热毒宁对RSV感染人支气管上皮细胞分泌TSLP的影响

【目的】 探讨热毒宁对呼吸道合胞病毒(RSV)感染人支气管上皮细胞(NHBE)分泌胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)的影响。【方法】 用Hep-2细胞扩增病毒,并进行毒力鉴定。建立并鉴定RSV感染NHBE的体外细胞模型。第一部分实验分RSV感染组和正常细胞对照组,感染组以不同滴度分为1000、500、100、50、10 TCID505个组,感染12 h、24h、48 h、72 h、96 h、120 h,酶联免疫吸附(ELISA)法检测各组TSLP水平。第二部分实验将热毒宁以不同给药方式干预RSV感染NHBE,分为预防方式给药组、直接灭活病毒组、治疗方式给药组,并设正常细胞对照和病毒对照组,给药12 h、24 h、48 h、72 h,ELISA法检测各组TSLP水平。【结果】 实时荧光定量RT-PCR法鉴定细胞模型建立成功。1.RSV对NHBE分泌TSLP的影响:相同感染时间内(12 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h),随着感染滴度增加,各感染组TSLP分泌水平均呈上升趋势,与正常细胞对照组比较均有统计学差异(P均 < 0.05)。相同感染滴度内, 随着感染时间增加(24 h、48 h、72 h、96 h、120 h),各感染组TSLP分泌水平均呈上升趋势,与12 h组比较均有统计学差异(P均 < 0.05)。2. 热毒宁对RSV感染NHBE分泌TSLP的影响:在12 h、24 h、48 h、72 h给药时间内,热毒宁、利巴韦林的不同( 预防、直接灭活、治疗)给药方式组与病毒对照组比较,均下调TSLP水平(P < 0.05),以预防给药方式明显。【结论】 RSV能诱导NHBE分泌TSLP。热毒宁可抑制RSV引起的TSLP分泌增加,以预防方式给药明显,热毒宁可能在病毒感染的控制中起到重要的作用。     

呼吸道合胞病毒诱导A549细胞凋亡的机制研究

目的:通过呼吸道合胞病毒(RSV)感染人肺Ⅱ型腺上皮癌细胞(A549)及人肺成纤维细胞(IMR-90)后核转录因子(NF-κB)变化,探讨RSV诱导肿瘤细胞凋亡机制,为临床肿瘤治疗提供新方向。方法:RSV以感染复数(MOI)3感染A549及IMR-90细胞,观察感染后24,48,72h细胞形态变化、细胞存活率及细胞内病毒滴度,Western-blot方法检测Caspase-3,8,9蛋白表达变化,并在RSV感染A549细胞后2,4,8,24,36h,采用Western-blot方法检测NF-κB蛋白表达变化。结果:RSV感染A549及IMR-90细胞后,A549细胞存活率较IMR-90低,细胞内病毒滴度较IMR-90高,差异有统计学意义(P<0.05),细胞呈现明显凋亡改变。Caspase-3,8,9呈时间依赖性增强,以Caspase-3,9表达为主。A549细胞内NF-κB表达8h内先增高并达高峰,24h开始下降,36h表达明显下调,与未感染RSV细胞相比差异有统计学意义(P<0.01)。结论:RSV可通过内源性及外源性途径引起A549细胞凋亡,以NF-κB介导的内源性途径为主。     

呼吸道合胞病毒诱导A549细胞凋亡的机制研究

目的:通过呼吸道合胞病毒(RSV)感染人肺Ⅱ型腺上皮癌细胞(A549)及人肺成纤维细胞(IMR-90)后核转录因子(NF-κB)变化,探讨RSV诱导肿瘤细胞凋亡机制,为临床肿瘤治疗提供新方向。方法:RSV以感染复数(MOI)3感染A549及IMR-90细胞,观察感染后24,48,72h细胞形态变化、细胞存活率及细胞内病毒滴度,Western-blot方法检测Caspase-3,8,9蛋白表达变化,并在RSV感染A549细胞后2,4,8,24,36h,采用Western-blot方法检测NF-κB蛋白表达变化。结果:RSV感染A549及IMR-90细胞后,A549细胞存活率较IMR-90低,细胞内病毒滴度较IMR-90高,差异有统计学意义(P<0.05),细胞呈现明显凋亡改变。Caspase-3,8,9呈时间依赖性增强,以Caspase-3,9表达为主。A549细胞内NF-κB表达8h内先增高并达高峰,24h开始下降,36h表达明显下调,与未感染RSV细胞相比差异有统计学意义(P<0.01)。结论:RSV可通过内源性及外源性途径引起A549细胞凋亡,以NF-κB介导的内源性途径为主。     

探究DATS通过调节ERK/NF-κB凋亡通路和诱导自噬而抑制宫颈癌的作用机制

【立题依据】 宫颈癌在发展中国家女性癌症中的死亡率居第二位,主要化疗药物顺铂存在耐药问题,使化疗遇到瓶颈,故需寻找新的有效化疗方案改善现状。研究发现大蒜素(allicin)及其代谢产物二烯丙基三硫化物(DATS)均对肿瘤生长有抑制作用,但DATS在宫颈癌中的作用未见报道。研究表明 DATS在诱导乳腺癌细胞凋亡中抑制了ERK表达,而ERK下调可减少NF-κB活化,且ERK和NF-κB在宫颈癌发生发展中起重要作用,故推测DATS可能通过ERK/NF-κB通路诱导宫颈癌细胞凋亡。Allicin在肝癌中可诱导自噬抗癌,但DATS能否通过自噬抗癌尚无报道。综上,课题探究DATS是否通过调节ERK及NF-κB凋亡通路和自噬通路抗宫颈癌。 【设计思路】 通过体外实验明确DATS对宫颈癌细胞的抑制作用并探究其是否调节ERK及NF-κB凋亡通路和自噬通路抗宫颈癌;体内实验验证DATS调节ERK及NF-κB凋亡通路和自噬通路抗宫颈癌。 【实验内容】 明确DATS对宫颈癌细胞的抑制作用,筛出敏感细胞系和最佳作用浓度及时间点;上下调ERK、NF-κB的表达,探究DATS是否通过调节ERK及NF-κB通路促进宫颈癌细胞凋亡;检测自噬小体形成率及自噬相关蛋白BAD,Beclin1的表达,并通过上下调其表达水平,探究DATS是否诱导宫颈癌细胞自噬;构建裸鼠移植瘤模型,验证DATS通过ERK及NF-κB凋亡通路和自噬通路抗宫颈癌。 【材料】 HeLa、SiHa、CaSki细胞系,DATS,ERK、NF-κB、Bcl2及 GFP-LC3表达质粒,ROS、NF-κB及BAD抑制剂,3-MA,裸鼠。 【可行性】 理论可行:文献报道Allicin可抗癌,其代谢产物DATS也能抑制肿瘤生长。目前DATS在宫颈癌中的作用虽无报道,但发现DATS在乳腺癌细胞中抑制ERK表达,而ERK表达与NF-κB活化正相关,且ERK/NF-κB在宫颈癌中起重要作用。文献报道Allicin可诱导肝癌细胞自噬,但其代谢产物DATS是否通过自噬抗癌尚无报道。技术可行:课题所用实验技术,在本科室有扎实的技术支持,研究者已掌握大部分技术。 【创新性】 DATS对宫颈癌的作用及诱导ERK/NF-κB凋亡通路和自噬通路无报道,具有理论创新性;完善DATS的抑癌机制,为研发新抗癌药物提供理论基础,具有实践创新性。     

细胞间黏附分子-1在支气管哮喘儿童支气管黏膜中的表达及其对支气管上皮细胞凋亡的影响

目的探讨细胞间黏附分子-1(ICAM-1)在支气管哮喘儿童支气管黏膜中的表达及其对支气管上皮细胞凋亡的影响。方法收集驻马店市中心医院2014年5月至2017年12月收治的28例哮喘儿童的支气管黏膜组织标本,同时选取28例支气管扩张非哮喘儿童的支气管黏膜组织作为对照;采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)和Western blot法检测支气管哮喘儿童支气管黏膜组织中ICAM-1 mRNA和蛋白表达。将正常培养的支气管上皮细胞16HBE分为对照组、感染组、阴性组和干扰组。对照组细胞正常培养,不做任何处理;感染组细胞感染呼吸道合胞病毒(RSV),但不进行转染;阴性组细胞转染siRNA-control后感染RSV;干扰组细胞转染ICAM-1 siRNA后感染RSV。采用qRT-PCR和Western blot法检测各组细胞中ICAM-1 mRNA和蛋白表达,流式细胞术检测细胞凋亡情况,酶联免疫吸附试验检测细胞培养基上清液中白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平,Western blot法检测细胞中活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved Caspase-3)、核因子-κB p65(NF-κB p65)表达。结果哮喘支气管黏膜组织中ICAM-1 mRNA和蛋白表达显著高于正常支气管黏膜组织(P <0. 05)。感染组、阴性组、干扰组细胞中ICAM-1 mRNA和蛋白表达显著高于对照组(P <0. 05)。干扰组细胞中ICAM-1 mRNA和蛋白表达显著低于感染组和阴性组(P <0. 05)。感染组、阴性组、干扰组细胞凋亡率显著高于对照组(P <0. 05)。干扰组细胞凋亡率显著低于感染组和阴性组(P <0. 05)。感染组、阴性组、干扰组细胞培养基上清液中IL-1β、TNF-α水平显著高于对照组(P <0. 05)。干扰组细胞培养基上清液中IL-1β、TNF-α水平显著低于感染组和阴性组(P <0. 05)。感染组、阴性组、干扰组细胞中Cleaved Caspase-3、NF-κB p65蛋白水平显著高于对照组(P <0. 05)。干扰组细胞中Cleaved Caspase-3、NF-κB p65蛋白水平显著低于感染组和阴性组(P <0. 05)。结论 ICAM-1在哮喘儿童支气管黏膜组织中表达上调,抑制ICAM-1可以降低RSV诱导的支气管上皮细胞凋亡,降低支气管上皮细胞中Cleaved Caspase-3、NF-κB p65蛋白表达,减少细胞分泌炎性因子。     

胃癌细胞中VD3对NF-κB通路的影响机制及与萜类化合物协同作用探究

【立论依据】 NF-κB信号转导途径在调节细胞增殖、分化、凋亡中起到重要作用; IκB-α是调节NF-κB信号转导途径的核心蛋白;VD₃可以通过影响IκB-α、转录因子等方式抑制NF-κB信号转导途径的激活;萜类化合物是目前医药研究中很有前景的化疗药物,NF-κB的抑制可以增强其抗肿瘤效应。 【设计思路】 选取低分化、中分化胃癌细胞与正常胃组织细胞,给予其不同VD₃作用环境(时间、浓度),从mRNA、蛋白水平上测定NF-κB途径的表达活性。通过阻断VD₃和IKKβ的相互作用,研究VD₃调控IκB-α含量的主导因素。协同施用二萜类化合物--紫杉醇与VD₃,探究两者的协同作用与最佳浓度。 【实验内容】 (1)将人胃癌中、低分化的细胞株系与正常胃组织细胞(空白对照),并分别用10^-9、10^-8、10^-7mol/L培养0、4、16、24 h后用RT-PCR检测IΚB-α的mRNA含量变化,用western blot检测IΚB-α蛋白的含量变化,以ChIP检测NF-κB转录因子与DNA结合活性。(2)降低IKKβ与VD₃的结合活性,阻断VD3对IκB-α降解的抑制,定量检测IκB-α的蛋白质和mRNA含量。(3)以不同浓度比例、作用时间方式的紫杉醇与VD₃刺激胃癌胃癌,检测其存活率与细胞周期分布。 【可行性】 预实验中已证实VD₃可以使胃癌细胞中IκB-α含量上升,且刺激时间为4h的组中最为显著。 【创新性】 (1)VD₃的部分作用机制仍不明确。我们猜想VD3可能通过抑制NF-κB通路上某些具体的信号分子而发挥作用,并期望在胃癌细胞中得以验证。(2)VD₃可以通过促进IκB-α的生成以及抑制IκB-α的降解来提高其在细胞中的含量,从而抑制细胞周期。但是哪种因素占主导作用却鲜有研究。我们设计IKKβ抑制实验来探究影响IκB-α含量的主导因素,从而为更有效地调节NF-κB信号通路提供实验依据。(3)选用萜类化合物中的紫杉醇,利用NF-κB通路为其与VD₃作用机制的交叉点,进行探究。如果确认VD₃对紫杉醇杀伤癌细胞产生增敏作用,将对胃癌的临床化疗提供一种有效的治疗方案。     

COPD病人肺组织中NF-κB的表达及意义

目的探讨核因子-κB(NF-κB)在慢性阻塞性肺疾病(COPD)病人气道重塑中的表达及意义。方法非COPD、COPD组男性肺癌病人各15例,取其肺叶切除后的外周肺组织,应用免疫组织化学方法检测NF-κB在肺组织中的表达,同时采用原位缺口末端DNA碎片标记技术检测细胞凋亡情况。结果 COPD组支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞和支气管平滑肌细胞的NF-κB染色阳性率明显高于非COPD组(t=4.074~6.474,P均<0.01)。COPD组支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞凋亡处于主导地位(t=25.83、24.02,P均<0.01);支气管平滑肌细胞增殖处于主导地位(t=3.27,P<0.01);支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞NF-κB表达与凋亡指数均呈正相关(r=0.823、0.774,P均<0.01),而支气管平滑肌细胞中呈负相关(r=-0.652,P<0.01)。结论 NF-κB可促进支气管上皮细胞及肺泡上皮细胞凋亡,同时促进支气管平滑肌细胞增殖并参与气道重塑。     

MAPK和PI3K信号通路在胃癌中的作用及意义

【目的】 已有研究表明MAPK和PI3K信号途径是两条重要的抑制凋亡和促进增殖的转导通路,与癌症的发生发展关系密切,本实验通过检测在Akt、Erk、Bcl-2、NF-κB在胃癌及癌旁组织的表达,探讨MAPK和PI3K信号通路在胃癌发展过程中的作用及意义。 【方法】 收集50对胃癌组织及其相应的癌旁组织,应用免疫组织化学技术检测胃癌及癌旁组织中Akt、Erk、Bcl-2和NF-κB蛋白的表达情况并进行分析。 【结果】 胃癌中Akt、Erk、Bcl-2、NF-κB蛋白的阳性表达率均高于其癌旁组织,差异具有统计学意义(P<0.05)。 【结论】 胃癌的发生发展是一个多步骤、多基因突变的累积过程。PI3K/Akt和MAPK/ERK信号转导通路是细胞内两条重要的促增殖和抗凋亡通路。PI3K-Akt信号通路在细胞内影响细胞生长、增殖、凋亡,丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(Akt)处于中心环节,活化的Akt可激活下游信号分子,包括抑制凋亡的Bcl-2蛋白和转录因子NF-κB。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路参与基因表达调控,细胞功能活动以及个各种生理病理过程。胞外信号调节激酶(ERK1/2)是哺乳动物中5条并行的MAPK信号通路之一,通过激活下游靶位,包括重要的转录因子NF-κB和细胞存活调节器Bcl-2,调控基因表达,从而发挥抑制凋亡的作用。本研究结果显示人胃癌中Akt、Erk、Bcl-2、NF-κB蛋白的阳性表达率均高于其癌旁组织,说明上调PI3K/Akt和MAPK/ERK信号通路的活性与胃癌的发生发展过程密切相关。     

利巴韦林抑制呼吸道合胞病毒诱导的A549细胞凋亡

目的:探讨利巴韦林抗呼吸道合胞病毒(RSV)的作用过程中,对A549细胞凋亡相关蛋白表达的影响。方法:将A549细胞分为4个组:细胞对照组(C组)、利巴韦林组(Rib组)、呼吸道合胞病毒组(RSV组)、利巴韦林干预组(RR组),分别在RSV感染的1,2,4,12,24h收集RSV组和RR组培养上清,空斑实验检测各个时间段病毒滴度;应用Western blot技术检测pAKT、AKT、IκBα、Bcl-2、Bax蛋白表达水平。结果:利巴韦林干预后,pAKT表达显著增加,差异有统计学意义(P<0.05);IκBα蛋白4,12,24h表达明显减少,差异有统计学意义(P<0.05);Bax蛋白表达明显减少,差异有统计学意义(P<0.05);Bcl-2蛋白12,24h表达高于RSV组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:利巴韦林不仅可以抑制RSV的复制,同时可以激活AKT-NF-κB途径、上调Bcl-2、下调Bax蛋白表达,从而抑制RSV感染诱导的A549细胞早期凋亡。     

基于NF-κB探究苗医验方四大血调控佐剂性关节炎大鼠TNF-α表达的作用机制

【立论依据】 类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)的致残率在关节病中高居首位。四大血流传于西南苗族地区,在风湿类疾病的治疗中应用广泛。研究显示,炎症因子(如:TNF-α、IL-1β等)及信号通路(如:NF-κB等)的上调及激活与RA发病密切相关,且RA临床症状的改善与炎症因子的下调及信号通路的抑制有关。因而我们提出猜想:四大血能否下调TNF-α、IL-1β表达、抑制NF-κB激活?若能下调,该作用是否与抑制NF-κB有关? 【设计思路】 首先用四大血作用于RA模型动物及关节滑膜细胞,观察其能否下调TNF-α、IL-1β表达;若能,则对另一组RA模型动物及滑膜应用NF-κB抑制剂,去除NF-κB在四大血作用RA过程中的影响;之后,应用四大血观察TNF-α、IL-1β的表达水平是否下调,若未下调,说明四大血下调TNF-α、IL-1β的作用只与其抑制NF-κB有关,若部分下调(与应用NF-κB抑制剂之前相比,下调幅度减少),说明四大血下调TNF-α、IL-1β与抑制NF-κB部分有关,若完全下调(下调幅度与应用NF-κB作用前相同),说明四大血下调TNF-α、IL-1β的作用与其抑制NF-κB无关。 【实验内容】 (1)建立RA动物模型——佐剂性关节炎(adjuvant arthritis,AA)大鼠用于体内实验,并培养AA大鼠滑膜细胞用于体外实验;(2)灌胃给予AA大鼠及滑膜细胞一定浓度四大血;(3)观察给药后TNF-α、IL-1β变化情况;(4)若TNF-α、IL-1β下调,则用NF-κB抑制剂(BMS345541)对另一组AA大鼠及滑膜细胞进行预处理;(5)预处理后的AA大鼠及滑膜细胞给予一定浓度四大血;(6)观察TNF-α、IL-1β的表达水平。 【材料】 试剂:四大血、TNF-α、IL-1β等。动物及组织:SD大鼠、滑膜细胞。仪器:酶标仪、细胞培养箱等。 【可行性】 (1)本实验组前期成功建立AA大鼠模型并通过测量大鼠足跖肿胀度及病理形态学观察,证实了四大血最RA确切的治疗作用,具有较为扎实的实验基础;(2)所需实验器材易于获取;(3)采用常规实验手段,方法稳定可靠;(4)小组成员掌握所需实验技术手段,技能可靠。 【创新性】 (1)本实验研究对象为西南民族草药,具有地域性、民族性、特色性;(2)应用信号通路抑制剂,从而在去除NF-κB的基础上,单方面的探讨四大血对TNF-a、IL-1β的作用。     

呼吸道合胞病毒合并肺炎克雷伯菌感染所致肺炎与TLR4-NF-κB信号通路关系的初步研究

目的 探讨呼吸道合胞病毒( RSV)合并肺炎克雷伯菌( Kp)感染SD大鼠后,初步研究其所致肺炎与TLR4-NF-κB信号转导通路的关系. 方法 60只雄性SD大鼠随机分为正常对照组、RSV组、Kp组及RSV+Kp组,以RSV、Kp滴鼻感染SD大鼠,分别于感染后第0、1、3、5、7天不同时间点,测量其体重、肺指数( LI )的变化;HE染色观察肺的病理学改变;RT-PCR法检测肺组织中TLR4、NF-κB的mRNA表达;Western blot检测NF-κB蛋白的表达;ELISA法检测肿瘤坏死因子-α( TNF-α)和白细胞介素-1β( IL-1β)含量的变化.结果 与正常对照组相比,RSV组和Kp组均存在弥漫性肺泡间隔增厚和炎症细胞浸润,且随感染时间的延长,肺泡结构破坏逐渐加重, LI、TLR4 mRNA、NF-κB mRNA、NF-κB 蛋白、TNF-α和IL-1β的表达均升高,并与RSV和Kp感染之间存在时间依赖性关系;RSV+Kp组 LI、TLR4 mRNA、NF-κB mRNA、NF-κB蛋白、TNF-α和IL-1β的表达量进一步升高,肺组织炎症明显加剧. 结论 RSV和Kp混合感染具有协同作用,加重肺部炎症;RSV合并Kp感染可能通过 TLR4-NF-κB途径诱导肺部炎症反应,释放细胞因子TNF-α和IL-1β等.     

复方野马追胶囊抗呼吸道合胞病毒研究

目的 观察复方野马追胶囊对呼吸道合胞病毒（RSV）感染及炎性因子IL-8释放的抑制作用。方法 采用细胞病变（CPE）观察和活细胞染色方法,观察复方野马追胶囊对呼吸道合胞病毒感染细胞的保护。同时,通过ELISA法测定培养上清IL-8的变化。结果 复方野马追胶囊对呼吸道合胞病毒感染有抑制作用,其中以治疗法效果最为明显。同时该药对呼吸道合胞病毒感染后引起的IL-8释放也有明显抑制作用。结论 复方野马追胶囊具有明显的体外抗呼吸道合胞病毒感染、降低感染后气道炎症因子释放的作用。     

白细胞介素-33对肿瘤组织中髓系抑制性细胞功能的调控及机制

【目的】 CD11b⁺Gr-1⁺髓系抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)具有强大的抑制T细胞的功能,是肿瘤微环境中介导肿瘤免疫逃逸和促进肿瘤发展的重要细胞亚群,但其功能调控的分子机制尚不清楚。本研究目的是揭示肿瘤组织中白细胞介素-33(interleukin 33,IL-33)对MDSC功能的调控作用及其机制。 【方法】 给BALB/c小鼠接种4T1细胞,构建小鼠乳腺癌模型;用免疫荧光、定量PCR、免疫组化和ELISA等方法检测小鼠4T1和人乳腺癌组织中IL-33的表达水平;流式细胞术检测野生型和IL-33受体ST2敲除小鼠(ST2^-/-)肿瘤组织中CD11b⁺Gr-1⁺MDSC的比例,以及MDSC增殖和凋亡的水平;检测IL-33处理前后MDSC存活水平,以及精氨酸酶-1(arginase 1,Arg-1)在mRNA水平以及酶活性上的变化;蛋白质印迹法检测IL-33处理后MDSC相关信号通路分子的改变,并用转录因子抑制剂进行验证,以揭示IL-33调控MDSC功能的关键转录因子。 【结果】 小鼠4T1和人乳腺癌组织中存在大量IL-33表达的现象;小鼠和人乳腺癌组织上清液中检测到高水平的IL-33。在小鼠肿瘤组织中,MDSC高表达ST2,其中45%的ST2⁺细胞为MDSC;ST2^-/-小鼠肿瘤组织中MDSC的数量比野生型显著减少(P<0.001);ST2^-/-小鼠肿瘤组织中的MDSC增殖显著减少,凋亡显著增多(P<0.05); 体外IL-33刺激能诱导MDSC增殖,减少凋亡;IL-33处理24 h后,Arg-1的mRNA表达及酶活性均显著增高(P<0.01)。IL-33处理后,MDSC的NF-κB和ERK的磷酸化水平明显增加,而加入转录因子抑制剂后,IL-33诱导MDSC上调Arg-1表达的效应显著降低(P<0.01),表明NF-κB和ERK对于IL-33调控MDSC的功能极其重要。 【结论】 证实肿瘤组织中高水平IL-33分泌可诱导MDSC增殖,促进其在肿瘤组织中的聚集,并上调MDSC表达Arg-1而增强其免疫抑制功能,NF-κB和ERK是IL-33作用于MDSC通路中至关重要的转录因子。研究结果为揭示肿瘤细胞免疫逃逸的机制提供了新的观点,并可能为肿瘤的免疫治疗提供新的思路。     

人参皂苷对Aβ25-35蛋白诱导的老年性痴呆体外模型NG108-15神经元细胞凋亡的抑制作用

【目的】探讨在以NG108-15细胞作为神经元代表、β-淀粉样蛋白25-35片段(Aβ25-35)诱导凋亡的阿尔茨海默病体外细胞模型中,人参皂苷Rg1保护神经元的作用及其机制。【方法】采用倒置显微镜观察细胞形态,结合流式细胞仪检测凋亡率,进行Aβ25-35造模浓度与时间的选择以及Rg1预处理最佳浓度时间的选择;在此基础上,采用荧光显微镜和数据处理系统(DMR)图像分析仪检测免疫细胞化学法标记的核因子-κB(NF-κB)的活性;采用免疫组化染色法检测B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)的表达;采用酶标光度计、半胱氨酸/天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)比色检测试剂盒检测caspase-3活性。【结果】20μmol/L Aβ25-35作用24 h可诱导NG108-15细胞凋亡,2μmol/L Rg1组的NF-κB活性与模型组比较显著性提高(P<0.01),Rg1预处理组Bcl-2表达呈阳性,且caspase-3活性较模型组显著性降低(P<0.01)。【结论】高浓度聚焦状的Aβ25-35可下调神经元内NF-κB的活性,诱导细胞凋亡,Rg1通过启动神经元中NF-κB的活化从而上调Bcl-2表达,抑制caspase-3活性而发挥保护神经元的作用。     

人工合成红景天苷对脂多糖诱导大鼠急性肺损伤早期防治作用的机制初探

【立论依据及设计思路】 急性肺损伤(acute lung injury,ALI)是呼吸道重大疫病(如SARS、禽流感等)的病理基础,ALI进一步发展即为急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS),目前尚无有效的治疗手段。民间用红景天治疗肺炎咳嗽和咳血等症状已有上千年历史,新近发现传统中药红景天对ALI具有保护作用,其主要有效成分红景天苷可能发挥主要功能,但机制不详。目前如何开发人工合成的高纯度红景天苷替代日益枯竭的红景天资源用于临床治疗是个亟待解决的问题。我们的初步研究提示,人工合成红景天苷对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导大鼠的ALI早期具有防治效果。在此基础上,我们将进一步探究红景天苷治疗ALI的分子机制。 【实验内容】 动物实验:LPS气管滴注构建ALI的大鼠模型,实验分组:对照组、LPS组、LPS + 地塞米松组、LPS + 不同剂量红景天苷组,观察指标:血气分析(PaCO2、PaO2、pH)、血球分析(白细胞总数、中性粒细胞数等)、肺大体和肺组织形态学(H-E染色)、肺系数和肺湿/干重比、肺泡灌洗液(总蛋白含量、中性粒细胞数、促炎因子NF-κB、IL-1和IL-6水平);细胞实验:分离培养大鼠肺泡巨噬细胞,并与大鼠肺泡巨噬细胞系NR8383同步进行实验,实验分组:对照组、LPS组、LPS + 不同剂量红景天苷组。细胞经相应药物处理,收集细胞和培养上清,检测关键炎症信号通路LPS/NF-κB(如NF-κB转录活性、NF-κB与DNA结合活性和NF-κB核转位等)和LPS/MAPK(如p38、ERK 和JNK磷酸化)的改变, ELISA测定培养上清中NF-κB、IL-1和IL-6等炎症介质含量。最后进行统计学分析。 【材料】 雄性SD大鼠,NR8383细胞系,纯度>99.5%的人工合成红景天苷,LPS。 【可行性】 前期预实验结果提示人工合成红景天苷对LPS诱导大鼠ALI早期具有防治作用。目前已成功分离培养大鼠肺泡巨噬细胞,为在细胞分子水平探讨作用机制提供可能。 【创新性】 首次探究人工合成红景天苷对LPS诱导大鼠ALI早期的防治作用及其可能的分子机制。     

去甲斑蝥素抗骨髓瘤作用及其机制研究

目的 探讨去甲斑蝥素（norcantharidin,NCTD）抗骨髓瘤作用及其相关机制。方法 MTT法检测NCTD对人骨髓瘤细胞株RPMI 8226增殖的抑制作用,并观察其对荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用;流式细胞术检测细胞凋亡率,Western blotting检测核因子-κB（NF-κB）p65、磷酸化NF-κB p65（p-NF-κB p65）、NF-κB抑制因子IkBα、磷酸化IkBα（p-IkBα）、IkB激酶α（IKKα）以及Survivin、Bcl-2、Bax蛋白表达水平,分光光度法检测Caspase-3活性,RT-PCR检测NF-κB mRNA表达。结果 NCTD抑制RPMI 8226细胞增殖,促进其凋亡;其剂量为20、40 mg/kg时对荷瘤小鼠的抑瘤率分别为29.8%、53.5%。NCTD抑制胞核NF-κB p65、p-NF-κB p65以及胞浆p-IkBα、IKKα的表达,增加胞浆IkBα的表达,对胞浆NF-κB p65的表达无显著影响。NCTD还抑制Survivin、Bcl-2蛋白的表达,促进Bax的表达和RPMI 8226细胞Caspase-3的活化,Caspase-3抑制剂能部分拮抗NCTD引起的RPMI 8226细胞凋亡（P＜0.05）。结论 NCTD对RPMI 8226细胞有抗增殖和促凋亡作用,其机制可能与NF-κB信号通路有关。     

白藜芦醇抑制TLR4/NF-κB通路对毛细支气管炎小鼠的保护作用

目的 研究白藜芦醇通过抑制T样受体4/核因子-κB(TLR4/NF-κB)通路对呼吸道合胞病毒(RSV)毛细支气管炎小鼠的保护作用。方法 选取30只小鼠随机分为对照组、RSV组、给药组,建立RSV毛细支气管炎小鼠模型,检测小鼠肺组织中TLR4、NF-κB的变化;利用肺组织HE染色、ELISA法检测白藜芦醇给药前后气道炎症病变、IL-6、TNF-α因子水平,Western Blot法及实时定量PCR法检测TLR4、 NF-κB蛋白及基因表达等相关变化。结果 与对照组相比,RSV组小鼠组肺组织中TLR4、NF-κB水平升高,肺组织切片HE染色显示气道炎症细胞浸润加剧,ELISA检测炎性因子IL-6、TNF-α升高;而给药组处理后,肺组织TLR4、NF-κB的表达下调,病理改变减轻,炎性因子IL-6、TNF-α下降。结论 白藜芦醇可通过抑制TLR4/NF-κB通路抑制炎性因子的释放,从而减轻毛细支气管炎小鼠的气道炎症反应。     

去乙酰化酶SIRT1调控PFOA诱导小鼠肝损伤的作用及机制研究

【立论依据】 流行病学调查发现,全氟辛酸(PFOA)和人类多种疾病密切相关。我们前期研究发现PFOA可通过氧化应激、炎症反应和诱导凋亡引起小鼠肝脏毒性损伤。去乙酰化酶SIRT1在细胞应激反应中具有关键作用,可引起多种转录因子去乙酰化,从而促进细胞存活,抑制凋亡。因此,我们提出:“SIRT1的去乙酰化修饰可能对PFOA诱导的小鼠肝损伤起保护作用”。 【设计思路】 在前期研究的基础上,探讨PFOA肝脏毒性与SIRT1表达和反应活性的相关性;利用SIRT1激活剂以及SIRT1抑制剂观察SIRT1信号通路对PFOA诱导的肝脏毒性损伤的调控作用;通过检测P53、NF-κB p65 和FOXO3a的表达和乙酰化水平,分析SIRT1系统调控PFOA肝脏毒性的分子机制,是否与SIRT1对P53、NF-κB p65 和FOXO3a的去乙酰化修饰有关。 【实验内容】 (1)Real-time PCR和蛋白质印迹方法检测SIRT1的表达,免疫共沉淀法检测SIRT1的反应活性,对比正常对照和PFOA染毒小鼠,明确PFOA肝脏毒性与SIRT1的相关性;(2) PFOA染毒小鼠给予SIRT1激活剂SRT1720以及SIRT1抑制剂尼克酰胺,石蜡切片HE染色观察肝组织病理学改变;全自动生化分析仪检测ALT、AST、ALP及LDH的血清水平;酶联免疫分析IL-6、COX-2及CRP的肝组织水平;免疫组化检测DNA氧化损伤标志物8-OHdG的产生;比色法检测MDA生成及SOD、CAT和GSH-PX的活性;TUNEL染色法观察细胞凋亡;real-time PCR和蛋白质印迹方法检测Bcl-2、Bax、Fas、FasL等凋亡相关基因的表达,明确SIRT1通路的激活或抑制对PFOA诱导肝脏损伤的调控作用;(3)应用乙酰化赖氨酸抗体通过蛋白质印迹方法检测P53、NF-κB p65 和FOXO3a的乙酰化水平,分析SIRT1是否通过对P53、NF-κB p65 和FOXO3a的去乙酰化修饰调控PFOA诱导的肝脏毒性损伤。 【材料】 本项目以小鼠为实验动物,实验仪器包括实时荧光定量PCR仪、全自动DNA扩增仪、紫外可见分光光度计、石蜡切片机、高速低温离心机、蛋白电泳系统、电转仪、全自动生化分析仪等。 【可行性】 本项目充分分析了国内外研究现状和发展前景,并取得了较好的前期研究基础。 【创新性】 SIRT1对PFOA肝脏毒性的调控作用尚未见报道,本实验项目研究SIRT1对PFOA诱导肝损伤的保护作用及其分子机制,为预防和治疗全氟化合物引起的肝脏损伤寻找新靶点。     

冬凌草甲素对卵巢癌细胞紫杉醇耐药性的拮抗作用及其机制研究

目的 探讨冬凌草甲素体内外对卵巢癌细胞紫杉醇耐药性的拮抗作用及其机制。方法 通过大剂量冲击法,诱导制备耐紫杉醇的人卵巢癌HO-8910PM细胞株（HO-8910PM/PIX）,用不同浓度冬凌草甲素处理HO-8910PM/PIX细胞;或在冬凌草甲素作用HO-8910PM/PIX细胞前以NF-κB激活剂TPA进行预处理。给药后,细胞经DAPI染色,荧光显微镜下观察细胞形态变化;CCK-8法检测细胞增殖;流式细胞仪检测细胞凋亡情况;Western blotting检测卵巢癌细胞中NF-κB蛋白的表达。建立裸鼠卵巢癌皮下移植瘤模型。接种后8周,观察冬凌草甲素对裸鼠皮下移植瘤生长的影响;免疫组织化学法检测肿瘤组织中NF-κB的阳性表达。结果 与对照组相比,冬凌草甲素呈浓度相关性抑制卵巢癌HO-8910PM/PIX细胞增殖,显著诱导细胞凋亡,而TPA可显著削弱冬凌草甲素诱导细胞凋亡的作用。与HO-8910PM细胞相比,NF-κB在HO-8910PM/PIX细胞中表达显著上调,冬凌草甲素可抑制HO-8910PM/PIX细胞中NF-κB的表达。冬凌草甲素可显著抑制裸鼠卵巢癌皮下移植瘤生长,明显减弱移植瘤组织中NF-κB的阳性表达。结论 冬凌草甲素体内外对卵巢癌细胞紫杉醇耐药性具有拮抗作用,该作用可能通过抑制NF-κB的表达而实现。     

姜黄素对肺炎链球菌感染的抗炎和抑菌作用

目的 研究姜黄素（Cur）及其衍生物6B、Y20对肺炎链球菌（streptococcus pneumonia,SP）最小抑菌浓度及对其致病因子NanA、NF-κB表达调节,探讨Cur、6B、Y20对SP抑菌作用及减少SP感染炎性反应的作用机制。方法 利用微量浓度稀释法联合血琼脂平板涂布法检测Cur、6B、Y20对SP的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration,MIC）值;培养人支气管上皮（BEAS-2B）,建立体外SP感染模型,分为空白对照组、SP感染组、Cur+SP组、6B+SP组、Y20+SP组。CCK8法测试细胞存活率,ELISA法检测NanA、TNF-α等的蛋白含量,用Western blot法检测NF-κB的表达。结果 Cur、6B、Y20在高浓度有抑菌作用;随SP感染时间的延长,药物处理组细胞存活率较SP感染组相比增高（P<0.01）;与空白对照组比较,SP感染组中NanA、NF-κB、TNF-α表达增加;与SP感染组比较,Cur、6B、Y20药物预处理组NF-κB、NanA表达降低（P<0.05）,TNF-α等表达水平较模型降低（P<0.01）。结论 Cur、6B、Y20高浓度有抑菌作用,并可通过下调SP表面毒力因子NanA的表达,减轻SP的毒力作用,并通过抑制NF-κB转录激活,减少下游炎性因子表达,减轻SP引起炎症损伤。