MNPs-exosomes联合载药系统的制备及其在肿瘤治疗中的可行性探索

【立论依据】 药物靶向输送系统在肿瘤治疗中至关重要。磁性纳米颗粒(MNPs)可在外磁场引导下使其负载药物定向于肿瘤组织,达到肿瘤化疗中低毒高效的目的。然而,它的非生物源性使它不能在体液和组织中稳定地存在。Exosomes是一种由体内多种细胞释放的、直径介于50~150纳米的微囊体。因不引起补体或凝血因子的激活,以及难以被单核巨噬细胞吞噬,故可以在体内稳定存在,也是药物的理想载体。但由于靶向性较弱,难以富集至肿瘤组织。 【设计思路】 本项目拟设计并制备MNPs-exosomes二者联合的载药系统,以达到优势互补的效果,并通过体内外实验探讨其是否具有协同效应,从而为构建肿瘤靶向给药系统提供一种新思路。 【实验内容】 (1)制备3种药物载体:MNPs、exosomes、MNPs-exosomes联合载药体;(2)将3种药物载体分别与药物结合:选用多柔比星;(3)体内外实验验证其靶向性;(4)体内外实验评价其治疗效果。 【材料】 RAW-264.7细胞、HEPG-2细胞、MNPs、四氧化三铁悬液、250nm二氧化硅粒子悬液、聚苯乙烯、甲苯。 【可行性】 本课题组已进行了制备MNPs-exosomes联合载药体的预实验,实验结果符合预期。在以往的研究中,我们已经掌握了进行上述实验所需要的技术和方法,具备一定的科研悟性和热情,可以完成此研究。 【创新性】 (1)首次提出将MNPs与exosomes联合载药,通过二者的优势互补,来观察联合体是否具有协同作用;(2)我们拟通过制作超小粒径分子筛分离提纯exosomes,避免了传统方法的弊端。     

TSC1基因对调节性T细胞发育分化的免疫调控作用

【目的】 本研究利用TSC1的T细胞特异缺失小鼠探讨TSC1对T细胞尤其是调节性T细胞(Treg)发育的免疫调控效应。 【方法】 主要应用T细胞特异性TSC1基因敲除小鼠(Lck-cre; TSC1loxp/loxp)及细胞分子免疫学技术, 阐明TSC1基因对CD4⁺ Treg发育分化及其免疫功能的重要调控作用和规律。 【结果】 (1)TSC1基因缺失小鼠,其胸腺CD4⁺CD8^-T (CD4SP),CD8⁺CD4^-T(CD8SP),CD4^-CD8^-T(DN)和CD4⁺CD8⁺T(DP)细胞百分率无显著差异;(2)TSC1基因缺失小鼠CD4⁺Foxp3⁺Tregs百分率和细胞绝对数均明显增加;(3)小鼠外周免疫器官(脾脏)的CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺T细胞百分率和绝对数均无显著差异;(4)小鼠胸腺中CD4⁺CD25⁺Foxp3^-T细胞百分率和绝对数有下降的趋势;(5)小鼠胸腺中Treg其他亚型如CTLA-4以及GITR型均有所增加。 【结论】 TSC1缺失可以影响nTreg的发育和分化,而对iTreg发育和分化无明显影响,并且TSC1对于nTreg的调节可能是通过调控其前体发育分化而实现的。     

壳聚糖耦联杂大环Cu(II)配合物的制备及其催化释放NO性能

【目的】 寻求高效低毒的内源性一氧化氮供体型前药,并探究其在生理条件下催化一氧化氮前驱体释放一氧化氮性能。 【方法】 采用常规法与微波法考察关键中间体制备条件;应用壳聚糖成膜策略耦联杂大环Cu(II)化合物,通过¹HNMR、¹³CNMR、SEM等手段对中间体及目标前药分子的结构和组成进行表征;利用重氮化反应探究其催化一氧化氮前驱体释放一氧化氮性能。 【结果】 (1)探寻出关键中间体的高效、节能制备方法;(2)成功制备并表征了各中间体及其目标前药;(3) 制备的目标前药具有良好的催化一氧化氮前驱体释放一氧化氮性能。 【结论】 为人工合成高效低毒的一氧化氮供体型前药的设计开辟了新思路,也为一氧化氮的供药方式提出了新的供药途径。     

基于纳米颗粒的生物分子传感新方法

【立论依据】 通过在微米结构中堆积纳米颗粒形成的纳流体晶体具有单根纳米通道的电动力学特性,即低离子浓度溶液中,通过晶体的电导与颗粒表面的电荷密度成正比而与溶液中的离子浓度无关。蛋白质和核酸分子都是带有极性的生物大分子,在结合到纳米颗粒表面的时候会改变纳米颗粒表面的电荷密度。通过纳流体晶体的理论电动力学模型可以测量生物大分子的浓度。另外,核酸适配体是一种能和特定蛋白实现特异性结合的核酸片段,适配体本身除了可以结合特定蛋白分子之外,还能提升纳米颗粒表面的电荷密度改变量。 【设计思路】 (1)以人α-凝血酶分子作为模型蛋白,通过在纳米颗粒的表面修饰特异性的α-凝血酶核酸适配体探针,然后在微米孔芯片中堆积成纳流体晶体,通过电泳的形式让含有低浓度凝血酶分子的待测溶液通过纳流体晶体通道,通过适配体结合分子后造成纳米颗粒表面电荷密度改变,通过计算改变量,进而实现对α-凝血酶浓度的检测。(2)为了进一步提高灵敏度,利用“适配体1-凝血酶-适配体2”的类三明治结构,即在原来的基础之上,将待测的α-凝血酶分子结合上适配体-2,然后通过纳流体晶体。因为结合上核酸适配体-2之后,蛋白的带电量增加,结合在纳米颗粒表面之后使得颗粒表面的电荷密度变化更加明显,理论上的检测灵敏度会增加。此外,核酸适配体-2与适配体-1在α-凝血酶上结合位点不一样,因此互不影响。进样方式依然采用电泳方式。 【实验内容】 (1)在纳米颗粒表面结合α-凝血酶适配体探针;(2)利用上述纳米颗粒构建纳流体晶体;(2)通过电泳使待测凝血酶溶液通过晶体通道,并检测电导变化;(3)在凝血酶上结合特异性适配体,通过电泳加样,再次检测电导变化。 【材料】 人α-凝血酶溶液,特异性α-凝血酶适配体探针1和2,纳米颗粒溶液,电导检测电极 【可行性】 (1)通过晶体的电导与颗粒表面的电荷密度成正比而与溶液中的离子浓度无关的特性在生物传感器方面理论上已经完全成熟,基于此原理的纳流体传感器也已初步实现。(2)核酸适配体探针的特性研究已经相对透彻。 【创新性】 本实验首次设计出“适配体1-蛋白-适配体2”的三明治结构并应用于传感器中,相比较于“适配体-蛋白”传感器极大提升了传感器检测的灵敏度。     

探讨苯并吲哚荧光标记的2-脱氧-D-葡萄糖的设计合成及其在肿瘤糖代谢的应用

【立论依据】 代谢改变是肿瘤的重要特征之一,其与肿瘤的发生发展密切相关。肿瘤细胞无论在有氧或无氧条件下,均需通过糖酵解(glycolysis)途径吸收大量的葡萄糖产生能量,满足快速生长需求,肿瘤细胞的这一代谢特点是肿瘤细胞具有的普遍现象和规律,被称为Warbrug效应。基于上述效应和系列研究工作基础,采用光稳定性好的苯并吲哚类荧光探针对2-脱氧-D-葡萄糖进行标记并在体内外评价其对肿瘤的靶向成像能力,考察肿瘤在体内的转移情况及治疗效果,从而为肿瘤检测和评估治疗效果提供一个新型检测探针。 【设计思路】 在新型苯并吲哚类荧光探针光稳定好以及肿瘤组织中存在异常旺盛的无氧葡萄糖酵解现象的基础之上,将苯并吲哚类荧光探针对2-脱氧-D-葡萄糖进行标记,设计合成苯并吲哚类荧光标记的葡萄糖类似物,探讨其在肿瘤糖代谢方面的应用。 【实验内容】 拟合成苯并吲哚类荧光标记的葡萄糖类似物,采用NMR、IR光谱及质谱表征苯并吲哚类荧光标记的葡萄糖类似物的化学结构和纯度,测定其理化特性,细胞毒性、生物相容性和体外细胞的荧光成像性能,评价其在活体动物内的光学成像能力,并通过肿瘤组织的免疫荧光病理检查,证实在体内肿瘤组织位置。 【材料】 1,1,2-三甲基-1氢-苯并吲哚,4-甲醛基苯甲酸,无水乙醇和醋酸铵,二氯甲烷,2-脱氧-D-葡萄糖。 【可行性】 前期研究和预实验结果表明苯并吲哚类荧光染料具有良好的光稳定性、合适的水溶性及很好的细胞膜通透性, 而且在细胞内具有较强的荧光。这类染料的合成非常简单, 收率高,基于苯并吲哚类染料的荧光探针,并成功地将其用应用于活细胞荧光成像为本课题核心假设的提出奠定了重要的理论和实验基础。 【创新性】 新型的苯并吲哚类荧光标记的葡萄糖类似物:(1)光稳定性好;(2)可通过葡萄糖靶向介导作用,实现主动靶向介导内吞;(3)能够示踪肿瘤细胞是否发生转移及其治疗效果,是应用于检测动物实验肿瘤转移模型的最佳标记物。     

SIRT3对乳腺癌干细胞衰老影响及机制的研究

【立论依据及设计思路】 乳腺癌干细胞是一类具有较强自我更新能力与分化潜能的癌细胞,在肿瘤形成和复发中起重要作用。衰老是细胞、机体成熟后,随年龄增加,自身结构组分逐步退变、趋向死亡的现象。促进乳腺癌干细胞衰老,可抑制其增殖分化。SIRT3是组蛋白去乙酰化酶之一,可调控干细胞衰老相关基因的表达。有研究显示,SIRT3在乳腺癌干细胞中高表达,但其对乳腺癌干细胞衰老的影响及机制未明。我们猜测SIRT3可通过增强ROS清除酶活性,抑制ROS的蓄积,从而阻碍乳腺癌干细胞衰老。本研究拟在乳腺癌干细胞中沉默、过表达SIRT3,探究SIRT3对乳腺癌干细胞衰老的作用,并利用免疫共沉淀等技术,阐明其中机制。 【实验内容】 (1)体外实验:构建过表达、沉默SIRT3的乳腺癌干细胞稳定细胞系,检测ROS及相关基因的表达量,同时检测细胞衰老状态,利用免疫共沉淀及质谱技术研究其机制;(2)体内实验:过表达、沉默SIRT3的乳腺癌干细胞稳定细胞系体内成瘤,获得成瘤实验标本,检测ROS及相关基因的表达量、细胞衰老状态;(3)临床研究:获取临床乳腺癌样本,研究SIRT3表达量与乳腺癌干细胞数量、乳腺癌患者生存率及生存时间的相关性。 【材料】 临床乳腺癌组织标本、Balb/c裸鼠、乳腺癌细胞系MCF7等。 【可行性】 已有研究证实SIRT3可调控干细胞衰老相关基因;现有研究提示,SIRT3在乳腺癌干细胞中高表达;本小组及所在实验室长期致力于肿瘤干细胞研究,具备相关经验、技术、设备,所以本研究从理论、人员、实验技术、实验条件上都是可行的。 【创新性】 从SIRT3的角度探究乳腺癌干细胞的衰老机制,成果可为防治乳腺癌提供新靶点。     

采用临床超声造影技术结合实时病理检测方法初步筛选肿瘤血管拟态相关诊断参数

【立论依据】 临床研究证实多种肿瘤组织中都存在血管生成拟态(VM),VM在临床上与肿瘤恶性程度、肿瘤血行转移、患者生存期及不良预后密切相关。但是目前在临床上还没有一个针对VM的诊断指标,所以有必要找到一个VM相关的预测性诊断指标,据此判断患者肿瘤的恶性程度及血供模式特点,为药物选择或手术治疗提供诊断依据。 【设计思路】 我们拟通过超声造影或彩色多普勒等医学影像手段判断VM血液灌注特点,并经过统计学相关数据分析筛选其相关参数或参数组合,将其作为VM的临床诊断指标,弥补VM临床诊断的空白。 【实验内容】 本项目借助荷瘤小鼠动物模型,将超声造影与实时病理学切片分析技术结合,从超声造影参数中筛选与VM相关的参数,为确定临床VM的诊断指标提供实验依据。 【材料】 H22瘤源鼠、CD31和PAS免疫组化试剂盒、超声造影剂SonoVue。 【可行性】 本项目组由无锡医学院负责解剖学、生物化学、生理学的老师提供动物实验的技术支持,同时与无锡市人民医院超声医学科共同合作,可以获得超声造影以及部分生化指标检测的技术支持。 【创新性】 本项目旨在寻找一种VM相关的临床影像诊断指标,弥补临床上超声造影诊断肿瘤VM的空白,为肿瘤性质的诊断和选择治疗方案提供新的实验依据。     

17-AAG抑制piRNA-PIWI通路对神经母细胞瘤“干性”影响的研究

【理论依据】 piRNA是细胞内三大非编码RNA(nocodingRNA)之一,参与到干细胞干细胞“干性”的维持之中,同时与PIWI蛋白组成piRNA-PIWI通路,在大量不同类型的肿瘤细胞中高表达。类比miRNA领域取得的研究成果,例如组织工程学应用、抗肿瘤靶点等,探讨piRNA-PIWI通路是否具备相同的应用与靶点价值是本实验设计的核心所在。 【设计思路】 热休克蛋白90(hot shock protein 90)参与了piRNA负载到PIWI蛋白的关键过程,通过使用其抑制剂17-AAG能够间接的抑制piRNA-PIWI通路,同时以神经母细胞瘤的肿瘤干细胞为实验对象,探讨抑制piRNA-PIWI通路对于肿瘤干细胞“干性”的影响 【实验内容】 以小儿最常见的颅外实体瘤神经母细胞为实验对象:(1)神经母细胞瘤干细胞的富集:使用依托泊苷处理肿瘤细胞,进行肿瘤干细胞的富集。(2)实验对象的分组:①维甲酸组作为对照组;②17-AAG组;③RNAi-PIWIL2组。(3)实验检测指标:①PIWIL2 mRNA的检测;②细胞干性的评价:检测相关基因OCT4、SOX2、C-MYC与N-MYC基因的表达,甲基化相关酶(DNMT1、DNMT3)的表达,同时进行形态学观察、细胞凋亡以及细胞周期的监测。③piRNA-PIW通路功能的检测:检测代表性的转座子Line-1、IAP的表达,以及PIWIL2蛋白的表达。 【材料】 神经母细胞瘤细胞系IMR-32、SK-N-SH、SH-SY5Y;HSP90抑制剂17-AAG。 【可行性】 本实验室已在神经母细胞瘤的相关研究中取得研究成果,发表SCI论文,同时本实验的参与团队在校学习期间深入实验室研究过程之中,掌握了一定的实验技能。 【创新性】 探讨使用piRNA-PIWI通路的间接抑制剂17-AAG,从而研究抑制该通路对于神经母细胞瘤干细胞“干性”所造成的影响,为研究靶向抑制piRNA-PIWI通路作为抗肿瘤治疗新靶点奠定理论基础,同时亦为未来开发基于piRNA的组织工程学重编程细胞的新靶点进行前瞻性研究。     

灵芝酸对2型糖尿病肾病大鼠免疫调节作用

【立论依据】 糖尿病肾病已成为终末期肾病的主要原因,其发生、发展与免疫因素密切相关,灵芝酸具有调节免疫等多种药理作用。 【设计思路】 观测2型糖尿病大鼠肾组织形态结构和免疫因子的变化,探讨灵芝酸对2型糖尿病大鼠肾病的干预作用。 【实验内容】 (1)制备糖尿病大鼠模型;(2)检测肾脏内生肌酐清除率(Ccr)和尿白蛋白排泄率(UAER)等指标;(3)察肾组织形态结构;(4)检测肾脏T/B细胞标志分子(CD4和CD8α/β)和效应分子(TNF-α、IFN-γ和TGFβ)的变化。 【材料】 8周龄SD大鼠,随机分为正常对照(A)组,模型(B)组、灵芝酸低浓度(C)组、灵芝酸高浓度(D)组,每组20只。适应性饲养7 d,B、C、D组高脂高糖喂养4周,静脉30 mg/kg注射1%链脲佐菌素(STZ)制备模型,C组灵芝酸3.0 mg/(kg·d)灌胃,D组灵芝酸6.0mg/(kg·d)灌胃,A和B组等体积生理盐水灌胃。20周龄,监测24 h尿量、尿白蛋白及尿肌酐(Ucr)、Ccr和UAER水平;分离血清,测定血糖,血肌酐及尿素氮水平;肾脏称重,计算肾脏指数;H-E,PAS和Masson染色观察肾组织病理变化、肾小球胶原纤维及ECM聚集情况;免疫组化SP法检测TGFβ;应用流式细胞术检测肾脏CD4和CD8α/β;ELISA方法检测TNF-α、IFN-γ和TGFβ。 【可行性】 前期实验结果表明:(1)20周龄时,与A组比较,B组各肾功能指标均表现出显著性差异(P<0.05),出现糖尿病肾病的明显特征;与B组比较,C组和D组各肾功能指标均有显著性差异(P<0.05);(2)与A组比较,B组出现肾小球肥大、纤维化,基底膜增厚等病理改变,肾小球面积及系膜增殖指数明显增大;与B组比较,C组和D组肾脏病变明显减轻,肾小球面积及系膜增殖指数明显降低。 【创新性】 系统研究灵芝酸对对大鼠肾组织保护作用,对临床糖尿病肾病的防护具有理论指导意义。     

新型可显影复合栓塞微球的制备与评价

【立论依据】 我国肝癌发病率高,确诊时多为晚期,而且伴有严重的肝硬化,手术切除率低,迫切需要非手术治疗方法。化疗药物的疗效与肿瘤所在部位药物的有效血浓度及药物与肿瘤接触的时间呈正相关关系。而原发性肿瘤的血液供应90%~95%来自肝动脉,这就为TACE(transcatheterarter arterial chemoembolization)治疗肝癌提供了解剖学基础。肝癌的局部化疗使肝癌组织内药物浓度高出常规给药的10~30倍,全身副作用明显减少,疗效增加。如能与栓塞结合,使肝癌组织缺血,则两者之间有协同作用。因此,TACE是对不能手术切除的肝癌最有效的治疗方法之一。鉴于TACE疗法在现今临床的治疗比重逐步提升,栓塞化疗开始在肝癌治疗中普及,我们认为研发一款成本较为低廉、更宜被人体耐受且能自带显影功能的栓塞微球,能够在肝癌介入治疗的广泛普及中起到重要的作用。 【设计思路】 利用水相油相互不相溶的原理,选取价格低廉的生物医学上常用的胶质明胶和卡拉胶,以油-水-油结构制备可显影复合栓塞微球,并通过原位家兔肝癌模型评价栓塞微球的疗效。 【实验内容】 (1)制备结构为油-水-油/水,对应功能为稳定隔水-塑型载药-显影的两种带有不同显影剂和不同复合水溶胶的三相栓塞微球;(2)体外测定栓塞微球的性能:包括载药率、溶胀率、显影强度、生物利用率以及体外释药曲线;(3)建立原位家兔肝癌模型;(4)进行栓塞微球TACE试验,观察家兔肿瘤变化及存活率,进行体内栓塞微球自然降解时间、释药曲线、家兔对微球排异反应强度等的测定,并根据动物试验情况对栓塞微球的制备条件进行微调整。 【材料】 明胶、卡拉胶、石蜡、乳化剂、交联剂、脱水剂、碘化物显影剂。 【可行性】 (1)前期实验基础:已成功研制出油-水-油相微球,并且进行了多次载药率、溶胀率的测定,并将微球直径筛分成0~200 μm、200~300 μm、300~450 μm、450~1 200 μm四组微球。(2)实验平台:纳米生物纳米材料江苏省重点实验室。 【创新性】 本研究制备的具有自主知识产权新型可显影复合栓塞微球,成本低廉、自备显影功能、为人体可降解材料,具有一定的临床应用前景。     

PTRF介导骨髓间充质干细胞衰老在骨质疏松中的作用及其分子机制

【立论依据及设计思路】 临床上衰老所致的骨质疏松症(OP)没有好的治疗办法,以“干细胞”作为种子细胞的治疗策略为其提供了新的方法。骨髓间充质干细胞(BMSCs)自身衰老可影响其向成骨细胞分化,是衰老所致OP的重要因素。但何种机制参与调控BMSCs 衰老仍不明确。新近研究表明聚合酶Ⅰ转录释放因子(PTRF)介导细胞衰老,但目前暂未见PTRF在BMSCs衰老中作用的报道,我们预实验结果显示PTRF在老龄SD大鼠来源的BMSCs表达偏高。因此提出假说:PTRF可能介导BMSCs衰老在OP中发挥重要的作用,调控PTRF的表达可以通过延缓BSMCs衰老从而抑制OP。为此提出设计思路:(1)明确BMSCs衰老与PTRF有关;(2)证明PTRF介导BMSCs衰老影响成骨分化;(3)在动物模型上验证,输入上调或下调PTRF表达的BMSCs可促进或抑制OP。 【实验内容】 (1)对幼龄及老龄SD大鼠来源BMSCs进行鉴定,比较其PTRF和衰老标志物p21、p53表达以及成骨分化能力;(2)上调或下调PTRF对BMSCs衰老及成骨分化的影响;(3)探讨PTRF是否通过影响成骨分化相关蛋白碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(OPN)的表达从而导致成骨分化异常;(4)在老年性骨质疏松SD大鼠模型上,在体输入上调或下调PTRF的BMSCs,验证其对衰老所致OP的影响。 【材料】 动物:幼龄SD大鼠(5周)、老龄SD大鼠(32周)、雌性SD大鼠(10周);抗体:CD29、CD34、CD44、CD45(用于BMSCs鉴定);PTRF;ALP、OPN等成骨分化相关蛋白抗体;引物:(PTRF、P21、P53);转染相关:PTRF siRNA(慢病毒)、表达载体; 培养相关:成骨培养基;成骨染色试剂:茜素红S。 【可行性】 (1)我们预实验结果显示PTRF在幼龄和老龄SD大鼠来源BMSCs表达存在差异,并且与成骨分化相关。因此本项目的提出具有坚实的实验基础,理论上可行; (2)课题组成员都参与过学校暑期及业余学生科研项目,具有相关实验基础,技术上可行;(3)指导教师从事PTRF相关研究,可提供很好的支持,试剂及设备上可行。 【创新性】 老年化是当今中国社会面临的严重问题,本项目结合干细胞转化研究新进展,从PTRF介导BMSCs衰老影响成骨分化入手,为临床上治疗老年性OP提供一种新的安全有效的靶点。     

天然药物抗肿瘤的全新概念--氧化剂与抗氧化剂的协同作用

【立论依据】 肿瘤与机体免疫系统之间存在着相互作用,肿瘤细胞以多种方式逃逸机体免疫或抑制相关免疫细胞功能。免疫系统抗肿瘤的作用主要是细胞免疫,其中又以T细胞为主,CD4⁺T细胞分泌的细胞因子以及CD8⁺T细胞释放的穿透素等,都具有杀灭肿瘤细胞的作用。但是,不论是CD4或CD8细胞的活化,均需要以树突状细胞(dendritic cells,DC)为代表的抗原提呈细胞的激活。DC细胞的激活,需要有氧化剂的共刺激,适当的氧化应激反应的自由基,帮助T效应细胞的激活,但是过量的自由基反而诱导T细胞的凋亡,即所谓T细胞的氧化筛选过程。因而足量有效的抗氧化剂,保护T细胞的存活,提供存活信号(survival signal),使被DC细胞激活了的特异性杀灭肿瘤的T细胞,得以激活并存活增殖。 【设计思路】 按照工艺流程对芥菜籽的有效成分进行提取,并通过实验进行功能鉴定;在提纯物功能鉴定的基础上,对提纯物进行进一步的配伍;通过二甲基肼(dimethyl hydrazine, DMH)诱导构建wilstar大鼠结直肠癌模型,验证氧化剂和抗氧化剂协同抗肿瘤的概念,探究不同配伍对结直肠肿瘤的预防作用机制。 【实验内容】 (1)芥菜籽有效成分提取;(2)芥菜籽有效成分功能鉴定;(3)对提纯物进行进一步的配伍;(4)DMH诱导构建Wilstar大鼠结直肠癌模型;(5)探究不同配伍对结直肠肿瘤的预防作用机制。 【材料】 Wilstar大鼠、白芥籽、二甲基肼、0.9%NaCl溶液、乙醚、酒精、流式细胞检测试剂盒。 【可行性】 (1)理论层面,肿瘤细胞普遍存在特异性标志物,通过分析白芥子不同组分对免疫应答调控的不同环节作用,发现氧化剂和抗氧化剂对识别和提呈肿瘤细胞特异性抗原,以及激活免疫效应细胞(T细胞等)以期最后杀灭肿瘤细胞,具有重要协同作用。(2)技术层面,已经建立了完整的药物纯化和筛选的技术和装备,其中包括动物模型的建立,现代化免疫指标观察例如多道流式细胞仪方法观察免疫细胞的分类、激活,Luminex大规模检测免疫细胞因子确证免疫系统Th1和Th2漂移,以及病理、免疫组化等手段确定药物效果。(3)人员配置,课题指导教师已经发表前期工作SCI论文2篇、中文相关论文5篇,在抗氧化、抗肿瘤方面的研究有20余年的工作经验,可望能够顺利完成预定工作目标。 【创新性】 本研究的特点是应用现代免疫学研究方法,结合生物化学的基本研究手段,从机制上发现天然药物预防肿瘤的细胞和分子生物学原理。结合肿瘤研究经典模型验证其效果,对实现中医药现代化转变具有重要的理论和临床应用价值。     

MyoD对癌症骨骼肌转移的抑制作用研究

【立论依据】 国内外研究表明:(1)骨骼肌,淋巴管分布广泛,血供丰富,但未有癌症转移到骨骼内生长。(2) MyoD是骨骼肌成肌调节因子,有以下作用:让某些细胞转化为骨骼肌细胞。人工合成高亲和力的MyoD,可与分化抑制因子ID结合,抑制癌细胞增殖。预实验结果显示:骨骼肌细胞因子作用:(1)抑制癌细胞增殖; (2) 使癌细胞的生长形态变为梭状或细长状。 【设计思路】 猜想:MyoD是抑制癌细胞转移到骨骼肌内生长的内源性细胞因子。体外实验:(1)骨骼肌细胞与癌细胞共培养探索骨骼肌细胞对癌细胞的影响。(2)在癌细胞培养基中添加MyoD探索MyoD对癌细胞增殖及迁移能力的影响。(3)构建siRNA靶向沉默MyoD骨骼肌细胞株与癌细胞共培养探索其它细胞因子对癌细胞增殖的影响。体内实验:构建裸鼠肿瘤模型,肿瘤部位注射MyoD MyoD是内源性抑制肿瘤生长的因子。若实验假设不成立,则寻找新的细胞因子,进行新的探索。 【实验内容】 实验组:(1)在癌细胞培养基中添加MyoD。(2)骨骼肌细胞、siRNA靶向沉默骨骼肌细胞与癌细胞共培养24 h。(3)构建裸鼠肿瘤模型,往肿瘤部位注射骨骼肌细胞培养上清液、MyoD。对照组: (1)在癌细胞培养基中添加DMEM。(2)癌细胞与癌细胞共培养24h。 (3)构建裸鼠肿瘤模型,往肿瘤部位注射生理盐水。Brdu测细胞增殖率,流式、WB测蛋白表达,电镜、光学显微镜下观查细胞生长形态以及超微结构,称量体重等观察肿瘤生长。 【材料】 人骨骼肌细胞,人乳腺癌细胞(淋巴转移),人肝癌细胞(血道转移),人鼻咽癌细胞(高转移率),裸鼠。实验采用空隙为0.4 μm的Transwell嵌入式培养板。 【可行性】 本实验理论基础牢靠、前期研究充足,实验设计切合实际。 【创新性】 新思路、新分子,从骨骼肌转移癌低发生率出发,寻找内源性的癌症治疗分子或者靶点。     

MiR-382促进大鼠肝前体细胞WB-F344肝向分化的研究

【立论依据】 肝卵圆细胞的定向分化可为肝细胞移植和生物人工肝提供丰富的肝细胞源。阐明肝卵圆细胞分化的分子机制,是实现控制其定向分化的基础和前提。前期研究显示:miR-382在肝干细胞分化过程中表达上调,提示miR-382可能促进肝干细胞的分化过程。然而,目前对于miR-382在肝干细胞分化中的作用和分子机制仍知之甚少。 【设计思路】 本项目拟利用肝细胞生长因子(HGF)诱导大鼠肝前体细胞WB-F344向肝实质细胞分化的细胞模型,观察miR-382在肝前体细胞WB-F344分化进程中的表达变化,并从功能学和分子标志物两方面检测该microRNA分子对肝卵圆细胞分化的作用,并通过寻找该microRNA分子的靶基因初步明确miR-382调控肝干细胞分化的分子机制。 【实验内容】 (1)建立HGF诱导大鼠肝上皮样干细胞WB-F344肝向分化的细胞模型,并通过糖原染色和肝分化标志物的检测证实该模型的有效性。(2)通过qPCR的方法检测miR-382在整个诱导分化进程中的表达变化。(3)从功能学指标和分子标志物指标两方面检测miR-382过表达或者低表达对WB-F344细胞分化的影响。(4)miR-382通过靶向抑制候选靶基因Ezh2的表达提高肝干细胞的分化能力。 【材料】 大鼠肝前体细胞WB-F344,肝细胞生长因子HGF,Trizol 试剂,Lipofectamine 2000转染试剂,MiR-382 mimics等等。 【可行性】 (1)项目组成员均系统学习了细胞生物学和分子生物学的知识和实验操作技能,对科研有浓厚的兴趣,并已加入指导教师课题组进行科研项目训练。(2)项目指导教师承担的浙江省教育厅课题(Y201330031)包含肝干细胞定向分化的研究,积累了丰富的肝实质细胞诱导分化经验。 【创新性】 (1)本项目首次研究miR-382在肝干细胞分化中的作用,该研究有助于我们认识miR-382的功能。(2)本项目首次提出miR-382通过调控表观遗传修饰酶Ezh2的表达影响染色质修饰状态并参与肝干细胞分化的作用机制,本实验数据将丰富我们对肝干细胞分化过程中表观遗传修饰的认识,具有一定的理论意义。     

纳米二氧化钛诱发氧化应激大鼠肾脏毒性的研究

【立论依据】 纳米二氧化钛(nano-TiO₂)广泛应用于工业、农业、食品、医药等领域,为人们的生产、生活带来便利的同时,其生物安全性也越来越备受关注,是近年来的一个研究热点领域。目前,对TiO₂纳米材料毒性研究多局限于机体健康状态下,而基于机体的疾病状态,尤其是机体氧化应激状态下的纳米材料毒性研究鲜有报道。 【实验内容】 通过肌肉注射四氧嘧啶构建SD大鼠氧化应激模型,通过对健康和氧化应激大鼠进行0.5、5及50 mg/kg体重剂量的TiO₂纳米材料染毒,探讨其对肾脏组织的潜在不良影响。 【材料】 TiO₂纳米材料,四氧嘧啶,尿素氮(BUN)及超氧化物歧化酶(SOD)酶等联免疫吸附试剂盒,雄性SD大鼠,苏木精-伊红(H-E)染料。 【可行性】 前期文献调研扎实。西安医学院的SPF动物实验室,可饲养动物并进行动物实验。指导教师所在的基础医学部基础研究所有石蜡切片机等设备。指导教师从事纳米材料毒性方面的研究,可提供了强有力的技术保障及稳定、可靠的试剂供应。 【创新性】 临床上,糖尿病肾病是糖尿病最严重和最常见的慢性并发症之一,其发病机制比较复杂,但氧化应激在糖尿病肾病的发生、发展中起非常重要作用。但现在关于TiO₂纳米材料对疾病状态(尤其是氧化应激状态)的机体的毒性研究鲜有报道。基于此,本研究利用大鼠氧化应激模型,通过对健康和氧化应激大鼠进行低、中、高剂量TiO₂纳米材料染毒,探讨其对肾脏组织的潜在不良影响,希望能为纳米TiO₂的安全使用及毒性的科学预防提供了可靠参考和实验依据。     

Klotho对脊髓继发性损伤的调节作用及机制研究

【立论依据】 脊髓损伤(SCI)后,病灶区炎症反应、氧化应激、神经细胞凋亡所引起的继发性损伤是创伤后神经功能障碍和影响修复再生的主要原因。已知,Klotho基因缺失鼠(KL-/-)的表型类似人类的衰老表现,包括寿命缩短、动脉硬化、皮肤肌肉萎缩、认知障碍、运动神经元受损、软组织钙化、听力下降、骨质疏松等,但Klotho在中枢神经损伤领域的研究,还知之甚少。 【设计思路】 本项目将发现klotho对脊髓损伤修复的调节作用,明确klotho通过调节氧化应激及细胞凋亡的作用,阐明klotho对中枢神经系统损伤修复的调节机制。 【实验内容】 确立Klotho过表达的脊髓损伤动物模型;评估Klotho促进损伤后运动功能恢复的作用;观察神经组织形态学的改变,评估Klotho对神经胶质瘢痕形成的影响;分析ROS、SOD、8-ohdg等氧化应激及细胞凋亡水平,并筛选其作用靶分子,阐明其作用机制。 【材料】 利用干细胞联合基因治疗手段,将骨髓间充质干细胞(BMSCs)作为基因搭载受体,使其过表达klotho基因,并移植到脊髓损伤大鼠模型。 【可行性】 辽宁医学院神经生物学教研室和辽宁医学院神经退行性疾病实验室(辽宁省重点实验室)一直从事神经系统损伤的基础研究,并熟练掌握各种实验技术和方法,并且拥有研究所需的实验场所和设备,因此对完成本课题具有较强的优势。 【创新性】 揭示Klotho对神经细胞的保护作用机制,为研究脊髓损伤的基础研究和新型神经营养药物的研发,提供基础。     

凋亡抑制蛋白ILP-2对乳腺癌细胞MCF-7氧化应激损伤的保护作用

【立论依据】 文献表明氧化应激会损伤体内核酸等生物大分子物质而促进肿瘤的发生发展;凋亡抑制蛋白ILP-2在生长中的乳腺癌有高表达,由此,我们猜想乳腺癌中高表达的ILP-2可能与氧化应激的损伤作用存在联系 【设计思路】 实验以乳腺癌细胞株MCF-7制备氧化应激的细胞模型,研究氧化应激状态下MCF-7内ILP-2的表达情况;RNAi ilp-2基因表达,分析ILP-2与氧化应激损伤之间的关系 【实验内容】 利用H2O2对乳腺癌细胞株MCF-7进行氧化应激造模,流式细胞术(flow cytometry, FCM)检测细胞内活性氧簇(reactive oxygen species,ROS),分光光度法检测丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)水平;通过瞬时转染敲低MCF-7 ilp-2表达,利用RT-PCR和蛋白质印迹法检测基因和蛋白质表达情况;干扰细胞ilp-2表达并同时进行氧化应激处理,通过MTT、Scratch、FCM等方法检测细胞的存活状态 【材料】 乳腺癌细胞株MCF-7,H2O2,转染试剂,RNeasy Mini Kit,QuantiFast Probe Assay,RIPA 裂解液,一抗,二抗,ROS试剂盒,GSH试剂盒,MDA试剂盒,MTT试剂盒等。 【可行性】 该研究内容所需技术在生物分子研究领域已经非常成熟,所需设备完善,可操作性强 【创新性】 首次研究ILP-2促癌细胞生长作用与氧化应激损伤之间的关系,为进一步阐明ILP-2的作用机制奠定基础。     

磁场下制备的γ-Fe2O3膜对成骨细胞分化作用的效果研究

【目的】 骨质疏松症已成为世界公共卫生问题,针对骨质疏松症的基础及临床研究是目前国际研究的热点。目前已有实验证明PLA/γ-Fe₂O₃复合膜对于细胞的分化具有促进作用,但是由于复合膜是自然晾干的,纳米磁性材料分布不均,对细胞的生长不利,为了将这种材料的性能优化,根据在磁场下,磁性纳米粒子分布更加均匀的特性,通过实验验证在磁场下制备的磁性纳米材料对于细胞分化的促进作用更加明显。 【方法】 因为PLA在复合膜中起到支架和黏附作用,所有本项目将首先在磁场条件下组装纳米材料膜(γ-Fe₂O₃膜),研究其对成骨细胞的影响。利用qPCR、ALP等检测方法对不同组细胞的分化情况进行对比,并分析各项检测结果得出结论。然后进一步在γ-Fe₂O₃膜的基础上用PLA粘附,并对其对于成骨细胞的生长分化的作用进行研究。 【结果】 ALP染色结果:在磁场下制备的纳米磁性材料上接种的细胞染色明显比自然晾干的磁性纳米材料上接种的细胞颜色深且分散;qPCR检测结果:Oc、BMP2、ALP三种成骨细胞标志性基因的qPCR结果显示,在磁场下制备的纳米磁性材料上接种的细胞几种标志性基因含量明显比自然晾干的磁性纳米材料上接种的细胞含量多,且随着磁场强度的增强,基因含量随之增多。 【结论】 自然干的纳米材料+玻片上接种的细胞分化情况明显不如在磁场下组装的纳米基底,而且在不同场强下组装的纳米基底中随着场强增大,细胞分化生长均越来越好。磁场下组装的纳米材料对于细胞分化的促进作用要优于自然晾干的复合膜,且随着场强的增大,促进作用愈加明显。     

Muse细胞体外诱导为神经前体细胞的初步研究

【目的】 从成人骨髓中分离出Muse细胞,体外诱导成神经前体细胞,为细胞移植修复神经系统损伤提供种子细胞。 【方法】 利用密度梯度离心和差速贴壁法从健康成人骨髓中分离、培养骨髓基质干细胞,通过免疫荧光细胞化学技术和流式细胞仪技术对其进行鉴定;体外扩增、传代6次后利用Muse细胞特征性的SSEA-3/CD105分子表型阳性,通过流式细胞仪从骨髓基质干细胞中分选出Muse细胞并进行体外培养,观察其干细胞成球特性;对Muse细胞进行胰蛋白酶孵育,分析其应激耐受能力;利用免疫荧光细胞化学技术和RT-PCR技术检测Muse细胞的多能干细胞标记物表达情况;通过在培养基中添加成纤维细胞生长因子、表皮生长因子等对Muse细胞向神经前体细胞方向进行体外诱导,观察神经前体细胞的干细胞成球情况,利用免疫荧光细胞化学技术和RT-PCR技术对其进行表型鉴定并观察神经前体细胞标记物的表达情况。 【结果】 从成人骨髓中分离出骨髓基质干细胞,免疫荧光细胞化学检测和流式细胞仪检测结果显示CD90表达阳性、CD45和CD11b表达阴性;通过流式细胞仪从骨髓基质干细胞中分选出约0.5%的Muse细胞进行培养,细胞聚集成球,悬浮生长,表现为胰蛋白酶耐受;免疫荧光细胞化学检测和RT-PCR检测结果显示Muse细胞表达多能干细胞标记物Nanog、Oct4、Sox2阳性;体外诱导Muse细胞向神经前体细胞方向分化,观察到细胞成球现象,免疫荧光细胞化学检测和RT-PCR检测结果显示诱导后细胞表达神经前体细胞标记物nestin、βIII-tubulin。 【结论】 从成人骨髓中成功分离出Muse细胞,具有多能干细胞特性,经体外诱导形成神经前体细胞,为以后组织工程移植修复神经损伤提供新的种子细胞。     

血吸虫源性Treg细胞诱导分子的筛选及机制研究

【立论依据及设计思路】 血吸虫病是我国及世界最重要寄生虫病之一,主要因虫卵引起肝脏肉芽肿、纤维化并继发门脉高压症等严重后果,使患者丧失劳动能力、生活自理能力甚至死亡。然而,血吸虫感染后会诱导宿主产生显著的免疫负调控来抑制肝脏病理免疫损害进展,使宿主能存活较长时期,感染呈慢性化。此时,抗体和细胞因子等应答被显著抑制;白喉毒素、BCG等多种疫苗的接种效果被显著削弱;还抑制了由Th1类(如I型糖尿病、克隆性结肠炎等)和Th2类(过敏性哮喘等)应答介导的诸多免疫疾病。迄今,公认血吸虫感染后引起免疫负调控的最重要机制是虫卵抗原诱导了具有免疫抑制力的CD4⁺CD25⁺ Treg细胞,但诱导机制未明。 【实验内容】 为从血吸虫卵中找到可诱导Treg细胞的分子并阐明诱导机制,拟:(1)以两套方案同时初筛:第一方案参照已知可诱导Treg细胞的表位(Treg细胞表位,Tregitope),在虫卵基因库中筛选含有表位最多的分子用于Treg细胞体外诱导实验,选择诱导能力最强者。第二方案参照已知可诱导Treg细胞的分子特点,在虫卵基因库中选择最相似分子用于Treg细胞体外诱导实验,选择诱导能力最强者。(2)将上述两方案中初筛到的分子免疫小鼠,以体内实验复核其对Treg细胞的诱导能力。(3)最终选取一个诱导作用最强的分子,以哮喘或免疫性关节炎小鼠疾病模型进行免疫抑制功能验证(治疗性)实验。(4)初步探索该分子诱导Treg细胞的机制。 【可行性】 (1)已通过生物信息学分析在虫卵基因库中筛选到数个含Tregitope最多的虫卵蛋白分子;(2)已通过生物信息学分析结合体外诱导和小鼠免疫实验筛选到数个可诱导Treg细胞的虫卵蛋白分子。 【创新性】 不仅有助于揭示慢性感染时宿主控制病理免疫损害的机制,还期待从血吸虫卵中找到可用于新型免疫抑制剂研发的具有自主知识产权的分子。