内参基因GAPDH和β-actin在BMP9诱导的骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的表达情况

目的：观察常用内参基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,GAPDH）和β肌动蛋白（β-actin）在骨形态发生蛋白9（bonemorphogeneticproteins9,BMP9）诱导的骨髓间充质干细胞（mesenchymalstemcells,MSCs）成骨分化过程中表达情况,以确定相关研究的内参基因。方法：检测碱性磷酸酶（alkalinephosphatase,ALP）确定BMP9诱导的MSCs（包括C3H10、C2C12和MEF）向成骨分化;以real-timePCR分别检测0、1、3、5、7dGAPDH和β-actin的mRNA表达水平;以Westernblot检测GAPDH和β-actin蛋白。结果：（1）β-actin在BMP9诱导的MSCs成骨分化过程中mRNA表达水平逐渐升高,0d与5dβ-actin的mRNA表达量存在统计学差异（C3H10、C2C12和MEF的P值均为0.000,GAPDH的mRNA表达水平未见明显改变（P＞0.05）;β-actin蛋白表达量随成骨分化逐渐增加,而GAPDH蛋白表达未见明显变化。结论：在BMP9诱导的MSCs成骨分化过程中,GAPDH比β-actin更适合做内参。     

组织工程化骨组织诱导脊柱融合的实验研究

目的：在体外构建一种自体骨组织替代物,回植入体内,以期诱导兔脊柱融合。方法：体外培养兔的骨髓基质干细胞,基因重组工程生产出具有诱骨活性的重组人骨形态发生蛋白-4（recombinant human bone morphogenetic protein-4,rhBMP-4）,采用真空冷冻抽干技术将一定量的rhBMP-4和Ⅰ型胶原结合,构建出一种新的载体,并将一定量的骨髓基质干细胞吸附在载体上。建立兔脊柱关节突融合的动物模型,实验组植入复合rhBMP-4和骨髓基质干细胞的Ⅰ型胶原,对照组只采用Ⅰ型胶原和骨髓基质干细胞,植入兔脊柱的关节突之间来诱导脊柱融合。结果：应用rhBMP-4和Ⅰ型胶原组新骨形成良好,此侧的脊柱融合良好,而对侧无明显的骨组织形成。结论：应用含有骨生长因子、骨前体细胞和胶原载体的复合物是一种较为理想的自体骨组织替代物。     

Notch1在BMP9诱导iMEF细胞成骨分化中的作用

目的 研究Notch信号中Notch1受体在骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic proteins 9,BMP9)诱导的永生化小鼠胚胎成纤维细胞(immortalized mouse embryonic fibroblasts,iMEF)成骨分化中的作用.方法 利用Notch1受体显性负性突变体(dominant negative mutant,dnNotch1)处理iMEF细胞,首先分别采用细胞化学染色、活性测定和RT-PCR了解Notch1对早期成骨指标碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)和晚期成骨指标骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、骨钙素(osteocalcin,OCN)的影响;其次用Western blot、荧光素酶和RT-PCR检测Notch1对BMP9经典信号通路中Smad1/5/8磷酸化和Smad结合元件(smad-binding element,SBE)活性影响;最后用结晶紫染色和流式细胞仪分析其对细胞增殖、周期及凋亡的影响.结果 与对照组相比,dnNotch1处理iMEF第3、5、7天后,ALP活性均降低(P＜0.05),并呈剂量依赖性,11d时OPN和OCN表达量也下调(P＜0.05);BMP9经典通路中Smad1/5/8蛋白量没有明显变化,而p-Smad1/5/8蛋白及SBE活性受到了抑制(P＜0.05);结晶紫染色及流式细胞仪分析结果显示dnNotch1能够抑制BMP9诱导的iMEF早期细胞增殖,但对细胞凋亡无影响.结论 dnNotch1竞争抑制Notch1信号,使BMP9诱导iMEF的成骨分化能力显著下降,其可能通过抑制BMP信号通路的活化和iMEF早期增殖两方面来实现.     

BMP9介导多种干细胞成骨分化的研究进展

骨形态发生蛋白9(BMP9)最早是从胎鼠肝脏互补DNA文库中分离出来的,许多具有不同功能的信号通路在BMP9介导的成骨分化中起重要作用.间充质干细胞(MSCs)是一种能够分化为一系列细胞的多能细胞,也可从多种来源获得,并表现出良好的组织损伤愈合潜力.BMP9在预防异位骨化、防治骨质疏松、减少肥胖及促进牙周组织再生、脂肪...     

兔腰椎融合术中BMP和bFGF对骨髓间充质干细胞的作用

目的评价骨形态发生蛋白(BMP)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导的兔骨髓间充质干细胞(MSC)复合多孔生物陶瓷对提高腰椎融合率的作用。方法将32只家兔随机分为4组(n=8),用下列移植物分别进行腰椎后外侧路融合:Ⅰ组单独应用MSC;Ⅱ组以bFGF作用MSC;Ⅲ组用BMP-2作用MSC;Ⅳ组用BMP-2和bFGF共同作用MSC。实验动物术后6周处死,利用放射学、手工生物力学和组织学方法观察和分析椎体融合的情况。结果影像学和手工力学检测,Ⅳ组椎体融合情况要比其它3组好得多;组织学检测示,在Ⅳ组中,可以看到在融合区周围出现大量的新生成的骨小梁。Ⅱ,Ⅲ组在融合区新生骨小梁较Ⅳ组少,而是新生骨小梁与纤维结缔组织混杂出现;Ⅰ组新生骨小梁显著减少,生物陶瓷微孔内多为纤维结缔组织。结论经BMP和bFGF体外培养的MSC可取得比单独应用MSC更好的融合效果。     

Wnt3a协同BMP9调控间充质干细胞成骨分化及机制研究

目的：探讨经典Wnt信号通路与骨形态发生蛋白9（Bonemorphogeneticprotein9,BMP9）诱导间充质干细胞（Mes－enchymalstemcells,MSCs）成骨的相互影响及分子机制。方法：以小鼠骨髓来源MSCsC3H10T1/2为目的细胞,用Wnt3a上调经典Wnt信号通路,联合BMP9作用于细胞,通过碱性磷酸酶（Alkalinephosphatase,ALP）活性测定、钙盐沉积实验、realtimePCR、免疫细胞化学染色等方法观测BMP9与经典Wnt信号通路联合后对MSCs成骨分化的影响。结果：Wnt3a明显促进了BMP9诱导的ALP活性的增加[F=264.962,P=0.000;t（BMP9+Wnt3a）-BMP9=7.19,P=0.000;t（BMP9+Wnt3a）-Wnt3a=16.36,P=0.000],同时也明显增加了成骨标志物骨钙蛋白（Osteocalcin,OC）[F=3920.102,P=0.000;t（BMP9+Wnt3a）-BMP9=39.10,P=0.000;t（BMP9+Wnt3a）-Wnt3a=62.56,P=0.000]和骨桥蛋白（Osteopontin,OPN）[F=1935.824,P=0.000;t（BMP9+Wnt3a）-BMP9=40.88,P=0.000;t（BMP9+Wnt3a）-Wnt3a=56.42,P=0.000]的表达以及Runx2的mR－NA的表达[F=3635.980,P=0.000;t（BMP9+Wnt3a）-BMP9=79.37,P=0.000;t（BMP9+Wnt3a）-Wnt3a=86.96,P=0.000],并且还促进了钙盐沉积。结论：Wnt3a与BMP9相互协同诱导MSCs的骨向分化,其中成骨转录因子Runx2可能作为二者的交汇点起了重要作用。     

过表达NICD通过下调基因JunB的表达抑制BMP9

目的：研究Notch信号通路在骨形态发生蛋白9（bonemorphogeneticprotein9,BMP9）诱导小鼠间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化过程中的作用及其机制。方法：将细胞分为5组：空白组（Blank,n=3）,BMP9处理组（BMP9,n=3）,空白质粒对照组（BMP9+Control,n=3）,过表达Notch1胞内段质粒（Notch1intracellulardomain,NICD）处理组（BMP9+NICD,n=3）,DAPT处理组（BMP+DAPT,n=3）。通过碱性磷酸酶（alkalinephosphatase,ALP）染色和钙盐染色分别验证过表达NICD对成骨分化早晚期情况的影响。进一步采用定量逆转录PCR（quantitativereal-timepolymerasechainreaction,qRT-RCR）和Westernblot检测基因NICD、Hey1及成骨相关基因Smad-1/5/8、p-Smad-1/5/8、OPN、Runx2、OCN、JunB的表达。结果：早期ALP活性及染色结果显示,NICD组较Control组能显著抑制C3H10T1/2细胞成骨分化过程中ALP的形成[5d：（33167.66±2018.45）vs.（146451.00±14889.67）,P=0.000;7d：（58981.33±4724.70）vs.（89588.66±5928.32）,P=0.000],γ-分泌酶抑制剂（N-[N-（3,5-difluorophen-acetyl）-L-alanyl]-S-phenylglycinet-butylester,DAPT）完全抑制Notch通路时得到相同的结果[5d：（44812.66±4174.94）vs.（146451.00±14889.67）,P=0.000;7d：（64622.93±4724.70）vs.（89588.66±5928.32）,P=0.000]。茜素红S染色结果显示,NCID抑制钙盐结节的形成,而DAPT阻断Notch通路明显促进钙盐结节形成。qRT-PCR结果表明,NCID组中NICD及靶基因Hey1的表达较Control组明显增加[（3.90±0.02）vs.（0.35±0.01）,P=0.000;（19.79±0.01）vs.（11.80±0.02）,P=0.000],Westernblot得到相同结果[（1.32±0.01）vs.（0.19±0.01）,P=0.000],且NICD明显抑制成骨分化相关基因JunB、Runx2、OCN、OPN等的表达[（0.10±0.01）vs.（0.53±0.01）,P=0.000;（0.18±0.01）vs.（0.30±0.02）,P=0.000;（0.36±0.01）vs.（0.62±0.02）,P=0.000;（0.07±0.01）vs.（0.48±0.01）,P=0.000],而转录因子Smad-1/5/8、p-Smad-1/5/8的表达不受影响[（0.74±0.02）vs.（0.73±0.03）,P=0.000;（0.63±0.01）vs.（0.58±0.04）,P=0.000],DAPT阻断Notch通路后上述相关基因的表达明显增加。结论：本实验结果首次证明,NICD激活Notch通路对BMP9诱导的C3H10T1/2细胞成骨分化的抑制作用可能是通过抑制JunB基因发挥作用,而非调控BMP9/Smad（bonemorphogeneticprotein9/drosophilamothersagainstdecapentaplegic）信号通路。     

间充质干细胞和基因治疗在脊柱融合中的应用研究进展

脊柱融合是治疗诸如感染、畸形及退行性变等脊柱疾患的重要方法,促进脊柱融合的关键是骨移植,其中自体骨是评价其他植骨材料的“金标准”.假关节的形成和取骨区的损伤促使科学家和临床医师寻找可以替代的融合材料,细胞治疗和基因治疗被引入脊柱融合的研究,本文就间充质干细胞和基因治疗在脊柱融合中的研究应用作一综述.     

DLL1在骨形态形成蛋白9诱导骨髓间充质干细胞成骨分化中的作用

目的 探讨Notch配体Delta-like1(DLL1)在骨形态形成蛋白9(bone morphogenetic proteins 9,BMP9)诱导的骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)成骨分化中的作用及机制.方法 利用DLL1重组腺病毒上调永生化小鼠胚胎成纤维细胞(immortalized mouse embryonic fibroblasts,iMEF)中DLL1 mRNA的表达,分别采用细胞化学染色、活性测定对早期成骨指标碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)和晚期成骨指标钙盐沉积的影响;其次裸鼠皮下异位成骨实验进一步了解DLL1的体内成骨作用;最后用qRT-PCR、Western blot和荧光素酶检测DLL1对BMP9经典信号通路中Ⅰ型受体、Smad1/5/8磷酸化和Smad结合元件(smad-binding element,SBE)转录活性影响.结果 与对照组相比,DLL1在体外能明显促进BMP9诱导的MSCs早期成骨指标ALP活性和晚期成骨指标钙盐沉积的生成;同时也能明显促进BMP9诱导的MSCs裸鼠皮下异位成骨作用;BMP9信号通路中ALK2表达明显增加,而对ALK1则没有影响;Smad1/5/8蛋白量没有明显变化,而p-Smad1/5/8蛋白及SBE活性明显增加(P＜0.05).结论 DLL1可以促进BMP9诱导的MSCs成骨分化,可能通过影响BMP9信号通路来实现其促成骨作用.     

携带siRbpj重组腺病毒载体的构建及其对BMP9诱导骨髓间充质干细胞成骨分化作用影响

目的：构建并筛选特异性干扰Notch信号通路核转录因子Rbpj基因的重组腺病毒,探讨通过Rbpj的经典Notch信号通路在骨形态发生蛋白（bonemorphogeneticprotein,BMP）9诱导骨髓间充质干细胞（mesenchymalstemcells,ＭＳＣs）成骨分化中的作用。方法：设计3对针对小鼠Rbpj的siRNA序列,将其分别亚克隆至pSES-HUS穿梭质粒,再与骨架质粒pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183内同源重组获得重组质粒,经脂质体转染至HEK293细胞中包装扩增腺病毒,利用RT-PCR及Westernblot进行筛选、验证有效的干扰腺病毒。该重组腺病毒与AdBMP9处理ＭＳＣs细胞株C3H10T1/2,采用组织化学和RT-PCR检测早期成骨指标碱性磷酸酶（alkalinephosphatase,ALP）和晚期成骨指标骨桥蛋白（osteopontin,OPN）,骨钙蛋白（osteocalcin,OCN）及BMP下游靶基因Id1、Runx2等的表达。结果：成功构建了3个重组腺病毒,并筛选出干扰效率最好的AdsiRbpj-2重组腺病毒,转染C3H10T1/2,AdsiRbpj-2可以明显下调BMP9诱导的早期成骨指标ALP的活性及晚期成骨指标OPN、OCN的表达,成骨相关基因Runx2等的表达也有下降。结论：成功构建了特异性阻断Notch经典信号通路腺病毒载体AdsiRbpj-2,该重组腺病毒能够抑制BMP9诱导的C3H10T1/2细胞的成骨分化进程,从而进一步证明Notch信号通路在BMP9诱导的MSCs成骨分化过程中有着重要的作用。     

hBMP-7基因转染对骨髓间充质干细胞增殖和碱性磷酸酶合成的影响

目的探讨逆转录病毒介导的人骨形态发生蛋白7(humanbonemorphogeneticprotein7,hBMP-7)基因转染对兔骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcell,BMSc)增殖和向成骨细胞分化的影响。方法构建hBMP-7逆转录病毒载体,使用含目的基因的病毒液感染BMSc,免疫组织化学方法检测hBMP-7蛋白的表达,MTT法检测细胞增殖能力,使用流式细胞仪检测细胞周期,NPP法检测碱性磷酸酶合成情况。结果经BMP-7基因转染的兔BMSc有hBMP-7的阳性表达,增殖能力无明显改变(P>0.05),但其合成碱性磷酸酶的能力得到显著提高,与空载体病毒液转染、未经转染的BMSc相比差异有显著性(P<0.01)。结论经BMP-7基因转染的BMSc能够表达外源BMP-7,hBMP-7基因转染能够促进体外培养的BMSc向成骨细胞转化,可用于以BMSc为种子细胞的组织工程化骨组织的构建。     

BMP7和EGFP重组腺病毒体外转染兔骨髓间充质干细胞的研究

目的 观测体外培养的兔骨髓间充质干细胞生物学特性,并转染重组腺病毒Ad5-EGFP-BMP7,观察BMP7与EGFP的表达情况.方法 通过密度梯度离心联合贴壁法,分离、纯化间充质干细胞;流式细胞仪检测细胞周期和表面标记;体外诱导间充质干细胞向成骨细胞、成脂肪细胞分化并鉴定.转染后,荧光显微镜及免疫细胞化学染色检测外源基因的表达.结果 原代及传代间充质干细胞为成纤维细胞样细胞;87%以上处于G0/G1期;CD44表达阳性,CD45表达阴性;经成骨细胞诱导后,碱性磷酸酶染色阳性,并有矿化结节形成;经成脂肪细胞诱导后,细胞内出现大量脂滴.转染Ad5-EGFP-BMP7后,荧光显微镜下可见EGFP表达阳性;免疫细胞化学染色显示细胞内BMF7表达阳性.结论 成功分离、纯化间充质干细胞,并鉴定其具有成体干细胞特性;重组腺病毒介导BMP7和EGFP体外成功转染间充质干细胞,并稳定表达BMP7、EGFP,为下一步实验奠定了基础.     

BMP5在乙型肝炎中的表达及其作用

目的 探讨骨形态发生蛋白5在乙型病毒性肝炎中的表达及其作用.方法 分别选择正常对照9例,乙型病毒性肝炎20例,肝硬化22例,原发性肝细胞肝癌28例作为研究对象.应用酶联免疫吸附法测定4组血清中BMP5的浓度.结果 与正常对照组比较,乙型病毒性肝炎组的BMP5浓度升高(195.350 pg/ml vs 137.011 pg/ml,P＜0.05);肝硬化组的BMP5浓度升高(138.830 pg/ml vs 137.011 pg/ml),但差异没有统计学意义(P＞0.05);原发性肝细胞肝癌的BMP5的浓度降低(107.097 pg/ml vs 137.011 pg/ml,P＜0.05).结论 在乙型病毒性肝炎中BMP5表达增加可能是促进肝细胞凋亡的一个因素.     

AP2α在BMP9诱导C3H10成骨分化中的作用及机制探讨

目的：研究转录蛋白2（activatorprotein2,AP2）α在骨形态发生蛋白（bonemorphogeneticprotein,BMP）9诱导小鼠间充质干细胞C3H10成骨分化中的作用及可能的分子机制。方法：重组腺病毒Ad-BMP9感染小鼠C3H10细胞,显性负性突变体AP2α-△bHLH和AP2α-△TAD抑制AP2α转录活性,通过RT-PCR、real-timePCR检测AP2α、BMP9及成骨相关基因的表达水平,Westernblot检测骨桥蛋白（osteopontin,OPN）表达,碱性磷酸酶（alkalinephosphatase,ALP）活性测定、茜红素染色实验观测C3H10成骨分化。结果：BMP9具有强促成骨分化的作用,对AP2α的表达水平无影响,AP2α显性负性突变体可抑制BMP9诱导的成骨基因骨钙蛋白（osteocalcin,OC）、OPN及骨保护素（osteoprotegerin,OPG）表达的增高（OC：F=56.929,P=0.000;OPN：F=54.789,P=0.000;OPG：F=159.451,P=0.000）,ALP活性（F=69.776,P=0.000）及红色钙盐沉积减少。结论：BMP9可能通过影响AP2α的转录活性调控成骨分化进程。     

CTLA4Ig抑制BMP2基因转染的MSCs诱导的免疫应答

目的通过腺病毒介导人细胞毒T淋巴细胞相关抗原4免疫球蛋白(CTLA4Ig)及人骨形态发生蛋白2(BMP2)在骨髓间充质干细胞(MSCs)中的表达,探讨CTLA4Ig对BMP2转染的异基因MSCs诱导的免疫应答的抑制作用。方法以CTLA4Ig和BMP2重组腺病毒转染MSCs。ELISA法检测包装的病毒感染MSCs后,CTLA4Ig及BMP2蛋白的表达;观察CTLA4Ig对混合淋巴细胞反应(MLR)的抑制作用。结果腺病毒载体介导CTLA4Ig和BMP2体外感染的MSCs能够分泌CTLA4Ig及BMP2蛋白,且CTLA4Ig融合蛋白可以有效抑制AdBMP2基因转染的MSCs的刺激作用。结论给予CTLA4Ig腺病毒进行基因治疗可有效的抑制AdBMP2转染的异基因MSCs引起的免疫应答,诱导MSCs移植耐受;为BMP2基因修饰的同种异体间的MSCs移植提供了实验依据。     

CTLA4Ig抑制BMP2基因转染的MSCs诱导的免疫应答

目的 通过腺病毒介导人细胞毒T淋巴细胞相关抗原4免疫球蛋白(CTLA4Ig)及人骨形态发生蛋白2(BMP2)在骨髓间充质干细胞(MSCs)中的表达,探讨CTLA4Ig对BMP2转染的异基因MSCs诱导的免疫应答的抑制作用.方法 以CTLA4Ig和BMP2重组腺病毒转染MSCs.ELISA法检测包装的病毒感染MSCs后,CTLA4Ig及BMP2蛋白的表达;观察CTLA4Ig对混合淋巴细胞反应(MLR)的抑制作用.结果 腺病毒载体介导CTLA4Ig和BMP2体外感染的MSCs能够分泌CTLA4Ig及BMP2蛋白,且CTLA4Ig融合蛋白可以有效抑制AdBMP2基因转染的MSCs的刺激作用.结论 给予CTLA4Ig腺病毒进行基因治疗可有效的抑制AdBMP2转染的异基因MSCs引起的免疫应答,诱导MSCs移植耐受;为BMP2基因修饰的同种异体间的MSCs移植提供了实验依据.     

骨形态发生蛋白转化生长因子在脊柱韧带骨化发生机制中的作用

脊柱韧带骨化症（ossification of the posterior longitudinal ligament，OPLL）是以后纵韧带骨化和黄韧带骨化为代表的临床常见病，其病因及发病机制尚未完全明确。该病发展到一定阶段将导致严重脊髓压迫及神经功能损害的特点，已被人们广泛认识。局部的生长因子对于脊柱韧带骨化的发生发展起着十分重要的作用。而且激素对于韧带骨化的作用也可能受到生长因子的调节。有许多生长因子参与了骨与软骨的发生和生长，其中以转化生长因子超家族成员骨形态发生蛋白（bonemorphogenetioprotein，BMP）和转化生长因子（tansforming growth factor，TGF）对于脊柱韧带骨化最为重要。本文就骨形态发生蛋白转化生长因子在韧带骨化性疾病中的作用作一文献综述。     

自体骨移植及BMP联合自体间充质干细胞治疗兔股骨头坏死

目的 探讨使用自体松质骨及骨形态发生蛋白(BMP)联合自体间充质干细胞治疗兔股骨头坏死的疗效.方法 将自体间充质干细胞(MSC)的体外培养并传至第3代.成年新西兰大白兔60只,做成股骨头坏死病理模型.将动物随机分成3组进行修复,A组使用自体骨髓血液4 ml和BMP(相当植骨量的1/5);B组使用自体间充质干细胞,不使用BMP;C组使用入自体间充质干细胞和BMP.观察各组兔股骨头大体形态、X线检查、力学性质测定和组织学观察等.结果 股骨头外形改变:A组18例有不同程度的股骨头塌陷变形.B组13例有不同程度的股骨头塌陷变形.C组6例有轻度的股骨头塌陷变形.3组间塌陷高度差异有显著性(P＜0.05).股骨头耐受压应力学性质测定C组与A,B组比较差异有显著性(P＜0.05).截面骨小梁体积比值C组与A,B组比较差异有显著性(P＜0.05).结论 利用自体骨松质、BMP联合自体间充质干细胞治疗股骨头坏死实验兔效果良好,为临床使用提供了一定的理论依据.     

骨髓间充质干细胞及其在缺血性脑血管病中的研究进展

骨髓间充质干细胞具有自我更新、多向分化潜能的特点以及在移植过程中取材方便、免疫排斥反应弱等优势,现已成为移植治疗疾病的首选种子细胞之一。缺血性脑血管疾病已成为神经病学研究的热点之一。探索研究骨髓间充质干细胞移植治疗缺血性脑血管病成为新型的治疗手段,本文现对骨髓间充质干细胞生物学特点及其在缺血性脑血管病中的研究进展做一综述。