引发单核细胞TNF-α过量产生中是否发挥重要的作用?(2)TRPM2在MT引发TNF-α过量产生中的作用机制,主要观察通过TRPM2通道的开放是否与UCP2有关?(3)通过该通道内流的钙离子,是否通过ErK/NF-κB通路介导TNF-α的过量产生? 【实验内容】 (1)在培养的单核细胞液中,分别使用TRPM2通道阻断剂、Ca²⁺清除剂、相关溶剂和基因沉默技术,观察在培养液中添加创伤动物血浆(TP)引发的培养液中TNF-α浓度的变化;(2)使用TRPM2基因敲除鼠,观察MT造成的动物血浆中TNF-α浓度变化;(3)使用膜片钳和检测细胞内钙变化,从功能上观察在单核细胞上的TRPM2通道,是否参与TP引起的钙离子内流;(4)动物实验,观察MT后,UCP2的蛋白表达是否增强;使用UCP2抑制剂,观察MT后血浆TNF-α产生量的变化;(5)膜片钳观察,使用UCP2抑制剂,观察是否可抑制TP引起的单核细胞TRPM2通道开放和细胞内钙上升;(6)单核细胞培养,使用TRPM2阻断剂和siRNA基因沉默TRPM2,观察培养液中添加TP后,对ErK的表达、NF-κB的表达和核内移情况;(7)动物实验,观察TRPM2基因敲除鼠和对照鼠,创伤后ErK的表达、NF-κB的表达和核内移情况。 【材料】 使用雄性成年C57B16/J小鼠和TRPM2基因敲除鼠。 【可行性】 (1)申请人所在实验室具有完成上述实验的全部实验仪器,本课题组实验技术成熟,人员配备较好。(2)实验所用TRPM2基因敲除鼠可以从日本国立自然科学研究机构获得。 【创新性】 (1)以TRPM2为靶点,研究其在MT引发TNF-α过量产生中的作用。(2)研究TRPM2通道与UCP2的关系。(3)观察TRPM2通道是否通过ErK/NF-κB通路介导MT引发的TNF-α过量产生。     

DNA复制起始的复制压力诱导子代细胞非对称分布的染色体损伤

【立论依据】 细胞对染色体在有丝分裂后子代中分布的精密调控是生物遗传过程中最基本的特征之一。迄今对染色体在有丝分裂过程中的编程机制尚不清楚。本研究着力于研究DNA复制起始位点的复制压力所诱导的DNA损伤在子代细胞中的分布信息。 【设计思路】 通过对细胞周期的同步化处理,在DNA复制起始位点诱导复制压力,再免疫荧光染色观察染色体损伤在下一个细胞周期子细胞中的分布。从DNA损伤的角度探讨染色体分布的可能调控机制和生理意义。 【实验内容】 (1)用去血清方法将大部分细胞同步于细胞周期的G₁期,通过流式细胞术进行鉴定;(2)在细胞进入G₁期后给予血清培养,使细胞同步化开始DNA复制,实验组给予APH(DNA聚合酶抑制剂)干预,对照组给予不含APH的血清。同时加入脱氧核苷酸异构物EdU(5-ethynyl-2'-deoxyuridine)参与合成中的DNA,并可作为后续荧光标记DNA复制的起始位置;(3)流式细胞术观察细胞周期进入有丝分裂M期和到达下一个细胞周期G₁期所需的时间;(4)分别进行细胞爬片和滴片固定收样,并标染EdU(DNA复制起始位置)和FANCD2(DNA损伤修复蛋白)。观察各对子细胞中的DNA损伤情况,并进行统计分析。观察统计染色体的断裂频率,判断断裂位点与EdU染色位点的相对位置关系。 【材料】 人HBE上皮细胞;FANCD2抗体(美国Gibco公司);APH;EdU;1640培养基(美国Gibco公司)。 【可行性】 已完成的前期实验:(1)明确了DNA复制起始位点通过抑制DNA聚合酶更容易导致染色体损伤;(2)这些DNA起始位点的损伤在有丝分裂后的两个子代细胞中呈现明显的非随机、非对称分布,表现为一个子代细胞损伤明显增多,而另一个子细胞基本没有或很少出现损伤。这些前期实验结果与预期结果相符。 【创新性】 (1)首次在体细胞水平探讨DNA复制起始位点的复制压力所诱导的DNA损伤在子代细胞中的分布信息;(2)探讨DNA复制起始位点在复制压力下与染色体断裂的关系;(3)首次从DNA损伤的角度阐释染色体分布的可能调控机制。     

登革病毒prM蛋白糖基化对ADE的影响

【立论依据及设计思路】 登革病毒的致病作用表现复杂,目前大多数学者均认同Halstead等于1977年提出的抗体依赖增强效应(ADE)学说。现已知与机体免疫应答有关的病毒蛋白包括E蛋白、M蛋白和NS1蛋白。其中,prM蛋白(即M蛋白的前体)的切割是未成熟登革病毒颗粒向成熟病毒颗粒转变的关键步骤。且prM蛋白为黄病毒属的主要表面抗原,能诱导机体产生特异性抗体,研究发现其亦与ADE作用相关。同行及我们的研究均发现 prM抗体是诱导ADE作用发生的主要增强型抗体。prM蛋白本身为糖蛋白,其糖基化位点存在于7、31、52上。目前对于prM蛋白各位点的糖基化作用及其机制不明,特别是其对ADE作用的影响尚无报道。因此,本实验通过构建单个和多个糖基化位点突变的真核表达载体,制备突变后prM抗体,探讨登革病毒prM蛋白N-糖基化位点7、31、52的单个和多个位点的突变重组对其ADE效应的影响。 【实验内容】 通过聚合酶链式反应(PCR)、突变体的设计与构建技术构建重组真核表达载体pPICZαA-prM,通过毕赤酵母表达系统稳定表达并纯化蛋白,免疫小鼠,制备鼠多克隆抗体。用分析型流式细胞仪和荧光定量PCR两种方法检测ADE效应。 【材料】 酵母表达质粒pPICZαA;菌株P. pastoris x33;实验小鼠;C6/36细胞株;LoVo 细胞株。 【可行性】 预期结果:(1)prM蛋白的各位点的糖基化都将对病毒的ADE效应有所影响,且糖基化位点越多,对ADE效应影响越大。(2)prM蛋白部分位点的糖基化将对病毒的ADE效应有所影响,且不同位点影响不同。(3)prM蛋白3个位点的糖基化对病毒的ADE效应都没有影响。 【创新性】 登革病毒是广泛流行于热带亚热带危害较大的虫媒病毒。人们对登革出血热和登革休克综合征机制未明确。其次,从蛋白糖基化角度研究探讨prM蛋白参与ADE效应的可能机制尚未见报道。本研究项目有助于进一步探讨DHF/DSS的发生机制,并能为新型登革热病毒疫苗与药物的研发提供新方向或者新思路。     

姜黄素对肌腱钙化及退变治疗作用的研究

【立论依据】 肌腱病是一种常见的软组织疾病。从事剧烈运动的职业选手跟腱发病高达29%,人群中前臂伸肌肌腱病达1%,而其关键的发病机制尚不明确,且缺乏有效的临床治疗方法。姜黄素作为一种传统中药,据Blood、Nature等权威期刊刊登的研究报道具有抗炎、抗氧化、抑制癌症发生、缓解老年痴呆、促进炎症下肌腱细胞体外表型的维持的作用。我们实验室发现,在炎症环境下的肌腱细胞中,HIF-2a高表达。 【设计思路】 首先研究姜黄素在炎症环境下对肌腱细胞钙化的抑制作用和促肌腱组织表观维持能力,然后用微针给动物模型给药,观察姜黄素对肌腱病小鼠模型的治疗效果。在此基础上,进一步探讨姜黄素功能的相关机制。 【实验内容】 (1)取Scx-GFP小鼠跟腱组织培养,设置空白组、IL-1组、IL-1与姜黄素组,培养1、2、3 d后,分别使用激光共聚焦显微镜观察细胞存活及Scx阳性肌腱细胞的比率;(2)将肌腱干细胞进行骨诱导,设置空白组、IL-1组、IL-1与姜黄素组,运用茜素红(ARS)染色观察钙沉积,并使用real-time PCR、蛋白质印迹法检测Runx2等基因的表达;(3)构建小鼠肌腱病模型, 5只小鼠做为空白组,15只小鼠用微针给予不同浓度的姜黄素治疗。一段时间后,运用X-ray、组织学等手段分析其疗效;用Q-PCR检测HIF-2a信号在各组小鼠肌腱细胞的信号强度。 【材料】 分析纯姜黄素;SCX-GFP小鼠;IL-1β;胶原蛋白酶;Hif-2α引物;染色剂:茜素红,DAPI;聚乙烯吡咯烷酮缓释姜黄素微针等。 【可行性】 前期实验结果:(1)初步明确了姜黄素处理可促进炎症下肌腱组织的存活和表观维持;(2)初步发现姜黄素可抑制炎症下肌腱细胞的钙化;(3)发现Hif-2a在炎症下肌腱细胞中高表达。 【创新性】 (1)老药新用,首次发现姜黄素在肌腱病上的治疗效果,为其提供新药物;(2)用微针进行肌腱部位给药简单、方便、高效、无害;(3)为姜黄素治疗神经退行性等疾病提供新的机制,有助于阐释已知作用和发现未知作用。     

DSS对血管性痴呆大鼠PSD95表达及功能的影响

【立论依据】 血管性痴呆(VD)是一种由于脑血液循环障碍,进而使神经元损伤出现认知功能缺损的综合征,目前尚缺乏疗效肯定的手段。突触后致密蛋白-95(PSD95)在NMDAR和突触膜表面蛋白(如nNOS)之间起连接作用,对兴奋性信号转导进行整合。NMDAR参与了海马突触可塑性诱导及学习和记忆机制。在慢性脑缺血早期,PSD95过表达介导了谷氨酸兴奋毒性对神经元的损伤;缺血晚期PSD95表达过低,则出现LTP诱导障碍及学习和记忆能力下降。本课题组预实验结果表明,DSS可提高局灶性脑缺血(MCAO)再灌注损伤及2VO大鼠学习记忆能力;另外,DSS可降低MCAO再灌注24 h后大鼠皮层PSD95水平。 【设计思路】 本设计拟采用大鼠双侧颈总动脉结扎(2VO)慢性脑缺血模型,通过检测脑缺血不同时间点PSD95 mRNA和蛋白水平、PSD95与NMDAR不同亚型的相互作用,探讨DSS改善VD大鼠学习记忆的可能机制。 【实验内容】 (1)大鼠2VO模型的制备;(2)水迷宫实验;(3)尼氏染色观察海马CA1区神经元丢失情况;(4)Real-time PCR及蛋白质印迹方法观察海马组织PSD95的mRNA和蛋白水平变化;(5)免疫共沉淀方法检测PSD95与GluN2A及GluN2B的相互作用。 【材料】 220~250 g SD大鼠、抗体、PCR及尼氏染色试剂盒等。 【可行性】 (1)理论:文献及前期结果支持DSS通过调节PSD95蛋白表达及其与NMDAR的相互作用改善学习记忆的假设;(2)模型:2VO模型为建立VD的有效模型 (3)设施:实验室具备相关实验仪器 (4)操作:学生掌握实验相关操作技术。 【创新性】 本项目从临床问题出发,在前期研究的基础上,创新性地从调控PSD95表达及功能的角度研究DSS对血管性痴呆大鼠学习记忆功能的改善作用及机制。本研究可为缺血性脑血管病的新药开发以及临床治疗提供理论和实验依据。     

TSC1基因对调节性T细胞发育分化的免疫调控作用

【目的】 本研究利用TSC1的T细胞特异缺失小鼠探讨TSC1对T细胞尤其是调节性T细胞(Treg)发育的免疫调控效应。 【方法】 主要应用T细胞特异性TSC1基因敲除小鼠(Lck-cre; TSC1loxp/loxp)及细胞分子免疫学技术, 阐明TSC1基因对CD4⁺ Treg发育分化及其免疫功能的重要调控作用和规律。 【结果】 (1)TSC1基因缺失小鼠,其胸腺CD4⁺CD8^-T (CD4SP),CD8⁺CD4^-T(CD8SP),CD4^-CD8^-T(DN)和CD4⁺CD8⁺T(DP)细胞百分率无显著差异;(2)TSC1基因缺失小鼠CD4⁺Foxp3⁺Tregs百分率和细胞绝对数均明显增加;(3)小鼠外周免疫器官(脾脏)的CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺T细胞百分率和绝对数均无显著差异;(4)小鼠胸腺中CD4⁺CD25⁺Foxp3^-T细胞百分率和绝对数有下降的趋势;(5)小鼠胸腺中Treg其他亚型如CTLA-4以及GITR型均有所增加。 【结论】 TSC1缺失可以影响nTreg的发育和分化,而对iTreg发育和分化无明显影响,并且TSC1对于nTreg的调节可能是通过调控其前体发育分化而实现的。